Summary
Os tumores neuroendócrinos (NETs) são originários de células neuroendócrinas da crista neural. Eles são lentos crescimento e desafiador para a cultura. Nós apresentamos uma estratégia alternativa para crescer redes das entranhas pequenas cultivando as como spheroids. Estes esferoides têm marcadores líquidos das entranhas pequenas e podem ser usados para o teste de droga.
Abstract
Os tumores neuroendócrinos das entranhas pequenas (SBNETs) são os cancros raros que originam das pilhas enterochromaffin do intestino. A pesquisa neste campo foi limitada porque muito poucas linhas de pilha derivadas paciente do SBNET foram geradas. As células SBNET bem diferenciadas são de crescimento lento e são difíceis de propagar. As poucas linhas celulares que foram estabelecidas não estão prontamente disponíveis, e após o tempo na cultura pode não continuar a expressar características de células NET. A geração de novas linhas celulares pode levar muitos anos desde que as células SBNET têm um longo tempo de duplicação e muitas etapas de enriquecimento são necessárias para eliminar os fibroblastos associados ao câncer em rápida divisão. Para superar estas limitações, nós desenvolvemos um protocolo às pilhas de sbnet da cultura dos tumores cirùrgica removidos como esferoides na matriz extracelular (ECM). O ECM forma uma matriz tridimensional que encapsula as células SBNET e imita o microambiente tumoral para permitir que as células da SBNET cresçam. Aqui, nós caracterizamos a taxa de crescimento de esferoides de sbnet e métodos descritos para identificar marcadores de sbnet usando a microscopia da imunofluorescência e immunohistochemistry para confirmar que os esferoides são pilhas neuroendócrinas do tumor. Além, nós usamos esferoides de sbnet para testar a citotoxicidade do Rapamycin.
Introduction
Os tumores neuroendócrinos das entranhas pequenas (SBNETs) originam das pilhas enterochromaffin do intestino pequeno. Embora os sbnets sejam geralmente conhecidos para crescer lentamente, eles comumente metástase para o fígado1. Quando a remoção cirúrgica ou a ablação do tumor puder ser considerada em muitos casos, o retorno é quase universal, e, conseqüentemente, a terapia médica joga um papel importante na gerência. Esforços enormes foram investidos para gerar novas linhas de células SBNET para o teste de drogas. No entanto, houve muito pouco sucesso. Apenas 6 linhas de células sbnet (KRJ-I, CND2, GOT1, P-STS, L-MS, H-STS) foram relatadas2,3,4,5; e, infelizmente, uma linha celular não expressa mais marcadores NET6 e três outras linhas de células sbnet (KRJ-I, L-STS, H-STS) foram determinadas como derivadas de linfoblastos transformados em vez de redes7. A fim de acelerar a identificação de fármacos para a segmentação da SBNETs, são necessários métodos alternativos para o teste in vitro de fármacos.
Aqui, nós aproveitamos a disponibilidade de sbnets resected e estabelecemos uma maneira de cultivar estes sbnets paciente-derivados como esferoides que crescem no ECM. O objetivo geral deste manuscrito é descrever um método para cultura da SBNET como uma cultura tridimensional (3D) e delinear procedimentos para caracterizar esses esferóides para a retenção de marcadores da SBNET por imunofluorescência e imunohistoquímica.
Além, Nós demonstramos como estes esferoides de sbnet podem ser usados testando o efeito do Rapamycin, uma droga anticancerígena para redes8. A fundamentação subjacente a este protocolo é desenvolver um novo método para cultivar as células da SBNET in vitro e utilizá-las para testes de drogas. A vantagem desta técnica sobre o método tradicional de estabelecer uma linha de pilha de SBNET é que as culturas 3D de SBNETs podem ràpida ser obtidas e o teste de droga pode ser feito dentro de 3 semanas. Os esferoides de sbnet poderiam potencialmente ser usados como um modelo para executar telas in vitro da droga para identificar drogas novas para pacientes de sbnet. Uma vez que as linhas de células SBNET não estão amplamente disponíveis, as culturas 3D de esferóides SBNET podem servir como um novo modelo in vitro para estudar SBNETs e podem ser compartilhadas entre cientistas no campo.
