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Cancer Research

स्थापना और छोटे आंत्र neuroendocrine ट्यूमर Spheroids की विशेषता

Published: October 14, 2019 doi: 10.3791/60303
Automatic Translation
1, 1, 2, 3, 3, 1
1Department of Surgery, University of Iowa Carver College of Medicine, 2High Throughput Screening Facility, University of Iowa Carver College of Medicine, 3Department of Pathology, University of Iowa Carver College of Medicine

Summary

न्यूरोएंडोक्राइन ट्यूमर (एनटीएस) तंत्रिका शिखर की न्यूरोएंडोक्राइन कोशिकाओं से उत्पन्न होता है। वे धीमी गति से बढ़ रही है और संस्कृति के लिए चुनौतीपूर्ण हैं. हम उन्हें गोलोइड के रूप में culturing द्वारा छोटे आंत्र से NETs विकसित करने के लिए एक वैकल्पिक रणनीति प्रस्तुत करते हैं। इन गोलिभदों छोटे आंत्र नेट मार्करों है और दवा परीक्षण के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है.

Abstract

छोटे आंत्र neuroendocrine ट्यूमर (SBNETs) पेट के आंत्ररोमाफिन कोशिकाओं से उत्पन्न दुर्लभ कैंसर हैं. इस क्षेत्र में अनुसंधान सीमित किया गया है क्योंकि बहुत कम रोगी व्युत्पन्न SBNET सेल लाइनों उत्पन्न किया गया है. अच्छी तरह से अलग SBNET कोशिकाओं धीमी गति से बढ़ रहे हैं और प्रचार करने के लिए कठिन हैं. कुछ कक्ष पंक्तियाँ स्थापित किया गया है जो आसानी से उपलब्ध नहीं हैं, और संस्कृति में समय के बाद NET कक्षों की विशेषताओं को व्यक्त करने के लिए जारी नहीं हो सकता है। नई सेल लाइनों उत्पन्न कई साल लग सकता है के बाद से SBNET कोशिकाओं को एक लंबे समय से दोहरीकरण समय है और कई संवर्धन कदम की जरूरत है ताकि तेजी से विभाजित कैंसर संबद्ध फाइब्रोब्लास्ट को खत्म करने के लिए कर रहे हैं. इन सीमाओं को दूर करने के लिए, हम शल्य चिकित्सा से ट्यूमर को हटा दिया से संस्कृति SBNET कोशिकाओं के लिए एक प्रोटोकॉल विकसित किया है extracellular मैट्रिक्स (ECM) में spheroids के रूप में. ECM एक 3 आयामी मैट्रिक्स कि SBNET कोशिकाओं encapsulates और SBNET कोशिकाओं को विकसित करने के लिए अनुमति देने के लिए ट्यूमर सूक्ष्म पर्यावरण mimics रूपों. यहाँ, हम SBNET spheroids की वृद्धि दर की विशेषता है और यह पुष्टि करने के लिए कि स्फीरोइड न्यूरोएंडोक्राइन ट्यूमर कोशिकाओं रहे हैं प्रतिरक्षा प्रवाह माइक्रोस्कोपी और इम्यूनोहिस्टोकेमिस्ट्री का उपयोग कर SBNET मार्करों की पहचान करने के लिए तरीकों का वर्णन किया। इसके अलावा, हम rapamycin के cytotoxicity के परीक्षण के लिए SBNET spheroids इस्तेमाल किया.

Introduction

छोटी आंत neuroendocrine ट्यूमर (SBNETs) छोटी आंत के आंत्ररोमाफिन कोशिकाओं से उत्पन्न होते हैं। हालांकि SBNETs आम तौर पर धीरे धीरे विकसित करने के लिए जाना जाता है, वे आमतौर पर जिगर1के लिए metastasize. जबकि शल्य चिकित्सा हटाने या ट्यूमर ablation कई मामलों में विचार किया जा सकता है, पुनरावृत्ति लगभग सार्वभौमिक है, और, इसलिए, चिकित्सा चिकित्सा प्रबंधन में एक महत्वपूर्ण भूमिका निभाता है. दवा परीक्षण के लिए नई एसबीनेट सेल लाइनें तैयार करने के लिए जबरदस्त प्रयास किए गए हैं। हालांकि, वहाँ बहुत कम सफलता मिली है. केवल 6 SBNET सेल लाइनों (KRJ-I, CND2, GOT1, पी-एसटीएस, एल-एसटीएस, एच-एसटीएस)2,3,4,5; और दुर्भाग्य से एक सेल लाइन अब नेट मार्करों6 और तीन अन्य SBNET सेल लाइनों (KRJ-I, एल-एसटीएस, एच-एसटीएस) व्यक्त करने के लिए NETs7के बजाय तब्दील लिम्फोब्लास्टसेंस से प्राप्त करने के लिए निर्धारित किया गया था। SBNETs को लक्षित करने के लिए दवाओं की पहचान में तेजी लाने के लिए, इन विट्रो दवा परीक्षण के लिए वैकल्पिक तरीकों की आवश्यकता है।

यहाँ, हम resected SBNETs की उपलब्धता का लाभ लेने के लिए और संस्कृति के लिए एक रास्ता स्थापित किया है इन रोगी व्युत्पन्न SBNETs के रूप में Sheroids ECM में बढ़ रही है. इस पांडुलिपि के समग्र लक्ष्य के लिए एक तीन आयामी (3 डी) संस्कृति के रूप में संस्कृति SBNET के लिए एक विधि का वर्णन है और प्रक्रियाओं की रूपरेखा के लिए इम्यूनोफ्लोरेसीनॉबर स्केलिंग और इम्यूनोहिस्टोकेमिस्ट्री द्वारा SBNET मार्करों के प्रतिधारण के लिए इन spheroids की विशेषता है.

