Summary
Nöroendokrin tümörler (NeTs) nöral ibik nöroendokrin hücrelerden kaynaklanır. Onlar yavaş büyüyen ve kültüre meydan okuyor. Biz küresel olarak onları culturing tarafından ince bağırsak tan NETs büyümek için alternatif bir strateji salıyoruz. Bu spheroids ince barsak NET belirteçleri var ve ilaç testi için kullanılabilir.
Abstract
İnce barsak nöroendokrin tümörleri (SBNETs) bağırsak enterokromafin hücrelerinden kaynaklanan nadir kanserlerdir. Çok az hasta sbnet hücre hatları üretilmiştir çünkü bu alanda araştırma sınırlı olmuştur. İyi diferansiye SBNET hücreleri yavaş büyür ve yayılması zordur. Kurulan birkaç hücre satırı kolayca kullanılamaz ve kültürde zaman sonra NET hücrelerinin özelliklerini ifade etmeye devam etmeyebilir. SBNET hücrelerinin uzun bir katlama süresine sahip olması ve kanserle ilişkili fibroblastların hızla bölünmesini ortadan kaldırmak için birçok zenginleştirme adımı na ihtiyaç duyulduğundan, yeni hücre hatlarının üretilmesi uzun yıllar sürebilir. Bu sınırlamaları aşmak için, sbnet hücrelerini cerrahi olarak çıkarılan tümörlerden hücre dışı matrikste (ECM) küresel oidler olarak kültüre getirmek için bir protokol geliştirdik. ECM, SBNET hücrelerini kapsülleyen ve SBNET hücrelerinin büyümesine izin verdiği için tümör mikro ortamını taklit eden 3 boyutlu bir matris oluşturur. Burada SBNET spheroidlerinin büyüme hızını karakterize ettik ve sfheroidlerin nöroendokrin tümör hücreleri olduğunu doğrulamak için immünoreskan mikroskobu ve immünohistokimya kullanarak SBNET belirteçlerini tanımlamak için kullanılan yöntemleri tanımladık. Buna ek olarak, rapamisin sitotoksisitesini test etmek için SBNET spheroids kullanılır.
Introduction
İnce barsak nöroendokrin tümörleri (SBNETs) ince bağırsağın enterokromfin hücrelerinden kaynaklanır. SBNETs genellikle yavaş büyümek için bilinen olmasına rağmen, genellikle karaciğer1metastaz . Cerrahi kaldırma veya tümör ablasyon birçok durumda düşünülebilir iken, nüks neredeyse evrensel, ve bu nedenle, tıbbi tedavi yönetiminde önemli bir rol oynar. Uyuşturucu testi için yeni SBNET hücre hatları oluşturmak için muazzam çabalar gösterilmiştir. Ancak, çok az başarı olmuştur. Sadece 6 SBNET hücre hattı (KRJ-I, CND2, GOT1, P-STS, L-STS, H-STS) bildirilmiştir2,3,4,5; ve ne yazık ki bir hücre hattı artık NET belirteçleri6 ve diğer üç SBNET hücre hatları (KRJ-I, L-STS, H-STS) nets yerine dönüştürülmüş lenfoblastlar türetilmiş olduğu tespit edilmiştir ifade eder7. SBNETs hedeflemeiçin ilaçların belirlenmesini hızlandırmak için, in vitro uyuşturucu testi için alternatif yöntemler gereklidir.
Burada, rezeke edilmiş SBNET'lerin kullanılabilirliğinden yararlanıyoruz ve ecm'de büyüyen spheroidler olarak bu hasta kaynaklı SBNET'leri kültüre almanın bir yolunu oluşturduk. Bu makalenin genel amacı, SBNET'in immünororesans boyama ve immünohistokimya ile SBNET belirteçlerinin tutulması için bu küresel leri karakterize etmek için üç boyutlu (3D) bir kültür ve anahat prosedürleri olarak kültüre yönelik bir yöntemi tanımlamaktır.
Buna ek olarak, bu SBNET spheroids rapamycin etkisini test etmek için nasıl kullanılabileceğini göstermek, NETs için bir anti-kanser ilaç8. Bu protokolün arkasındaki mantık, SBNET hücrelerini in vitro olarak büyütmek ve bunları uyuşturucu testi için kullanmak için yeni bir yöntem geliştirmektir. Bu tekniğin geleneksel SBNET hücre hattı oluşturma yöntemine göre avantajı, SBNET'lerin 3Boyutlu kültürlerinin hızla elde edilebiliyor olması ve ilaç testinin 3 hafta içinde yapAbildiğidir. SBNET spheroids potansiyel SBNET hastalar için yeni ilaçlar belirlemek için in vitro ilaç ekranları gerçekleştirmek için bir model olarak kullanılabilir. SBNET hücre hatları yaygın olarak mevcut olmadığından, SBNET spheroids 3D kültürleri SBNETs eğitimi için yeni bir in vitro model olarak hizmet verebilir ve alanında bilim adamları arasında paylaşılabilir.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
İnsan nöroendokrin tümör örnekleri kullanılarak yapılan tüm deneyler Iowa Üniversitesi Hastanesi ve Klinikleri IRB komitesi tarafından onaylanmıştır (Protokol numarası 199911057). Tüm malzeme ve ekipmanların listesi Malzeme Tablosu'ndaaçıklanmıştır. Büyüme ortamı ve anahtar çözümlerlistesi Tablo 1'debulunmaktadır.