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Protocol
Todos os experimentos com amostras de tumores neuroendócrinos humanos foram aprovados pelo Comitê do hospital da Universidade de Iowa e clínicas IRB (protocolo número 199911057). Uma lista de todos os materiais e equipamentos é descrita na tabela de materiais. Uma lista de meios de crescimento e soluções-chave encontra-se na tabela 1.
1. tumor neuroendócrino das entranhas pequenas (SBNET) coleção e dissociação da pilha
- Obtenha amostras de SBNET paciente resected após a confirmação dos tecidos do tumor do núcleo cirúrgico da patologia.
- Corte SBNETs em cubos de 5 mm e armazene em 25 mL de meio DMEM/F12 em um tubo cônico para o transporte para o laboratório.
- Transfira os tumores em DMEM contendo 1% de FBS, 1% de penicilina/estreptomicina (Pen/Strep), 1% de glutamina (meio de lavagem) e incubar neste meio de lavagem por 15 min.
- Transfira tumores para um novo prato e mince tumores para menos de 1 mm peças usando estéril tesoura curvada.
- Transfira os tecidos triturados para um novo tubo de 50 mL contendo 25 mL de meio de lavagem.
- Centrifugue a amostra a 500 x g durante 15 min a 4 ° c.
- Descarte o sobrenadante e ressuspender as pelotas em 10 mL de meio de lavagem contendo colagenase (100 U/mL) e DNase (0,1 mg/mL).
- Permita que a digestão dos tumores triturados ocorra em uma incubadora de 37 ° c com agitação lenta (50 rpm) para 1,5 h.
2. cultura de sbnets como esferoides do tumor no ECM
- Depois que a digestão é terminada (etapa 1,8), Centrifugue em 500 x g por 15 minutos em 4 ° c, descarte o sobrenadante e resuma o pellet em 15 ml de meio de lavagem.
- Coloque um filtro de células de 70 μm em cima de um novo tubo de 50 mL e transfira 10 mL do meio de lavagem sobre o filtro da célula. Gire o meio de lavagem para cobrir o lado do tubo de plástico para evitar que as células líquidas aderem ao lado do tubo de plástico.
- Filtre a suspensão da célula através do filtro de células.
- Centrifugador a 500 x g durante 15 min a 4 ° c, descarte o sobrenadante, Ressuspender o pellet em 200 μL de meio de lavagem (o volume total é de ~ 250 μL) e colocá-lo no gelo.
- Transferir 5 μL de células para 500 μL de meio de lavagem (1/100 factor de diluição). Use as células diluídas para contagem de células usando um hemociômetro para obter o número de células por mililitro. Multiplicar por 100 para corrigir o fator de diluição.
- Multiplique o número de células por mL obtidas na etapa 2,5 pelo volume total de células em suspensão obtidas na etapa 2,4 (~ 250 μL).
- Centrifugar a 500 x g durante 15 min a 4 ° c, descartar o sobrenadante e suspender as células em ECM líquido (1 x 106 células/ml) e manter o gelo.
- Transfira 5-20 μL de esferoides de sbnet no ECM a uma placa de 96 poços e permita que o ECM líquido solidificar coloc a placa em uma incubadora de 37 ° c por 5 minutos.
- Adicionar 200 μL de meio de cultura SBNET (DMEM/F12 + 10% FBS + 1% PEN/STREP + 1% de glutamina + 10 mM de nicotinamida + 10 μg/mL de insulina) a cada poço da placa 96-well contendo os esferóides da SBNET no ECM.
- Alternativamente, os organóides da cultura sbnet em meios da pilha de haste similares a o que foi descrito previamente para crescer o fígado humano ou os organóides pancreatic9 e alistados na tabela dos materiais.
- Mude a mídia a cada 5-7 dias.