इसके अलावा, हम प्रदर्शन कैसे इन SBNET spheroids rapamycin, NETs8के लिए एक विरोधी कैंसर दवा के प्रभाव के परीक्षण के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है. इस प्रोटोकॉल के पीछे तर्क इन विट्रो में SBNET कोशिकाओं को विकसित करने और उन्हें दवा परीक्षण के लिए उपयोग करने के लिए एक नई विधि विकसित करने के लिए है। एक SBNET सेल लाइन की स्थापना की पारंपरिक विधि पर इस तकनीक का लाभ यह है कि SBNETs के 3 डी संस्कृतियों तेजी से प्राप्त किया जा सकता है और दवा परीक्षण 3 सप्ताह के भीतर किया जा सकता है. SBNET अफ़ीरॉइड ्सवेरा दवा स्क्रीन में प्रदर्शन करने के लिए एक मॉडल के रूप में इस्तेमाल किया जा सकता है SBNET रोगियों के लिए नई दवाओं की पहचान. चूंकि SBNET सेल लाइनों व्यापक रूप से उपलब्ध नहीं हैं, SBNET अफ़ीरॉइड के 3 डी संस्कृतियों SBNETs के अध्ययन के लिए एक नए इन विट्रो मॉडल के रूप में सेवा कर सकते हैं और क्षेत्र में वैज्ञानिकों के बीच साझा किया जा सकता है.

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Protocol

मानव neuroendocrine ट्यूमर के नमूनों का उपयोग कर सभी प्रयोगों आयोवा अस्पताल और क्लीनिक आईआरबी समिति (प्रोटोकॉल संख्या 199911057) द्वारा अनुमोदित किया गया है. सभी सामग्रियों और उपकरणों की सूची का वर्णन सामग्री तालिका में कियागया है। विकास मीडिया और प्रमुख समाधानों की सूची तालिका 1में पाई जाती है।

1. छोटे आंत्र neuroendocrine ट्यूमर (SBNET) संग्रह और सेल वियोजन

  1. सर्जिकल पैथोलॉजी कोर से ट्यूमर के ऊतकों की पुष्टि के बाद resected रोगी SBNET नमूने प्राप्त करें।
  2. BBNETs को 5 मिमी क्यूब्स में काटें और प्रयोगशाला में परिवहन के लिए एक शंकु नली में DMEM/F12 माध्यम के 25 एमएल में स्टोर करें।
  3. 1% एफबीएस, 1% पेनिसिलिन/स्ट्रेप्टोमाइसिन (पेन/स्ट्रेप), 1% ग्लूटामाइन (वॉश मीडियम) और इस वॉश मीडियम में 15 मिनट के लिए इनक्यूबेट युक्त डीएमईएम में ट्यूमर को स्थानांतरित करें।
  4. बाँझ घुमावदार कैंची का उपयोग कर कम से कम 1 मिमी टुकड़े करने के लिए एक नया पकवान और कीमा ट्यूमर के लिए ट्यूमर स्थानांतरण।
  5. कीमा किए गए ऊतकों को 25 एमएल वॉश मीडियम युक्त एक नई 50 एमएल ट्यूब में स्थानांतरित करें।
  6. 4 डिग्री सेल्सियस पर 15 मिनट के लिए 500 x ग्राम पर नमूना सेंट्रीफ्यूज।
  7. सुपरनेंट को त्याग दें और 10 एमएल वॉश मीडियम जिसमें कोलाजनेस (100 यू/एमएल) और डीनेस (0.1 मिलीग्राम/एमएल) के छर्रों को पुन: निलंबित करें।
  8. कीमा बनाया ट्यूमर के पाचन की अनुमति दें 1.5 एच के लिए धीमी गति से मिलाते हुए (50 आरपीएम) के साथ एक 37 डिग्री सेल्सियस इनक्यूबेटर में होने के लिए।