1. İnce barsak nöroendokrin tümör (SBNET) toplanması ve hücre bölünmesi
- Cerrahi Patoloji Çekirdeğinden tümör dokuları onayı alındıktan sonra rezeke edilen hasta SBNET örneklerini alın.
- SBNET'leri 5 mm küp şeklinde kesin ve 25 mL DMEM/F12 ortamı içinde konik bir tüp içinde saklayın.
- DMEM'de %1 FBS, %1 penisilin/streptomisin (Pen/Strep), %1 glutamin (Yıkama Ortası) içeren tümörleri ve bu Yıkama Ortamında 15 dakika kuluçkaya yatırın.
- Steril kavisli makas kullanarak tümörleri yeni bir tabağa ve kıyma tümörlerine 1 mm'den daha az parçalara aktarın.
- Kıymalı dokuları 25 mL Yıkama Ortamı içeren yeni bir 50 mL tüpe aktarın.
- Numuneyi 4 °C'de 15 dakika boyunca 500 x g'de santrifüj edin.
- Kollajenaz (100 U/mL) ve DNase (0.1 mg/mL) içeren Yıkama Ortamı'nın 10 mL'lik kısmını süpernatant'ı atın ve tekrar askıya alın.
- Kıymalı tümörlerin sindiriminin 37 °C'lik bir kuluçka makinesinde 1,5 saat boyunca yavaş sallayarak (50 rpm) oluşmasına izin verin.
2. ECM'de tümör küreseloidleri olarak SBNETs Kültürü
- Sindirim tamamlandıktan sonra (adım 1.8), 4 °C'de 15 dakika boyunca 500 x g'de santrifüj, supernatant'ı atın ve 15 mL Yıkama Ortamı'nda peleti yeniden askıya alın.
- Yeni bir 50 mL tüp üstüne 70 μm hücreli süzgeç yerleştirin ve hücre süzgeci üzerinde Yıkama Ortamı 10 mL aktarın. NET hücrelerinin plastik tüpün yan tarafına yapışmasını önlemek için Yıkama Ortamını plastik tüpün yan tarafını kaplayacak şekilde döndürün.
- Hücre süspansiyonuna hücre süzgecinden geçirin.
- 4 °C'de 15 dakika boyunca 500 x g'de santrifüj edin, süpernatantı atın, 200 μL Yıkama Ortamı'nda peleti yeniden askıya alın (toplam hacim ~ 250°L'dir) ve buzun üzerine yerleştirin.
- 5 μL'lik hücreyi Yıkama Ortamının 500°L'sine (1/100 seyreltme faktörü) aktarın. Mililitre başına hücre sayısını elde etmek için bir hemositometre kullanarak hücre sayma için seyreltilmiş hücreleri kullanın. Seyreltme faktörü için düzeltmek için 100 ile çarpın.
- Adım 2.5'te elde edilen mL başına hücre sayısını, 2.4 (~ 250 μL) olarak alınan süspansiyondaki hücrelerin toplam hacmiyle çarpın.
- 4 °C'de 15 dakika boyunca 500 x g'de santrifüj edin, süpernatantı atın ve sıvı ECM (1 x 106 hücre/mL) hücreleri yeniden askıya alın ve buzda tutun.
- ECM'deki SBNET spheroidlerinin 5-20 μL'sini 96 kuyulu bir plakaya aktarın ve sıvı ECM'nin plakayı 37 °C'lik bir kuluçka makinesine koyarak 5 dakika boyunca katılamasını bekleyin.
- ECM'de SBNET sferoidleri içeren 96 kuyulu plakanın her bir kuyusuna 200 μL SBNET kültür ortamı (DMEM/F12 + %10 FBS + %1 PEN/STREP + %1 Glutamin + 10 mM nikotinamid + 10 mL insülin) ekleyin.
- Alternatif olarak, kök hücre medyasında kültür SBNET organoidler daha önce insan karaciğerveya pankreas organoidler9 veya büyüyen için tarif edilmiştir ne benzer ve Malzemeler Tablosu'ndalistelenmiştir.
- Her 5-7 günde bir ortam değiştirin.
3. ImageJ kullanarak SBNET küresel boyutunun ölçülmesi
- 10x hedefi kullanarak kültürün 1, 4, 7, 14, 23 ve 97.