3. quantificação do tamanho do esferóide de sbnet usando ImageJ
- Tome 5-10 retratos de esferoides de sbnet no dia 1, 4, 7, 14, 23 e 97 da cultura usando um objetivo 10x.
- Abra imagens salvas no ImageJ. Vá para a guia analisar , selecione a opção definir medições e coloque uma verificação na opção área .
- Use a ferramenta de seleção oval da barra de ferramentas para gerar um elipsóide ou círculo em torno de um spheroid bem focado.
- Vá para a guia Analyze e selecione a opção Measure . Repita as etapas 3,4 e 3,5 a fim começ a medida da área de 25-50 spheroids de SBNET. Os valores são fornecidos em pixel Square.
- Converta a área de pixel para μm2 dividindo o tamanho de cada pixel com o comprimento de cada pixel para o fator de conversão μm das imagens de microscopia.
Nota: as células sbnet crescem principalmente como esferoides e, em algum momento como elipsóides.
4. caracterização de esferóides da SBNETS por imunofluorescência
- Transfira os organóides cultivados em ECM para um tubo de 1,5 mL usando uma pipeta P1000.
- Centrifugue a 1.500 x g durante 1 min e retire o sobrenadante.
- Lave a cultura organóide adicionando 1 mL de PBS, misture, Centrifugue a 1.500 x g durante 1 min e retire o sobrenadante.
- Fixar os organóides adicionando 500 μL de paraformaldeído a 4% e incubar por 15 min.
- Lave a cultura duas vezes com 1 mL de PBS.
- Permeabilize a cultura adicionando 500 μL de PBS + 3% BSA + 0,1% Triton X 100 por 5 min.
- Em seguida, lave por três vezes com 1 mL de PBS + 3% BSA.
- Incubar por 1 h com anticorpos primários contra A Sinaptofisina (SYP)10 a 1/600 de diluição ou cromogranina A (CGA)11 e receptor de SOMATOSTATINA 2 (SSTR2)12 a 1/400 diluição em tampão de anticorpo (2,5% de albumina sérica bovina, 0,1% de sódio azida, 25 mM TRIS pH 7,4, 150 mM cloreto de sódio).
Nota: utilizar 300 μL ou mais de solução de anticorpos por tubo. - Lave três vezes com 1 mL de PBS + 3% de BSA.
- Incubar com anticorpos secundários acoplados a FITC a 1/500 diluição em tampão de anticorpo durante 1 h. utilizar 300 μL ou mais de solução de anticorpos por tubo.
- Lave 3 vezes com 1 mL de PBS + 3% de BSA. Certifique-se de aspirar e descartar todo o sobrenadante.
- Adicionar 5 μL de meio de montagem contendo a mancha nuclear DAPI.
- Use uma pipeta P20 para transferir 5 μL dos esferóides SBNET da etapa 4,12 para um slide de vidro e vedação com um deslizamento de cobertura.
- Tome imagens usando um microscópio fluorescente usando os objetivos 10x, 20x ou 40x.
5. caracterização de esferóides da SBNET por imunoistoquímica (IHC)
- Transfira esferoides sbnet da placa de cultura para um tubo de 1,5 ml usando uma pipeta P1000.
- Centrifugue a 1.500 x g durante 1 min e retire o sobrenadante.
- Fix esferoides sbnet adicionando 500 μL de formalina 10% para o tubo da etapa 5,2 e incubar à temperatura ambiente para 2-5 dias antes da incorporação de parafina e corte 4 μm de espessura esferóide seções.
- Desparaffinize, rehidrate, e use a recuperação calor-induzida do epítopo na solução da recuperação do antígeno em pH 9 aquecendo ao ° c 97 por 20 minutos usando a estação de processamento de corrediça 3-in-1 automatizada para preparar corrediças para a incubação do anticorpo.
- Bloqueie as lâminas e incubar com anticorpos primários contra SYP10 a uma diluição de 1/100 por 15 min, CGA11 a uma diluição de 1/800 por 15 min, e SSTR212 a uma diluição de 1/5000 por 30 min.