2. ECM में ट्यूमर अफ़ीमके के रूप में SBNETs की संस्कृति

  1. पाचन पूरा होने के बाद (चरण 1.8), 4 डिग्री सेल्सियस पर 15 मिनट के लिए 500 x ग्राम पर अपकेंद्रित्र, supernatant त्याग ें और धो मध्यम के 15 एमएल में गोली resuspend.
  2. एक नई 50 एमएल ट्यूब के शीर्ष पर एक 70 डिग्री मीटर सेल छलनी प्लेस और सेल छलनी पर धो मध्यम के 10 एमएल हस्तांतरण. प्लास्टिक ट्यूब के पक्ष को कवर करने के लिए वॉश मीडियम घुमाएं ताकि नेट कोशिकाओं को प्लास्टिक ट्यूब के किनारे से चिपके रहने से रोका जा सके।
  3. सेल छलनी के माध्यम से सेल निलंबन फ़िल्टर करें।
  4. 4 डिग्री सेल्सियस पर 15 मिनट के लिए 500 x ग्राम पर सेंट्रीफ्यूज, सुपरनेंट को त्यागें, वॉश मीडियम के 200 डिग्री एल में गोली को फिर से चालू करें (कुल आयतन $ 250 डिग्री सेल्सियस है) और इसे बर्फ पर रखें।
  5. 5 डिग्री कोशिकाओं को 500 डिग्री सेल्सियस वॉश मीडियम (1/100 कमजोर पड़ने कारक) में स्थानांतरित करें। प्रति मिलीलीटर कोशिकाओं की संख्या प्राप्त करने के लिए हेमोसाइटोमीटर का उपयोग करके सेल काउंटिंग के लिए पतला कोशिकाओं का उपयोग करें। कमजोर पड़ने कारक के लिए सही करने के लिए 100 से गुणा।
  6. चरण 2.5 में प्राप्त कोशिकाओं की कुल मात्रा से चरण 2ण्5 में प्राप्त कोशिकाओं की संख्या को चरण 2ण्4 ($ 250 L) में प्राप्त निलंबन में गुणा करें।
  7. 4 डिग्री सेल्सियस पर 15 मिनट के लिए 500 x ग्राम पर सेंट्रीफ्यूज, supernatant त्यागें, और तरल ECM में कोशिकाओं को फिर से निलंबित (1 x 106 कोशिकाओं /
  8. ईसीएम में एसबीनेट स्फीरोइड्स के 5-20 डिग्री सेल्सियस को 96-वेल प्लेट में स्थानांतरित करें और 5 मिनट के लिए 37 डिग्री सेल्सियस इनक्यूबेटर में प्लेट को रखकर प्लेट को ठोस करने की अनुमति दें।
  9. SBNET संस्कृति माध्यम के 200 डिग्री एल जोड़ें (DMEM/F12 + 10% FBS + 1% PEN/STREP + 1% Glutamine + 10 m Nicotinamide + 10 $g/mL इंसुलिन) 96-अच्छी तरह से ईसीएम में SBNET spheroids युक्त प्लेट के प्रत्येक के लिए जोड़ें.
  10. वैकल्पिक रूप से, स्टेम सेल मीडिया में संस्कृति SBNET organoids क्या पहले या तो मानव जिगर या अग्नाशय organoids9 बढ़ रही है और सामग्री की तालिकामें सूचीबद्ध के लिए वर्णित किया गया है के समान है.
  11. हर 5-7 दिन में मीडिया बदलें.

3. ImageJ का उपयोग कर SBNET अफ़ीरॉइड आकार का परिमाणीकरण

  1. एक 10x उद्देश्य का उपयोग कर संस्कृति के दिन 1, 4, 7, 14, 23 और 97 में SBNET spheroids के 5-10 तस्वीरें ले लो.
  2. ImageJ में सहेजी गई छवियाँ खोलें. विश्लेषण टैब पर जाएँ, मापन सेट करें विकल्प का चयन करें और क्षेत्र विकल्प पर एक चेक रखें.
  3. एक अच्छी तरह से केंद्रित गोलभॉइड के चारों ओर एक दीर्घवृत्तयाभ या वृत्त उत्पन्न करने के लिए उपकरण पट्टी से अंडाकार चयन उपकरण का उपयोग करें।
  4. विश्लेषण टैब पर जाएँ और उपाय विकल्प का चयन करें. 25-50 SBNET स्रूपीय से क्षेत्र माप प्राप्त करने के लिए चरण 3.4 और 3.5 दोहराएँ। मान पिक्सेल वर्ग में प्रदान की जाती हैं.
  5. पिक्सेल क्षेत्र को माइक्रोस्कोपी छवियों के $m रूपांतरण कारक में प्रत्येक पिक्सेल की लंबाई के साथ विभाजित करके पिक्सेल क्षेत्र को $m2 में कनवर्ट करें।
    नोट: SBNET कोशिकाओं को मुख्य रूप से गोलिकेश के रूप में और कुछ समय दीर्घवृत्तकेश के रूप में विकसित।