- ImageJ'de kaydedilen görüntüleri açın. Analiz sekmesine gidin, Ölçümleri Ayarla seçeneğini seçin ve Alan seçeneğine bir denetim yerleştirin.
- İyi odaklanmış bir küresel balığın etrafında bir elipsoid veya daire oluşturmak için takım çubuğundan oval seçim aracını kullanın.
- Analiz sekmesine gidin ve Ölçüseçeneğini seçin. 25-50 SBNET spheroids alan ölçümü almak için 3.4 ve 3.5 adımlarını tekrarlayın. Değerler piksel karesinde sağlanır.
- Her pikselin boyutunu her pikselin uzunluğuyla birlikte mikroskop görüntülerinin dönüşüm faktörüne bölerek piksel alanını μm2'ye dönüştürün.
NOT: SBNET hücreleri esas olarak küresel ve bazen elipsoid ler olarak büyür.
4. SBNETS küreseloidlerinin immünoresans ile karakterizasyonu
- ECM'de yetişen organoidleri P1000 pipet kullanarak 1,5 mL'lik bir tüpe aktarın.
- 1 dk için 1.500 x g santrifüj ve supernatant çıkarın.
- 1 dk için 1 mL PBS, mix, santrifüj 1.500 x g ekleyerek organoid kültürü yıkayın ve supernatant çıkarın.
- Organoidleri %4 paraformaldehit 500 μL ekleyerek düzeltin ve 15 dakika kuluçkaya yatırın.
- 1 mL PBS ile kültürü iki kez yıkayın.
- 5 dakika boyunca 500 μL PBS + %3 BSA + %0,1 Triton X 100 ekleyerek kültürü permeabilize edin.
- Daha sonra 1 mL PBS + %3 BSA ile üç kez yıkayın.
- Sinaptophysin (SYP)10 1/600 seyreltme veya kromogranin A (CgA)11 ve somatostatin reseptör 2 (SSTR2)12 1/400 antikor tampon (%2.5 sığır serum albumin, 0.1% sodyum karşı primer antikorlar ile 1 saat için kuluçka azit, 25 mM Tris pH 7.4, 150 mM sodyum klorür).
NOT: Tüp başına 300 μL veya daha fazla antikor çözeltisi kullanın. - 1 mL PBS + %3 BSA ile üç kez yıkayın.
- 1 saat boyunca antikor tamponunda 1/500 seyreltme de FITC ile birleşen ikincil antikorlarla inkübat.
- 1 mL PBS + %3 BSA ile 3 kez yıkayın. Aspire ve tüm supernatant atmak emin olun.
- Nükleer leke DAPI içeren montaj ortamı 5 μL ekleyin.
- SBNET küresel spheroidlerinin 5 μL'sini 4,12 adımdan cam bir kaydırağa aktarmak için P20 pipetini kullanın ve kapak lı bir mühür leyin.
- 10x, 20x veya 40x hedeflerini kullanarak floresan mikroskop kullanarak fotoğraf çekin.
5. SBNET küreseloidler immünohistokimya (IHC) ile karakterizasyonu
- P1000 pipet kullanarak SBNET küreselleri kültür plakasından 1,5 mL'lik bir tüpe aktarın.
- 1 dk için 1.500 x g santrifüj ve supernatant çıkarın.
- SBNET küreselleri adım 5.2'den tüpe %10 formalin ekleyerek düzeltin ve parafin gömmeden 2-5 gün önce oda sıcaklığında kuluçkaya yatırın ve 4 μm kalınlığında küresel kesitler kesin.
- Antikor kuluçkaiçin slaytlar hazırlamak için 3'ü 1 arada otomatik slayt işleme istasyonunu kullanarak pH 9'da Antijen Alma Solüsyonunda ısıya bağlı epitop alma işlemini 20 dk için 97 °C'ye ısıtarak deparafinleştirin, yeniden suitrin ve kullanın.
- 15 dk için 1/100 seyreltme de SYP10 karşı birincil antikorlar ile blok slaytlar ve inkübat, CgA11 15 dakika için 1/800 seyreltme ve SSTR212 30 dakika için 1/5,000 seyreltme.
- Anti-SYP ve CgA boyama için 15 dk ve anti-SSTR2 boyama için 30 dk ikincil antikor algılama sistemi ile inkübat. 400x hedefi kullanarak fotoğraf çekmek.
6. Rapamisin ile SBNET organoidlerinin tedavisi
- 10 mM stok çözeltisi elde etmek için DMSO'da rapamisini eritin.
- DMSO (örneğin, 1 mL SBNET kültür ortamı + 1 μL DMSO) ile SBNET kültür ortamını ve 10 μM rapamisin (örneğin, 1 mL SBNET kültür ortamı + 1 μL 10 mM rapamycin stok çözeltisi) ile SBNET kültür ortamıhazırlayın.