- Incubar com o sistema secundário da deteção do anticorpo por 15 minutos para a mancha de anti-SYP e de CgA e 30 minutos para a mancha SSTR2. Tire fotos usando um objetivo 400x.
6. tratamento de organoides da SBNET com rapamicina
- Dissolva a rapamicina no DMSO para obter uma solução de estoque de 10 mM.
- Prepare o meio de cultura SBNET com DMSO (por exemplo, 1 mL de meio de cultura SBNET + 1 μL de DMSO) e meio de cultura SBNET com 10 μM de rapamicina (por exemplo, 1 mL de meio de cultura SBNET + 1 μL de solução de 10 mM de rapamicina).
- Transfira 200 μL de mídia com meio de cultura SBNET com DMSO ou 10 μM de rapamicina para culturas de esferóide SBNET.
- Incubar esferóides SBNET por 5 dias em incubadora de 37 ° c.
- Adicionar 1 μm de etidium homodímero e incubar por 30 min. Retire o meio contendo etidium homodímero, lave com 200 μL de PBS e transfira 200 μL de PBS para cada poço.
- Tome imagens da microscopia de esferoides de sbnet com e sem tratamento da droga usando o cubo vermelho do filtro com os objetivos 10x, 20x, ou 40x de um microscópio fluorescente.
Nota: as células mortas coradas com ethidium homodímero aparecem como vermelhas usando o cubo de filtro vermelho G de um microscópio disponível comercialmente (tabela de materiais). Alternativamente, o sinal pode ser capturado usando um espectrofotômetro em 535 de excitação nm e emissão de 624 nm.
7. rachar esferoides sbnet
Observação: isso é feito para expansão e para compartilhamento com outros pesquisadores.
- Use uma pipeta P1000 para quebrar mecanicamente o ECM e aspirar o ECM com esferoides de sbnet a um tubo estéril de 1,5 ml.
- Centrifugador em 1.000 x g em 4 ° c, remova todo o sobrenadante e coloc o tubo no gelo.
- Adicione 2-4x o volume de ECM novo ao pellet. Misture o ECM novo com os esferoides velhos do ECM e do sbnet pipetando acima e para baixo 10x. Evitando a introdução de bolhas de ar.
- Transfira 5-20 μl do ECM e da mistura dos esferoides de sbnet a uma placa nova e permita que o ECM solidify.
- Cubra com o novo meio SBNET e transfira para a incubadora. A taxa de recuperação é de aproximadamente 95 a 100%.
- Para o envio de esferoides sbnet para outro laboratório, transferir esferoides sbnet com ECM novo para um balão T25 e permitir ECM para solidify.
- Encha o balão T25 com o meio esferóide de sbnet, parafuse na tampa firmemente, e prepare o pacote da expedição.
- Ao receber uma cultura esferóide sbnet, remova o meio de cultura e execute a etapa 7,1 para 7,5 para colocar esferoides sbnet volta na cultura.
8. cryostorage e recuperação de esferoides sbnet
- Transfira esferoides de sbnet de 5-10 poços pequenos a um tubo de 15 ml. Centrifugador em 500 x g por 15 minutos em 4 ° c, remova o sobrenadante, ressuscitem no meio de congelação (90% FBS + 10% DMSO), armazene em um recipiente de congelação da pilha, e coloc este em-80 ° c.
- Transferência para o nitrogênio líquido para maior armazenamento.
- Para recuperar os esferóides da SBNET, coloque o frasco congelado no gelo e aguarde até que o conteúdo seja completamente thawed. Inverta o tubo e reposicione no gelo para acelerar o processo de descongelar.
- Uma vez que a amostra é descongelada, colocada dentro de uma centrífuga pré-refrigerada e girar em 1.000 x g por 10 min.
- Retire o sobrenadante e ressuscitem os esferóides no ECM. Mantenha o tubo no gelo, transfira 20 μL para uma placa nova e aguarde que o ECM se solidifique.