4. इम्यूनोफ्लोरेसेंस द्वारा SBNETS अफ़ीरॉइड्स की विशेषता

  1. ECM में उगाए गए organoids एक 1.5 एमएल ट्यूब के लिए एक P1000 पिपेट का उपयोग स्थानांतरण.
  2. 1 मिनट के लिए 1,500 x ग्राम पर सेंट्रीफ्यूज और supernatant हटा दें।
  3. 1 एमएल पीबीएस जोड़कर ऑर्गनॉइड कल्चर को धोएं, 1 मिनट के लिए 1,500 x ग्राम पर सेंट्रीफ्यूज मिलाएं और सुपरनेंट को हटा दें।
  4. 15 मिनट के लिए 4% पैराफॉर्मेल्डिहाइड और इनक्यूबेट के 500 डिग्री सेल्सियस जोड़कर ऑर्गनॉइड्स को ठीक करें।
  5. पीबीएस के 1 एमएल के साथ दो बार संस्कृति धो लें।
  6. पीबीएस के 500 $L जोड़कर संस्कृति permebilize + 3% बीएसए + 0.1% Triton एक्स 100 के लिए 5 मिनट.
  7. फिर पीबीएस + 3% बीएसए के 1 एमएल के साथ तीन बार के लिए धो लें।
  8. सिनैप्टोफिसिन (एसवाईपी) के खिलाफ प्राथमिक एंटीबॉडी के साथ 1 एच के लिए इन्क्यूबेट 1/600 कमजोर पड़ने या क्रोमोग्रेनिन ए (सीजीए)11 और सोमेटोस्टेटिन रिसेप्टर 2 (SSTR2)12 पर एंटीबॉडी बफर में 1/400 कमजोर पड़ने (2.5% गोवाइन सीरम एल्बुमिन, 0.1% सोडियम azide, 25 m M Tris पीएच 7.4, 150 एमएम सोडियम क्लोराइड).
    नोट: ट्यूब प्रति एंटीबॉडी समाधान के 300 $L या अधिक का उपयोग करें।
  9. पीबीएस + 3% बीएसए के 1 एमएल के साथ तीन बार धो लें।
  10. 1 ज के लिए एंटीबॉडी बफर में 1/500 कमजोर पड़ने पर FITC के लिए युग्मित द्वितीयक एंटीबॉडी के साथ इनक्यूबेट करें। प्रति ट्यूब 300 डिग्री सेल्सियस या अधिक एंटीबॉडी समाधान का उपयोग करें।
  11. पीबीएस + 3% बीएसए के 1 एमएल के साथ 3 बार धोएं। सभी सुपरनेंट को त्यागना सुनिश्चित करें।
  12. परमाणु दाग DAPI युक्त मध्यम बढ़ते के 5 डिग्री एल जोड़ें.
  13. SBNET स्फीरॉइड्स के 5 डिग्री एल को चरण 4.12 से एक ग्लास स्लाइड में स्थानांतरित करने और कवर स्लिप के साथ सील करने के लिए P20 पिपेट का उपयोग करें।
  14. 10x, 20x या 40x उद्देश्यों का उपयोग कर एक फ्लोरोसेंट माइक्रोस्कोप का उपयोग कर छवियों ले लो.

5. SBNET अफ़ीरॉइड्स इम्यूनोहिस्टोकेमिस्ट्री (आईएचसी) द्वारा विशेषता

  1. एक P1000 पिपेट का उपयोग करके एक 1.5 एमएल ट्यूब के लिए संस्कृति प्लेट से SBNET गोलियों स्थानांतरण।
  2. 1 मिनट के लिए 1,500 x ग्राम पर सेंट्रीफ्यूज और supernatant हटा दें।
  3. चरण 5.2 से ट्यूब के लिए 10% फॉर्मेलिन के 500 डिग्री एल जोड़कर SBNET स्फीरॉइडको ठीक करें और पैराफिन एम्बेडकरने से पहले 2-5 दिनों के लिए कमरे के तापमान पर इनक्यूबेट करें और 4 डिग्री मीटर मोटी स्फीरॉइड वर्गों को काट ें।
  4. एंटीबॉडी ऊष्मायन के लिए स्लाइड तैयार करने के लिए 3-इन-1 स्वचालित स्लाइड प्रोसेसिंग स्टेशन का उपयोग करते हुए 20 मिनट के लिए 97 डिग्री सेल्सियस को गर्म करके पीएच 9 में एंटीजन रिट्रीवल रिट्रीवल में हीट-प्रेरित एपिटोप रिट्रीवल रिट्रीवल में अपर्णाीकृत, पुनः हाइड्रेट, और उपयोग करें।
  5. ब्लॉक स्लाइड और SYP10 के खिलाफ प्राथमिक एंटीबॉडी के साथ 15 मिनट के लिए एक 1/100 कमजोर पड़ने पर, CgA11 15 मिनट के लिए एक 1/800 कमजोर पड़ने पर, और SSTR212 पर एक 1/5,000 30 मिनट के लिए कमजोर पड़ने.
  6. विरोधी SYP और CgA धुंधला और विरोधी SSTR2 धुंधला के लिए 30 मिनट के लिए 15 मिनट के लिए माध्यमिक एंटीबॉडी का पता लगाने प्रणाली के साथ इनक्यूबेट. एक 400x उद्देश्य का उपयोग कर तस्वीरें ले लो.