- DMSO veya 10 μM rapamycin içeren SBNET kültür ortamına sahip 200 μL ortamını SBNET küresel kültürlere aktarın.
- 37 °C inkübatörde 5 gün boyunca Kuluçka SBNET spheroids.
- 30 dk. Ethidium homodimer için 1 μM ethidium homodimer ve inkübat ekleyin.
- Floresan mikroskobun 10x, 20x veya 40x hedefleri ile kırmızı filtre küpü kullanarak ilaç tedavisi olan ve olmayan SBNET küreseloidlerinin mikroskopi görüntülerini alın.
NOT: Ethidium homodimer ile boyanmış ölü hücreler, ticari olarak kullanılabilen bir mikroskobun(Malzeme Tablosu)kırmızı filtre küpü G kullanılarak kırmızı olarak görünür. Alternatif olarak, sinyal 535 nm uyarma ve 624 nm emisyon bir spektrofotometre kullanılarak yakalanabilir.
7. SBNET küresellerinin bölünmesi
NOT: Bu genişleme ve diğer araştırmacılar ile paylaşmak için yapılır.
- ECM'yi mekanik olarak kırmak ve SBNET küresel oidlerle ECM'yi steril 1,5 mL'lik bir tüpe aspire etmek için P1000 pipet kullanın.
- 4 °C'de 1.000 x g'de santrifüj, tüm supernatant'ı çıkarın ve tüpü buza yerleştirin.
- Pelete 2-4kat yeni ECM hacmi ekleyin. 10x yukarı ve aşağı boru lama ile eski ECM ve SBNET küresel ile yeni ECM karıştırın. Hava kabarcıkları tanıtan kaçınarak.
- ECM ve SBNET küresel oidkarışımının 5-20 μL'sini yeni bir plakaya aktarın ve ECM'nin katılaşmasını bekleyin.
- Yeni SBNET ortamı ile kaplayın ve kuvöze aktarın. Kurtarma oranı yaklaşık% 95-100'dür.
- SBNET küreselleri başka bir laboratuvara nakletmek için, SBNET küresel leri yeni ECM ile T25 şişesine aktarın ve ECM'nin katılaşmasını bekleyin.
- T25 şişesini SBNET küresel orta ile doldurun, kapağı sıkıca vidalayın ve sevkiyat paketini hazırlayın.
- Bir SBNET küresel kültür aldıktan sonra, kültür ortamını kaldırın ve SBNET küresellerini kültüre geri sokmak için 7.1'den 7.5'e kadar adım atın.
8. SBNET küresellerinin kriyodepolama ve geri kazanımı
- SBNET küreselleri 5-10 küçük kuyudan 15 mL'lik bir tüpe aktarın. 4 °C'de 15 dakika boyunca 500 x g'de santrifüj yapın, süpernatantı çıkarın, dondurucu ortamda yeniden askıya alın (%90 FBS + %10 DMSO), bir hücre dondurma kabında saklayın ve bunu -80 °C'ye yerleştirin.
- Daha uzun depolama için sıvı nitrojene aktarın.
- SBNET küreselleri kurtarmak için donmuş şişeyi buza yerleştirin ve içeriğin tamamen çözülmesini bekleyin. Tüpü ters çevirin ve erime işlemini hızlandırmak için buza yeniden yerleştirin.
- Numune çözüldükten sonra önceden soğutulmuş bir santrifüjün içine yerleştirilir ve 10 dk boyunca 1.000 x g'de döner.
- Supernatant çıkarın ve ECM küresel leri yeniden askıya. Tüpü buzda tutun, 20°L'yi yeni bir plakaya aktarın ve ECM'nin katılaşmasını bekleyin.
- 10 μM ROCK inhibitörü (Y-27632)13 ile SBNET kültür ortamının 200 μL'sini transfer edin ve kuvöze aktarın.
- SBNET küresellerinin 1 hafta boyunca iyileşmesine ve büyümesine izin verin. Eski kültür ortamını çıkarın, 200 μL'lik SBNET kültür ortamıile yenilenin ve kuluçka makinesine geri dönün.
- SBNET küresellerinin büyümeye devam etmesine izin verin.