- Transferência 200 μL de meio de cultura SBNET com 10 μM de inibidor de rocha (Y-27632)13 e transferência para a incubadora.
- Permita que os esferoides de sbnet recuperem e cresçam por 1 semana. Retire o meio de cultura antigo, reabasteça com 200 μL de meio de cultura SBNET e retorne à incubadora.
- Permita que os esferoides de sbnet continuem a crescer.
Nota: é preciso pelo menos 1 semana para que os esferóides de crescimento rápido comecem a se recuperar após a criopreservação13. Os esferoides de sbnet tomam um mínimo de 2-4 semanas para começar crescer. Muitas pilhas de SBNET morrerão dentro das primeiras 2 semanas e a taxa de sobrevivência é menos de 10%. Uma vez que este é um processo muito demorado e de baixo rendimento, é melhor compartilhar com outros pesquisadores esferoides sbnet em frascos de cultura (como descrito na etapa 7). Cryostorage e recuperação só deve ser usado como um plano de backup em caso de uma contaminação bacteriana ocorre.
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Representative Results
Existem atualmente apenas 2 linhas de células sbnet estabelecidas e publicadas2,3,4,5 e elas não estão prontamente disponíveis para muitos pesquisadores. Aqui, propomos a cultura sbnet como esferoides em ECM e usar isso como um modelo alternativo para estudar a sensibilidade à droga sbnet. O tumor derivado do paciente de um sbnet que metástase ao fígado foi coletado, digerido para liberar pilhas de sbnet, e misturado com o ECM líquido para estabelecer uma cultura do esferóide de sbnet (Figura 1A). O Ki-67 desta SBNET foi de 4,3%. Embora os esferóides da SBNET tenham uma taxa de crescimento lenta, seu crescimento pode ser monitorado por imagens microscópicas (Figura 1a). Demora aproximadamente 14 dias para os esferoides da sbnet dobram de tamanho quando a mídia de cultura é alterada uma vez por semana (Figura 1B). Após 14 dias na cultura, os esferoides de sbnet não aumentam no tamanho. Em vez disso, algumas células SBNET irão se dissociar para um local vizinho e formar novos spheroids. Para propagar a cultura dos esferoides de sbnet, colha o ECM que contem esferoides de sbnet e RESEED os na placa nova da cultura com meio de cultura novo (etapa 7).
Para confirmar que as culturas organóides contêm células SBNET, descrevemos um método simples e rápido para manchar os esferóides para marcadores SBNET como Sinaptofisina, cromogranina A e o receptor de somatostatina tipo 2 (SSTR2) usando a microscopia de imunofluorescência (IF) ( Passo 4). Usando anticorpos específicos contra Sinaptofisina, cromogranina A e SSTR2, nossos dados de If mostraram que esses marcadores estão localizados no citoplasma e na membrana das células sbnet (Figura 2a, em verde) após 1 ou 9 meses de cultura (Fgráfico 2B ). Para garantir a especificidade dos anticorpos SYP, CGA e SSTR2, realizamos os mesmos procedimentos de coloração em uma linha organoide a partir do tumor do pâncreas que não expressa SYP, CGA ou SSTR2 (Figura 2C) como nenhum sinal verde foi detectado. A principal vantagem deste experimento sbnet esferóide If é que ele pode ser realizado dentro de 4 h e dá informações de coloração semelhantes à imuno-histoquímica (IHC; Figura 3). Nós fornecemos um protocolo para executar o IHC dos esferoides sbnet na etapa 5.
A cultura da SBNET como esferóides é uma técnica valiosa para a identificação de fármacos que podem inibir o crescimento da SBNET. Como uma prova do princípio, nós tratamos esferoides de sbnet com rapamicina por 5 dias, um inibidor de mTOR, uma classe de drogas usadas geralmente para tratar redes8. Em comparação com nosso controle esferóide de sbnet, o esferóide Rapamycin-Tratado formou uma uva-como a estrutura e transformou-se apoptóticas ou Necrotic (Figura 4a-D). Células moribundas podem ser detectadas usando ethidium homodímero para manchar DNA e RNA e gerar um sinal vermelho brilhante14. Este corante não pode penetrar a membrana celular de células ao vivo.