6. rapamycin के साथ SBNET organoids का उपचार

  1. एक 10 एमएम स्टॉक समाधान प्राप्त करने के लिए DMSO में rapamycin भंग.
  2. DMSO के साथ SBNET संस्कृति माध्यम तैयार (उदा., SBNET संस्कृति माध्यम के 1 एमएल + DMSO के 1 $L) और Rapamycin के 10 $M के साथ SBNET संस्कृति माध्यम (उदा., SBNET संस्कृति मध्यम के 1 एमएल + 10 m rapamycin स्टॉक समाधान के 1 $L).
  3. DMSO या SBNET अफ़ीमसंस्कृत संस्कृतियों के लिए 10 डिग्री एम rapamycin के साथ SBNET संस्कृति माध्यम के साथ 200 जेडएल मीडिया स्थानांतरण।
  4. 37 डिग्री सेल्सियस इनक्यूबेटर में 5 दिनों के लिए एसबीनेट स्काइरोइड्स इनक्यूबेट करें।
  5. 30 मिनट के लिए इथिडियम होमोडाइमर और इनक्यूबेट का 1 $M जोड़ें। एथिडियम होमोडाइमर युक्त माध्यम को निकालें, पीबीएस के 200 डिग्री सेल्सियस से धोएं, और पीबीएस के 200 डिग्री सेल्सियस को अच्छी तरह से स्थानांतरित करें।
  6. 10x, 20x, या एक फ्लोरोसेंट माइक्रोस्कोप के 40x उद्देश्यों के साथ लाल फिल्टर घन का उपयोग कर दवा उपचार के साथ और बिना SBNET spheroids के माइक्रोस्कोपी छवियों ले लो।
    नोट: मृत कोशिकाओं Ethidium homodimer के साथ दाग एक व्यावसायिक रूप से उपलब्ध माइक्रोस्कोप के लाल फिल्टर घन जी का उपयोग कर लाल के रूप में प्रकट होता है (सामग्री की तालिका). वैकल्पिक रूप से, संकेत 535 एनएम उत्तेजना और 624 एनएम उत्सर्जन पर एक स्पेक्ट्रोफोटोमीटर का उपयोग कर कब्जा कर लिया जा सकता है.

7. विभाजन SBNET अफ़ीरॉइड्स

नोट: यह विस्तार के लिए और अन्य शोधकर्ताओं के साथ साझा करने के लिए किया जाता है.

  1. एक P1000 पिपेट का प्रयोग यांत्रिक रूप से ECM तोड़ने के लिए और एक बाँझ 1.5 एमएल ट्यूब के लिए SBNET स्रूपीय के साथ ECM aspirate.
  2. 4 डिग्री सेल्सियस पर 1,000 x g पर सेंट्रीफ्यूज, सभी supernatant को हटा दें और बर्फ पर ट्यूब जगह है।
  3. 2-4x गोली के लिए नए ECM की मात्रा जोड़ें. ऊपर और नीचे 10x pipeting द्वारा पुराने ECM और SBNET spheroids के साथ नए ECM मिक्स. हवा के बुलबुले शुरू करने से बचना।
  4. ईसीएम और एसबीनेट स्फीरॉइड मिश्रण को एक नई प्लेट में 5-20 डिग्री सेल्सियस स्थानांतरित करें और ईसीएम को ठोस होने दें।
  5. नए SBNET मध्यम के साथ कवर और इनक्यूबेटर के लिए स्थानांतरण। वसूली दर लगभग 95 से 100% है.
  6. शिपिंग SBNET एक और प्रयोगशाला के लिए spbNET spheroids के लिए, एक T25 फ्लास्क के लिए नए ECM के साथ SBNET spheroids हस्तांतरण और ECM ठोस करने के लिए अनुमति देते हैं.
  7. SBNET अफ़ीरॉइड मध्यम के साथ T25 फ्लास्क भरें, कसकर टोपी पर पेंच, और शिपमेंट पैकेज तैयार करें।
  8. SBNET स्रूपीय संस्कृति प्राप्त करने पर, संस्कृति माध्यम को हटा दें और SBNET स्रूपाइड को संस्कृति में वापस रखने के लिए चरण 7.1 से 7.5 करें।