NOT: Hızla büyüyen küreseloidlerin kriyopreservation13sonra iyileşmeye başlaması için en az 1 hafta sürer. SBNET spheroids büyümeye başlamak için en az 2-4 hafta sürer. Birçok SBNET hücreleri ilk 2 hafta içinde ölecek ve sağkalım oranı% 10'dan azdır. Bu çok zaman alıcı ve düşük verim süreci olduğundan, kültür şişelerinde diğer araştırmacılar SBNET sferoidler ile paylaşmak daha iyidir (adım 7 açıklandığı gibi). Kriyodepolama ve kurtarma sadece bakteriyel kontaminasyon meydana gelmesi durumunda yedek plan olarak kullanılmalıdır.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Şu anda sadece 2 SBNET hücre hatları kurulmuş veyayınlanan 2,3,4,5 ve birçok araştırmacı için hazır değildir. Burada, ECM'de spheroids olarak Kültür SBNET önermek ve SBNET ilaç duyarlılığı çalışma için alternatif bir model olarak kullanabilirsiniz. Karaciğere metastaz yapan bir SBNET'ten elde edilen hasta kaynaklı tümör toplandı, SBNET hücrelerini serbest bırakmak için sindirildi ve SBNET küresel kültür oluşturmak için sıvı ECM ile karıştırıldı (Şekil 1A). Bu SBNET Ki-67% 4.3 idi. SBNET küresellerinin büyüme hızı yavaş olsa da büyümeleri mikroskobik görüntüleme ile izlenebilir(Şekil 1A). SBNET küresellerinin kültür ortamı haftada bir kez değiştirildiğinde iki katına çıkarmaları yaklaşık 14 gün sürer(Şekil 1B). Kültürde 14 gün sonra, SBNET spheroids boyutu artmaz. Bunun yerine, bazı SBNET hücreleri komşu bir konuma ayrışacak ve yeni küresel ler oluşturur. SBNET spheroids kültürünü yaymak için, SBNET spheroids içeren ECM hasat ve yeni kültür ortamı ile yeni kültür plaka onları reseed (Adım 7).
Organoid kültürlerin SBNET hücreleri içerdiğini doğrulamak için, sinaptophysin, kromogranin A ve somatostatin reseptör tip 2 (SSTR2) gibi SBNET belirteçleri için sferoidleri lekelemek için basit ve hızlı bir yöntem tanımlıyoruz . Adım 4). Sinaptofirin, kromogranin A ve SSTR2'ye özgü antikorlar kullanılarak IF verilerimiz, bu belirteçlerin sitoplazmada ve SBNET hücrelerinin zarında(Şekil 2A, yeşil) kültürde 1 veya 9 ay sonra lokalize olduğunu gösterdi (Figure 2B ). SYP, CgA ve SSTR2 antikorlarının özgüllüğünü sağlamak için, yeşil sinyal saptanamadığından pankreas tümöründen organoid hat üzerinde aynı boyama işlemlerini gerçekleştirdik. Bu SBNET spheroid IF deneyinin en büyük avantajı 4 saat içinde yapIlebilen ve immünohistokimya (IHC) gibi benzer boyama bilgileri vermesidir. Şekil 3). 5. adımda SBNET küresellerinin IHC'sinin icrası için bir protokol salıyoruz.
SBNET'in küresel olarak kültüre edilmesi, SBNET büyümesini engelleyen ilaçların tanımlanması nda kullanılan değerli bir tekniktir. İlke kanıtı olarak, biz 5 gün boyunca rapamisin ile SBNET sheroids tedavi, bir mTOR inhibitörü, yaygın NETs tedavisinde kullanılan ilaçların bir sınıf8. Bizim kontrol SBNET spheroid ile karşılaştırıldığında, rapamisin tedavi küresel bir üzüm benzeri bir yapı kurdu ve apoptotik veya nekrotik oldu(Şekil 4A-D). Ölmekte olan hücreler DNA ve RNA leke ve parlak kırmızı sinyal oluşturmak için Ethidium homodimer kullanılarak tespit edilebilir14. Bu boya canlı hücrelerin hücre zarına nüfuz edemez.
Şekil 1: Spheroidolarak hücre dışı matrikste (ECM) yetişen hasta kaynaklı ince barsak nöroendokrin tümörleri (SBNETs). (A) Tümör hücrelerinin rezeke edilmiş bir SBNET'ten izolasyonu ve ECM ile karıştırılarak kültüre sokulması. Ölçek çubuğu, ImageJ kullanılarak ölçülen kültürdeki gün sayısına göre SBNET küresellerinin yüzölçümü 100 μm. (B) Temsil eder. Veriler 1 hastanın SBNET spheroidlerinden elde edilmiş ve ortalamanın ortalama alanı ± standart hatası olarak temsil edilmektedir. Her zaman için 30-60 spheroidin yüzey alanı ölçüldü. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Şekil 2: SBNET küresellerinin immünoresksan (IF) boyama. Eğer SBNET spheroids boyama sonra (A) kültür de 1 ay ve (B) kültür de 9 ay. (C) SBNET belirteçlerini negatif kontrol olarak ifade etmesepankreas tümör organoidlerinin boyanması. Tümör sferoidleri %4 paraformaldehit ile sabitlendi ve 1/600 seyreltmede sinaptophysin (SYP) karşı antikorlar, 1/400 seyreltmede kromogranin A (CgA) ve 1/400'de somatostatin reseptör 2 (SSTR2) ile boyandı. SYP, CgA ve SSTR2 boyama için 100 ms, 200 ms ve 400 ms maruz kalma süresi, sırasıyla 10x, 20x veya 40x hedefleri kullanılarak çekilen si, 200 ms. Ölçek çubuğu 50 μm'yi temsil eder. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Şekil 3: SBNET küresellerinin immünohistokimya (IHC) boyama. Formalin-sabit ve parafin gömülü SBNET spheroids bölümleri deparafinized edildi, rehydrated, bloke ve lekeli (A) SYP, (B) CgA, ve (C) SSTR2 antikorlar. Görüntüler 400x hedefi kullanılarak alınmıştır. Ölçek çubuğu 50 μm'yi temsil eder. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Şekil 4: Uyuşturucu testi için SBNET spheroidlerinin kullanılması. (A) DMSO ile 5 gün boyunca tedavi edilen SBNET küresellerinin parlak alan görüntüsü. (B) DMSO ile tedavi edilen ve Ethidium homodimer (Ethidium H) ile boyanmış SBNET küresellerinin görüntüsü. (C) 5 gün boyunca 10 μM rapamisin ile tedavi den sonra üzüm benzeri bir yapı oluşturan ölü bir SBNET küresel parlak alan görüntüsü. (D) Ethidium H ile boyanmış ölü SBNET küresel oidkırmızı nokta olarak görünür. Ethidium H boyama görüntüleri 100 ms pozlama süresi kırmızı filtre küp kullanılarak alınmıştır. Ölçek çubuğu 10 μm'yi temsil eder. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
| Büyüme ortamı veya çözüm | Kompozisyon |
| Yıkama Orta | %1 FBS, %1 PEN/STREP, %1 Glutamin içeren DMEM |
| SBNET kültür ortamı | DMEM/F12 + %10 FBS + %1 PEN/STREP + %1 Glutamin + 10 mM nikotinamid + 10 μg/mL insülin |
| Antikor tamponu | %2.5 büyükbaş serum albumin, %0.1 sodyum azit, 25 mM Tris pH 7.4, 150 mM sodyum klorür |
| Donma ortamı | %90 FBS + %10 DMSO |
| İnsan karaciğer kök hücre izolasyon u | DMEM/F12 , %1 Kalem/Strep, %1 GlutaMAX, 10 mM HEPES, 1/50 B27 Ek, 1/100 N2 Eki, 1 mM N-asetilsistein, 200 ng/mL Rspo 1, 50ng/mL EGF, 100 ng/mL FGF10, 10 mM nikotinamid, 10 uM forskolin, 5uM A83-01 |
| İnsan pankreas kök hücre izolasyon u | DMEM/F12 , %1 Kalem/Strep, %1 GlutaMAX, 10 mM HEPES, 1/50 B27 Eki, 1/100 N2 Eki, 1 mM N-asetilsistein, 200 ng/mL Rspo 1, 25 ng/mL Noggin, 50ng/mL EGF, 100 ng/mL FGF10, 10 mM nikotinamid, 10 uM forskolin, 5uM A83-01, 3 uM PGE-2 |
Tablo 1. Büyüme ortamı ve çözüm listesi.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Tümör 3D kültürleri preklinik ilaç testi için değerli bir kaynak haline gelmiştir15. Çeşitli tümör organoid biobanks son zamanlarda meme kanseri ve prostat kanseri tümörlerikurulmuştur 16,17. Bu çalışmada, spheroids olarak kültür SBNET için ayrıntılı bir protokol ve immünofloresan ve test ilaç duyarlılığı ile NET belirteçleri için küresel kültürleri doğrulamak için basit ve hızlı bir yöntem sağlar. Deneyimlerimize göre, SBNET spheroids çeşitli kültür medyalarında büyüyebilir. Onlar insan pankreas veya karaciğer izolasyonu için kök hücre medya biraz daha hızlı biz daha önce yayınlanan protokoller9adapte büyümek . DMEM/F12 ortamlarında sbnets insülin ve nikotinamid ile birlikte büyümeyi seçtik çünkü bu kök hücre limediagöre daha ucuzdur. Fetal sığır serumunun yüzdesinin artırılması, SBNET organoid kültürlerin büyümesini teşvik etmek için başka bir stratejidir; ancak, bu da kültür bakım için genel maliyeti artıracak.
10x, 20x veya 40x hedeflerini kullanarak floresan mikroskopi ile IF boyama ve görüntüleme yapmak, SBNET belirteçleri ifadesini test etmek için hızlı ve basit bir yöntemdir. Ancak, IHC'ye göre iyi tanımlanmış bir yerelleştirme vermez (Şekil 2, Şekil 3). Örneğin, IF verileri SSTR2'nin membran yerelleştirilmesinin tespit edilmesinin zor olduğunu göstermiştir. Biz esas olarak daha önce bildirilmiştir sitosolik SSTR2, tespit18. Marker proteinlerin daha iyi lokalizasyonunu elde etmek için IF ve konfokal mikroskopi kullanmanızı öneririz. Genel olarak, IF hızla SBNET işaretleri onaylamak için yararlı bir yöntemdir. Antikorlarımız (anti-SYP, anti-CgA, anti-SSTR2) IF deneyinde SYP, CgA veya SSTR2(Şekil 2C)ifade etmeden negatif kontrol organoidleri ile çapraz reaksiyon alavurmadı. Tespit ettiğimiz floresan sinyallerin SBNET küresellerine özgü olduğu önerisi.