Figura 1: tumores neuroendócrinos das entranhas pequenas derivadas paciente (sbnets) crescidos na matriz extracelular (ECM) como spheroids. (A) isolação de pilhas do tumor de um sbnet resected e põr na cultura misturando com o ECM. A barra de escala representa 100 μm. (B) área de superfície de esferóides sbnet em relação ao número de dias na cultura quantificada usando ImageJ. Os dados foram obtidos de esferóides SBNET de 1 paciente e representados como a área média ± erro padrão da média. A área de superfície de 30 a 60 esferóides foram medidos para cada ponto de tempo. Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 2: coloração de imunofluorescência (if) de ESFERÓIDES sbnet. Se A coloração de sbnet esferoides após (A) 1 mês na cultura e (B) 9 meses na cultura. (C) se a coloração de organóides do tumor do pâncreas que não expressam marcadores de sbnet como controles negativos. Os esferoides do tumor foram fixados em paraformaldeído de 4% e manchados usando anticorpos de encontro ao synaptophysin (SYP) na diluição 1/600, no Chromogranin A (CGA) na diluição 1/400, e no receptor 2 do somatostatina (SSTR2) em 1/400. Se as imagens foram tiradas em 100 ms, 200 MS e 400 MS tempo de exposição para SYP, CgA e SSTR2 coloração, respectivamente, usando os objetivos 10x, 20x ou 40x. A barra de escala representa 50 μm. por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 3: coloração imuno-histoquímica (IHC) de SPHEROIDS sbnet. As seções de esferóides de SBNET fixadas em formalina e parafina foram desparaffinizadas, rehidratadas, bloqueadas e coradas com (A) SYP, (B) CGA e (C) SSTR2 anticorpos. As imagens foram tiradas usando o objetivo 400x. A barra de escala representa 50 μm. por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 4: usando esferoides sbnet para o teste de drogas. (A) imagem de campo brilhante de esferoides de sbnet tratados com o DMSO por 5 dias. (B) imagem de esferóides de sbnet tratados com DMSO e corados com ethidium homodímero (ethidium H). (C) imagem brilhante do campo de um esferóide sbnet inoperante que dá forma à uva-como a estrutura após o tratamento com 10 μm do rapamicina por 5 dias. (D) o esferóide de sbnet inoperante manchado com ethidium H aparece como pontos vermelhos. As imagens de ethidium H que mancham foram feitas exame usando o cubo vermelho do filtro no tempo de exposição de 100 ms. A barra de escala representa 10 μm. por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
| Mídia ou solução de crescimento | Composição |
| Meio de lavagem | DMEM contendo 1% FBS, 1% PEN/STREP, 1% glutamina |
| Meio de cultura SBNET | DMEM/F12 + 10% FBS + 1% PEN/STREP + 1% de glutamina + 10 mM de nicotinamida + 10 μg/mL de insulina |
| Tampão do anticorpo | 2,5% albumina sérica bovina, 0,1% azida sódica, 25 mM TRIS pH 7,4, 150 mM cloreto de sódio |
| Meio de congelação | 90% FBS + 10% DMSO |
| Meio humano da isolação da pilha de haste do fígado | DMEM/F12, 1% Pen/strep, 1% GlutaMAX, 10 mM HEPES, 1/50 B27 suplemento, 1/100 N2 suplemento, 1 mM N-acetilcisteína, 200 ng/mL RSPO 1, 50ng/mL EGF, 100 ng/mL FGF10, 10 mM nicotinamida, 10 uM forskolin, 5uM A83-01 |
| Meio de isolamento de células tronco pancreáticas humanas | DMEM/F12, 1% Pen/strep, 1% GlutaMAX, 10 mM HEPES, 1/50 B27 suplemento, 1/100 N2 suplemento, 1 mM N-acetilcisteína, 200 ng/mL RSPO 1, 25 ng/mL Noggin, 50ng/mL EGF, 100 ng/mL FGF10, 10 mM nicotinamida, 10 uM forskolin, 5uM A83-01, 3 uM PGE-2 |
Tabela 1. Lista de meios de crescimento e solução.