8. Cryostorage और SBNET अफ़ीरॉइड की वसूली

  1. 5-10 छोटे कुओं से एक 15 एमएल ट्यूब के लिए SBNET गोलोइड स्थानांतरण. 4 डिग्री सेल्सियस पर 15 मिनट के लिए 500 x ग्राम पर सेंट्रीफ्यूज, सुपरनेंट को हटा दें, ठंड माध्यम (90% एफबीएस + 10% DMSO) में फिर से तैयार करें, एक सेल फ्रीजिंग कंटेनर में स्टोर करें, और इसे -80 डिग्री सेल्सियस पर रखें।
  2. लंबे समय तक भंडारण के लिए तरल नाइट्रोजन में स्थानांतरण।
  3. SBNET गोलोइड को पुनर्प्राप्त करने के लिए, जमे हुए शीशी को बर्फ पर रखें और सामग्री पूरी तरह से thawed है जब तक प्रतीक्षा करें। ट्यूब उलटा और बर्फ पर फिर से जगह क्रम में thawing प्रक्रिया में तेजी लाने के लिए.
  4. एक बार नमूना thawed है, एक पूर्व ठंडा अपकेंद्रण के अंदर रखा और 10 मिनट के लिए 1,000 x ग्राम पर स्पिन.
  5. सुपरनेंट निकालें और ईसीएम में स्रूपभियों को पुन: निलंबित करें। बर्फ पर ट्यूब रखें, एक नई थाली के लिए 20 डिग्री सेल्सियस हस्तांतरण, और ECM के लिए प्रतीक्षा करने के लिए ठोस.
  6. SBNET संस्कृति माध्यम के 200 डिग्री सेल्सियस को रॉक अवरोधक (Y-27632)13 के साथ स्थानांतरित करें और इनक्यूबेटर में स्थानांतरित करें।
  7. SBNET स्फ़रॉइड्स को पुनर्प्राप्त करने और 1 सप्ताह के लिए विकसित होने की अनुमति दें. पुरानी संस्कृति माध्यम निकालें, SBNET संस्कृति माध्यम के 200 $L के साथ फिर से भरना और इनक्यूबेटर पर लौटें।
  8. SBNET स्रूपॉइड्स को विकसित करने के लिए जारी रखने की अनुमति दें।
    नोट: यह तेजी से बढ़ रही गोलिभकेस के लिए कम से कम 1 सप्ताह लेता है cryopservation13के बाद ठीक करने के लिए शुरू करने के लिए. SBNET अफ़ीरॉइड ्स-वे बढ़ता शुरू करने के लिए कम से कम 2-4 सप्ताह लेते हैं। कई SBNET कोशिकाओं पहले 2 सप्ताह के भीतर मर जाएगा और जीवित रहने की दर से कम है 10%. चूंकि यह एक बहुत ही समय लेने वाली और कम उपज की प्रक्रिया है, यह संस्कृति फ्लास्क में अन्य शोधकर्ताओं SBNET spheroids के साथ साझा करने के लिए बेहतर है (के रूप में चरण 7 में वर्णित). Cryostorage और वसूली केवल एक जीवाणु संदूषण होता है के मामले में एक बैकअप योजना के रूप में इस्तेमाल किया जाना चाहिए.

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Representative Results

वर्तमान में केवल 2 SBNET सेल लाइनों की स्थापना की और प्रकाशित कर रहे हैं2,3,4,5 और वे आसानी से कई शोधकर्ताओं के लिए उपलब्ध नहीं हैं. यहाँ, हम ECM में गोलिभयाभ के रूप में संस्कृति SBNET का प्रस्ताव है और SBNET दवा संवेदनशीलता का अध्ययन करने के लिए एक वैकल्पिक मॉडल के रूप में इस का उपयोग करें. एक SBNET कि जिगर के लिए metastasized से रोगी व्युत्पन्न ट्यूमर एकत्र किया गया था, SBNET कोशिकाओं को जारी करने के लिए पचा, और एक SBNET गोलाभ संस्कृति की स्थापना के लिए तरल ECM के साथ मिश्रित (चित्र 1ए). इस SBNET की-67 4.3% थी. यद्यपि एसबीनेट गोलाभ की दर धीमी होती है, फिर भी उनकी वृद्धि की निगरानी सूक्ष्म इमेजिंग द्वारा की जा सकती है (चित्र 1क)। जब संस्कृति मीडिया को सप्ताह में एक बार बदल दिया जाता है तो SBNET स्फिरॉइड्स के आकार में दोगुना होने में लगभग 14 दिन लगते हैं (चित्र 1B) . संस्कृति में 14 दिनों के बाद, SBNET अफ़ीरॉइड आकार में वृद्धि नहीं है। इसके बजाय, कुछ SBNET कक्ष किसी पड़ोसी स्थान से अलग हो जाएगा और नए स्फ़रॉइड बनाते हैं। SBNET गोलाभ संस्कृति का प्रचार करने के लिए, SBNET अफ़ीरॉइड युक्त ECM फसल और नई संस्कृति माध्यम (चरण 7) के साथ नई संस्कृति प्लेट में उन्हें reseed.

यह पुष्टि करने के लिए कि ऑर्गेनोइड संस्कृतियों में SBNET कोशिकाएं होती हैं, हम SBNET मार्कर जैसे सिनेप्टोफिसिन, क्रोमोग्रेनिन ए, और सोमेटोस्टैटिन रिसेप्टर प्रकार 2 (SSTR2) इम्यूनोफ्लोरेस (IF) माइक्रोस्कोपी का उपयोग करके स्फीरोइड के लिए स्फीरोइड को दागने के लिए एक सरल और तेज़ विधि का वर्णन करते हैं ( चरण 4). सिनैप्टोफाइसिन, क्रोमोग्रेनिन ए और एसटीआर2 के खिलाफ विशिष्ट एंटीबॉडी का उपयोग करके, हमारे IF डेटा से पता चला है कि इन मार्करों कोशिका द्रव्य में और SBNET कोशिकाओं की झिल्ली में स्थानीयकृत कर रहे हैं (चित्र 2ए, हरे रंग में) संस्कृति में 1 या 9 महीने के बाद (Figure 2B ). SYP, CgA और SSTR2 एंटीबॉडी की विशिष्टता सुनिश्चित करने के लिए, हम अग्न्याशय ट्यूमर से एक organoid लाइन पर एक ही धुंधला प्रक्रियाओं है कि SYP व्यक्त नहीं करता प्रदर्शन किया, CgA या SSTR2 (चित्र ा0पा 2सी) के रूप में कोई हरी संकेत का पता चला था. इस SBNET गोलभड़ का मुख्य लाभ यह है कि यह 4 ज के भीतर किया जा सकता है और इम्यूनोहिस्टोकेमिस्ट्री (IHC; चित्र 3) . हम चरण 5 में SBNET स्फीरॉइड्स के IHC करने के लिए एक प्रोटोकॉल प्रदान करते हैं।