SBNET spheroidlerinin verimini artırmak için, bu protokolün kritik adımları hücre filtrasyon adımı (adım 2.2) ve doku kültür plakaları (adım 2.8) içine aliquoting için sıvı ECM ile SBNET karıştırma sırasında. SBNET hücrelerinin plastiğe yapışmasını önlemek için hücre süzgeci zarını ve toplama tüpünü ortamla kapladığından emin olun. Sıvı ECM buz üzerine yerleştirilmezse hızla katılayacaktır. ECM ve SBNET hücrelerini soğuk tutmak için doku kültüründe küçük bir buz kabı olduğundan emin olun.
Bu tekniğin sınırlamasi SBNET spheroidlerinin yavaş büyüme hızıdır. Deneyler verimli bir şekilde planlanmalı ve aşırı miktarda SBNET spheroids kullanmaktan kaçınılmalıdır. Başka bir sınırlama donma çözülme sonra yavaş kurtarma olduğunu. SBNET küresellerinin büyümeye başlaması için çözülmesi 1 aydan uzun sürer. Bu sınırlamayı aşmak için kültürlerde SBNET küresellerini sürekli olarak korumanızı ve gerektiğinde bölmenizi öneririz (adım 7). Kültürde 9 ay sonra bile, SBNET spheroids hala SBNET belirteçleri ifade korumak(Şekil 2B).
SBNET spheroids 3D kültür diğer kanser hücre hatları geleneksel 2D kültür daha fazla emek yoğun olmasına rağmen, birçok SBNET araştırmacılar mevcut hücre hatları erişimi yok, çünkü SBNET in vitro kültür için son derece değerli bir modeldir. Bu protokol ile bilim adamları ve klinisyenler rezeke tümörlerden SBNET küresel kültürleri oluşturup diğer laboratuvarlarla paylaşabilirler. Buna ek olarak, SBNET spheroids potansiyel SBNET hasta kaynaklı ksenogreft fare modelleri kurmak için kullanılabilir. Genel olarak, burada sunulan teknikler, pankreas veya akciğer NETs gibi diğer NETs kültür, karakterizasyon ve uyuşturucu testi gerçekleştirmek için uyarlanabilir. Organoidlerin büyüme hızı nın farklı NET türleri ile hasta örnekleri arasında farklılık göstereceğini unutmayın.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Yazarların açıklayacak bir şeyi yok.
Acknowledgments
Bu çalışma NIH'nin P50 CA174521 (J.R. Howe ve A.M. Bellizzi'ye) verdiği hibelerle desteklenmiştir. P.H. Ear, P50 CA174521 Kariyer Geliştirme Programı ödülüne layık görülmüştür.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Anti-rabbit FITC | Jackson ImmunoResearch | 11-095-152 | Secondary antibody couple to a green fluorophore |
| Antigen Retrieval Solution | Agilent Dako | S2367 | Solution at pH 9 for preparing slides for IHC |
| Autostainer Link 48 | Agilent Dako | Not Available | Automated system for antibody staining |
| Cell freezing container | Thermo Scientific | 5100-0001 | Container to for freezing cells |
| CellSence | Olympus | Version 1.18 | Computer software for using fluorescent microscope |
| Chromogranin A antibody | Abcam-45179 | RB-9003-PO | Antibodies for IF |
| Chromogranin A antibody (clone LK2H10) | Thermo Scientific | MA5-13096 | Antibodies for IHC |
| Collagenase | Sigma | C0130 | Enzyme for digesting tumor tissue |
| DMEM | Gibco | 11965-092 | Medium for tissue preparation |
| DMEM/F12 | Gibco | 11320-033 | Medium for organoid cultures |
| DMSO | Sigma | D8418 | Solvent for dissolving drug |
| DNAse | Sigma | DN25 | Enzyme for digesting tumor tissue |
| Ethidium Homodimer | Chemodex | CDX-E0012-T1E | DNA and RNA binding dye |
| FBS | Gibco | 16000044 | Reagent for culture media |
| Fluorescent microscope | Olympus | CKX35 | Microscope for taking pictures of SBENT spheroids |
| Glutamine | Gibco | A2916801 | Reagent for culture media |
| ImageJ | National Institutes of Health | Version 1.51 | Computer software for image analysis |
| Insulin | Sigma | I0516 | Reagent for culture media |
| Matrigel | Corning | 356235 | Matrix to embed and anchore organoids |
| Mounting medium (VECTASHIELD) | Vector Laboratories | H-1200 | Fixative for labelled-cells with a nuclear stain |
| Nicotinamide | Sigma | 72340 | Reagent for culture media |
| Paraformaldehyde | Electron Microscopy Sciences | 15710 | Reagent to fix cells |
| PEN/STREP | Gibco | 15140-122 | Reagent for culture media |