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Discussion
As culturas do tumor 3D tornaram-se um recurso valioso para o teste de droga pré-clínico15. Os vários e biobancos organoid do tumor foram estabelecidos recentemente dos tumores16,17do cancro da mama e de próstata. Neste estudo, nós fornecemos um protocolo detalhado à cultura sbnet como esferoides e um método simples e rápido para validar as culturas do esferóide para marcadores líquidos pela imunofluorescência e pela sensibilidade do teste da droga. De nossa experiência, os esferoides de sbnet podem crescer em vários meios de cultura. Crescem ligeiramente mais rapidamente em meios da pilha de haste para o isolamento humano do pâncreas ou do fígado que nós adaptamos dos protocolos previamente publicados9. Optou-se por cultivar SBNETs em meio DMEM/F12 suplementado com insulina e nicotinamida porque isso é menos dispendioso que os meios de células-tronco. Aumentar a percentagem de soro fetal bovino é outra estratégia para promover o crescimento das culturas organoides da SBNET; no entanto, isso também aumentaria o custo geral para a manutenção da cultura.
SE a coloração de IF e a imagem latente com uma microscopia fluorescente usando os objetivos 10x, 20x ou 40x são um método rápido e simples testar para os marcadores da expressão SBNET. No entanto, não dá uma localização bem definida em comparação com o IHC (Figura 2, Figura 3). Por exemplo, os dados do IF mostraram que a localização da membrana de SSTR2 é difícil de detectar. Nós detectamos principalmente o SSTR2 citosólico, que tem sido relatado previamente18. A fim de obter uma melhor localização das proteínas do marcador, recomendamos o uso de IF e microscopia confocal. Globalmente, se é um método útil para confirmar rapidamente marcadores SBNET. Nossos anticorpos (anti-SYP, anti-CGA, anti-SSTR2) não reagiram com os organóides de controle negativo que não expressam SYP, CGA, ou SSTR2 (Figura 2C) no experimento If. Esta sugestão que os sinais fluorescentes que nós detectamos são específicos aos spheroids de SBNET.
Para aumentar o rendimento de spheroids SBNET, as etapas críticas deste protocolo são durante a etapa da filtração da pilha (etapa 2,2) e misturando o SBNET com o ECM líquido para Aliquotar em placas da cultura do tecido (etapa 2,8). Certifique-se de cobrir a membrana do filtro da pilha e o tubo da coleção com meios a fim impedir que as pilhas de SBNET aderem ao plástico. O ECM líquido solidificar ràpida se não coloc no gelo. Certifique-se de ter um pequeno recipiente de gelo na capa de cultura de tecido, a fim de manter o ECM e SBNET células frias.
A limitação desta técnica é a taxa de crescimento lento dos esferóides SBNET. Experimentos devem ser planejados de forma eficiente e evitar o uso de um excesso de spheroids SBNET. Outra limitação é a recuperação lenta após o congelamento do gelo. Toma sobre 1 mês após descongelamento para que os esferoides de sbnet comecem a crescer. Para superar essa limitação, sugerimos manter continuamente os esferóides SBNET em culturas e dividi-los conforme necessário (etapa 7). Mesmo após 9 meses de cultura, os esferóides da SBNET ainda mantêm a expressão de marcadores da SBNET (Figura 2B).