स्काइरोइड के रूप में SBNET Culturing दवाओं है कि SBNET विकास को बाधित कर सकते हैं की पहचान करने के लिए एक मूल्यवान तकनीक है. सिद्धांत के एक सबूत के रूप में, हम 5 दिनों के लिए rapamycin के साथ SBNET spheroids इलाज, एक MTOR अवरोध करनेवाला, आमतौर पर NETs8के इलाज के लिए इस्तेमाल दवाओं का एक वर्ग. हमारे नियंत्रण SBNET गोलाभ की तुलना में, rapamycin इलाज गोलाभ एक अंगूर की तरह संरचना का गठन किया और apoptotic या नेक्रोटिक बन गया (चित्र 4ए-डी)। डी.एन.ए. और आरएनए को दागने के लिए एथिडियम होमोडाइमर का उपयोग करके डाइंग कोशिकाओं का पता लगाया जा सकता है और एक चमकदार लाल संकेत14उत्पन्न किया जा सकता है . यह डाई जीवित कोशिकाओं की कोशिका झिल्ली में प्रवेश नहीं कर सकता।

Figure 1
चित्रा 1: रोगी व्युत्पन्न छोटे आंत्र neuroendocrine ट्यूमर (SBNETs) बाह्य कोशिकीय मैट्रिक्स में बड़े (ECM) गोलिभयाज के रूप में. (एक) एक resected SBNET से ट्यूमर कोशिकाओं के अलगाव और ECM के साथ मिश्रण द्वारा संस्कृति में डाल दिया. स्केल बार, ImageJ का उपयोग करके परिमाणित संस्कृति में दिनों की संख्या के संबंध में SBNET अफ़ीरों का 100 डिग्री उ. (बी) सतह क्षेत्र का प्रतिनिधित्व करता है। डेटा 1 रोगी के SBNET गोलभों से प्राप्त किए गए थे और मतलब क्षेत्र के रूप में प्रतिनिधित्व कर रहे हैं - मतलब के मानक त्रुटि. प्रत्येक समय बिंदु के लिए 30 से 60 गोलभों के पृष्ठीय क्षेत्रको मापा गया। कृपया इस चित्र का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

Figure 2
चित्र 2: इम्यूनोफ्लोरेसेंस (आईएफ) एसबीनेट स्फीरोइड्स का धुंधलापन। यदि संस्कृति में (A) 1 महीने और (B) 9 महीने की संस्कृति में SBNET स्फीरॉइड्स का धुंधलापन है . (सी)यदि अग्न्याशय ट्यूमर organoids कि नकारात्मक नियंत्रण के रूप में SBNET मार्करों व्यक्त नहीं करते के धुंधला. ट्यूमर गोफरोइड 4% पैराफॉर्मेल्डिहाइड में तय किया गया था और 1/600 कमजोर पड़ने पर synaptophysin (SYP) के खिलाफ एंटीबॉडी का उपयोग कर दाग, क्रोमोग्रेनिन ए (CgA) पर 1/400 कमजोर पड़ने पर, और somatostatin रिसेप्टर 2 (SSTR2) पर 1/400 पर। यदि छवियों पर लिया गया 100 एमएस, 200 एमएस और 400 एमएस जोखिम समय SYP, CgA और SSTR2 धुंधला के लिए, क्रमशः 10x, 20x या 40x उद्देश्यों का उपयोग कर. स्केल बार 50 m का प्रतिनिधित्व करता है. कृपया इस आकृति का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

Figure 3
चित्र ाालाःइम्युनोहिस्टोकेमिस्ट्री (आईएचसी) एसबीनेट स्फिलॉयड्स का दाग। फॉर्मलिन-फिक्स्ड और पैराफिन-एम्बेडेड एसबीनेट स्फिरोइड्स वर्गों को विपरित, पुनर्जलित, अवरुद्ध और दागदार(ए) एसवाईपी,(बी) सीजीए, और(सी) SSTR2 एंटीबॉडी थे। छवियाँ 400x उद्देश्य का उपयोग कर लिया गया. स्केल बार 50 m का प्रतिनिधित्व करता है. कृपया इस आकृति का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

Figure 4
चित्र 4: औषध परीक्षण के लिए SBNET स्फीरॉइड्स का प्रयोग करना।(क) 5 दिनों के लिए DMSO के साथ उपचारित SBNET स्फीरॉइड्स की उज्ज्वल क्षेत्र छवि. (बी)एसबीनेट स्फिरॉइड्स की छवि जो डीएमएसओ के साथ उपचारित की जाती है और इथिडियम होमोडाइमर (इथिडियम एच) से दागी जाती है। (ग)5 दिनों के लिए rapamycin के 10 डिग्री सेल्सियस के साथ उपचार के बाद अंगूर की तरह संरचना बनाने के एक मृत SBNET स्फीरॉइड की उज्ज्वल क्षेत्र छवि। (घ) मृत एसबीनेट स्फरॉइड एथिडियम एच के साथ दाग लाल डॉट्स के रूप में प्रकट होता है। Ethidium एच धुंधला की छवियाँ 100 एमएस जोखिम समय पर लाल फिल्टर घन का उपयोग कर लिया गया. स्केल बार 10 डिग्री मी का प्रतिनिधित्व करता है. कृपया इस आकृति का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