| PT Link | Agilent Dako | Not Available | Automated system to prepare slides for IHC staining |
| Rapamycin | Alfa Aesar | J62473 | Drug that can inhibit NET growth |
| Secondary antibodies for IHC | Agilent Dako | K8000 | Secondary antibodies for IHC using Polymer-based EnVision FLEX system |
| SSTR2 antibody | GeneScritp | A01591 | Antibodies for IF |
| SSTR2 antibody (clone UMB1) | Abcam | ab134152 | Antibodies for IHC |
| Synaptophysin antibody | Abcam | 32127 | Antibodies for IF |
| Synaptophysin antibody (clone DAK-SYNAP) | Agilent Dako | M7315 | Antibodies for IHC |
| TritonX | Mallinckrodt | 3555 KBGE | Reagent to permeablize cells |
| Y-2763 ROCK inhibitor | Adipogen | AG-CR1-3564-M005 | To improve SBNET spheroid viability after freeze thaw |
References
- Maxwell, J. E., Sherman, S. K., Howe, J. R. Translational Diagnostics and Therapeutics in Pancreatic Neuroendocrine Tumors. Clinical Cancer Research. 22, 5022-5029 (2016).
- Pfragner, R., et al. Establishment of a continuous cell line from a human carcinoid of the small intestine (KRJ-I). International Journal of Oncology. 8, 513-520 (1996).
- Kolby, L., et al. A transplantable human carcinoid as model for somatostatin receptor-mediated and amine transporter-mediated radionuclide uptake. American Journal of Pathology. 158, 745-755 (2001).
- Van Buren, G., et al. The development and characterization of a human midgut carcinoid cell line. Clinical Cancer Research. 13, 4704-4712 (2007).
- Pfragner, R., et al. Establishment and characterization of three novel cell lines - P-STS, L-STS, H-STS - derived from a human metastatic midgut carcinoid. Anticancer Research. 29, 1951-1961 (2009).
- Ellis, L. M., Samuel, S., Sceusi, E. Varying opinions on the authenticity of a human midgut carcinoid cell line--letter. Clinical Cancer Research. 16, 5365-5366 (2010).
- Hofving, T., et al. The neuroendocrine phenotype, genomic profile and therapeutic sensitivity of GEPNET cell lines. Endocrine Related Cancer. 25, 367-380 (2018).
- Moreno, A., et al. Antitumor activity of rapamycin and octreotide as single agents or in combination in neuroendocrine tumors. Endocrine Related Cancer. 15, 257-266 (2008).
- Broutier, L., et al. Culture and establishment of self-renewing human and mouse adult liver and pancreas 3D organoids and their genetic manipulation. Nature Protocols. 11, 1724-1743 (2016).
- Saito, Y., et al. Establishment of Patient-Derived Organoids and Drug Screening for Biliary Tract Carcinoma. Cell Reports. 27, 1265-1276 (2019).
- Park, S. J., et al. Detection of bone marrow metastases of neuroblastoma with immunohistochemical staining of CD56, chromogranin A, and synaptophysin. Applied Immunohistochemisty and Molecular Morphology. 18, 348-352 (2010).
- Clifton-Bligh, R. J., et al. Improving diagnosis of tumor-induced osteomalacia with Gallium-68 DOTATATE PET/CT. The Journal of Clinical Endocrinology and Metabolism. 98, 687-694 (2013).
- Clinton, J., McWilliams-Koeppen, P. Initiation, Expansion, and Cryopreservation of Human Primary Tissue-Derived Normal and Diseased Organoids in Embedded Three-Dimensional Culture. Current Protocols in Cell Biology. 82, 66 (2019).
- Markovits, J., Roques, B. P., Le Pecq, J. B. Ethidium dimer: a new reagent for the fluorimetric determination of nucleic acids. Analytical Biochemistry. 94, 259-264 (1979).
- Weeber, F., Ooft, S. N., Dijkstra, K. K., Voest, E. E. Tumor Organoids as a Pre-clinical Cancer Model for Drug Discovery. Cell Chemical Biology. 24, 1092-1100 (2017).
- Sachs, N., et al. A Living Biobank of Breast Cancer Organoids Captures Disease Heterogeneity. Cell. 172, 373-386 (2018).
- Puca, L., et al. Patient derived organoids to model rare prostate cancer phenotypes. Nature Communication. 9, 2404 (2018).
- Singh, S. P., et al. SSTR2-based reporters for assessing gene transfer into non-small cell lung cancer: evaluation using an intrathoracic mouse model. Human Gene Therapy. 22, 55-64 (2011).