Embora a cultura 3D de esferoides de sbnet seja mais labor intensiva do que a cultura 2D tradicional de outras linhas de pilha do cancro, é um modelo extremamente valioso para in vitro a cultura de sbnet porque muitos investigadores de sbnet não têm o acesso às linhas de pilha existentes. Com este protocolo, os cientistas e os clínicos podem estabelecer culturas do esferóide de sbnet dos tumores resected e compartilhá-los com outros laboratórios. Além, os esferoides de sbnet poderiam potencialmente ser usados para estabelecer modelos paciente-derivados do rato do xenograft de sbnet. Em geral, as técnicas aqui apresentadas podem ser adaptadas para a cultura, caracterização e realização de testes de drogas de outras redes, como as redes pancreáticas ou pulmonares. Observe que a taxa de crescimento dos organóides variará entre os diferentes tipos de redes e amostras de pacientes.
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Disclosures
Os autores não têm nada a revelar.
Acknowledgments
Este trabalho foi apoiado pelo NIH concede P50 CA174521 (a J.R. Howe e A.M. Bellizzi). P.H. Ear é um receptor do prêmio P50 CA174521 programa de aprimoramento de carreira.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Anti-rabbit FITC | Jackson ImmunoResearch | 11-095-152 | Secondary antibody couple to a green fluorophore |
| Antigen Retrieval Solution | Agilent Dako | S2367 | Solution at pH 9 for preparing slides for IHC |
| Autostainer Link 48 | Agilent Dako | Not Available | Automated system for antibody staining |
| Cell freezing container | Thermo Scientific | 5100-0001 | Container to for freezing cells |
| CellSence | Olympus | Version 1.18 | Computer software for using fluorescent microscope |
| Chromogranin A antibody | Abcam-45179 | RB-9003-PO | Antibodies for IF |
| Chromogranin A antibody (clone LK2H10) | Thermo Scientific | MA5-13096 | Antibodies for IHC |
| Collagenase | Sigma | C0130 | Enzyme for digesting tumor tissue |
| DMEM | Gibco | 11965-092 | Medium for tissue preparation |
| DMEM/F12 | Gibco | 11320-033 | Medium for organoid cultures |
| DMSO | Sigma | D8418 | Solvent for dissolving drug |
| DNAse | Sigma | DN25 | Enzyme for digesting tumor tissue |
| Ethidium Homodimer | Chemodex | CDX-E0012-T1E | DNA and RNA binding dye |
| FBS | Gibco | 16000044 | Reagent for culture media |
| Fluorescent microscope | Olympus | CKX35 | Microscope for taking pictures of SBENT spheroids |
| Glutamine | Gibco | A2916801 | Reagent for culture media |
| ImageJ | National Institutes of Health | Version 1.51 | Computer software for image analysis |
| Insulin | Sigma | I0516 | Reagent for culture media |
| Matrigel | Corning | 356235 | Matrix to embed and anchore organoids |
| Mounting medium (VECTASHIELD) | Vector Laboratories | H-1200 | Fixative for labelled-cells with a nuclear stain |
| Nicotinamide | Sigma | 72340 | Reagent for culture media |
| Paraformaldehyde | Electron Microscopy Sciences | 15710 | Reagent to fix cells |
| PEN/STREP | Gibco | 15140-122 | Reagent for culture media |
| PT Link | Agilent Dako | Not Available | Automated system to prepare slides for IHC staining |
| Rapamycin | Alfa Aesar | J62473 | Drug that can inhibit NET growth |
| Secondary antibodies for IHC | Agilent Dako | K8000 | Secondary antibodies for IHC using Polymer-based EnVision FLEX system |
| SSTR2 antibody | GeneScritp | A01591 | Antibodies for IF |
| SSTR2 antibody (clone UMB1) | Abcam | ab134152 | Antibodies for IHC |
| Synaptophysin antibody | Abcam | 32127 | Antibodies for IF |
| Synaptophysin antibody (clone DAK-SYNAP) | Agilent Dako | M7315 | Antibodies for IHC |
| TritonX | Mallinckrodt | 3555 KBGE | Reagent to permeablize cells |
| Y-2763 ROCK inhibitor | Adipogen | AG-CR1-3564-M005 | To improve SBNET spheroid viability after freeze thaw |
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