विकास मीडिया या समाधान संरचना
मध्यम धोएं DMEM युक्त 1% FBS, 1% PEN/
SBNET संस्कृति माध्यम DMEM/F12 + 10% FBS + 1% PEN/STREP + 1% ग्लूटामाइन + 10 एमएम निकोटिनामाइड + 10 ग्राम/
एंटीबॉडी बफर 2.5% गोजातीय सीरम एल्बुमिन, 0.1% सोडियम अज़ीदे, 25 एमएम ट्राइस पीएच 7.4, 150 एमएम सोडियम क्लोराइड
फ्रीजिंग माध्यम 90% FBS + 10% DMSO
मानव जिगर स्टेम सेल अलगाव माध्यम DMEM/F12 , 1% पेन / 1% GlutaMAX, 10 mM HEPES, 1/50 B27 अनुपूरक, 1/100 N2 अनुपूरक, 1 mM N-acetylcysteine, 200 ng/mL Rspo 1, 50ng/mL EGF, 100 ng/mL FGF10, 10 m Nicotinamide, 10 uM forskolin, 5u-8
मानव अग्नाशय स्टेम सेल अलगाव माध्यम DMEM/F12 , 1% पेन / 1/50 B27 पूरक, 1/100 N2 अनुपूरक, 1 m-acetylcysteine, 200 ng/mL Rspo 1, 25 ng/mL नोगिन, 50ng/mL EGF, 100 ng/mL FGF10, 10 mM nicotinamide, 10 uM forskolin, 5Mu-U33

तालिका 1. विकास मीडिया और समाधान की सूची.

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Discussion

ट्यूमर 3 डी संस्कृतियों पूर्व नैदानिक दवा परीक्षण15के लिए एक मूल्यवान संसाधन बन गए हैं. हाल ही में स्तन कैंसर और प्रोस्टेट कैंसर ट्यूमर16,17से विभिन्न ट्यूमर organoid biobanks स्थापित किया गया है . इस अध्ययन में, हम एक विस्तृत प्रोटोकॉल प्रदान करने के लिए संस्कृति SBNET के रूप में गोलिभयाभ और एक सरल और तेजी से विधि इम्यूनोफ्लोरेसींस और परीक्षण दवा संवेदनशीलता द्वारा नेट मार्करों के लिए गोलाभ संस्कृतियों को मान्य करने के लिए. हमारे अनुभव से, SBNET spheroids विभिन्न संस्कृति मीडिया में विकसित कर सकते हैं. वे मानव अग्न्याशय या जिगर अलगाव है कि हम पहले से प्रकाशित प्रोटोकॉल9से अनुकूलित के लिए स्टेम सेल मीडिया में थोड़ा तेजी से हो जाना . हम DMEM/F12 मध्यम इंसुलिन और nicotinamide के साथ पूरक में SBNETs विकसित करने के लिए चुना है क्योंकि यह स्टेम सेल मीडिया की तुलना में कम महंगा है. भ्रूण गोजातीय सीरम के प्रतिशत में वृद्धि SBNET organoid संस्कृतियों के विकास को बढ़ावा देने के लिए एक और रणनीति है; हालांकि, यह भी संस्कृति के रखरखाव के लिए कुल लागत में वृद्धि होगी.

10x, 20x या 40x उद्देश्यों का उपयोग कर एक फ्लोरोसेंट माइक्रोस्कोपी के साथ दाग और इमेजिंग प्रदर्शन अभिव्यक्ति SBNET मार्करों के लिए परीक्षण करने के लिए एक त्वरित और सरल तरीका है। तथापि, यह आईएचसी की तुलना में एक सुपरिभाषित स्थानीयकरण नहीं देता है (चित्र 2, चित्र 3)। उदाहरण के लिए, IF डेटा से पता चला कि SSTR2 की झिल्ली स्थानीयकरण का पता लगाने के लिए कठिन है। हम मुख्य रूप से साइटोसोलिक SSTR2 का पता लगाने, जो पहले18की सूचना दी गई है. मार्कर प्रोटीन का एक बेहतर स्थानीयकरण प्राप्त करने के लिए, हम IF और confocal माइक्रोस्कोपी का उपयोग करने की सलाह देते हैं. कुल मिलाकर, IF तेजी से SBNET मार्करों की पुष्टि करने के लिए एक उपयोगी तरीका है. हमारे एंटीबॉडी (विरोधी SYP, विरोधी CgA, विरोधी SSTR2) नकारात्मक नियंत्रण organoids कि SYP, CgA, या SSTR2 व्यक्त नहीं करते के साथ पार प्रतिक्रिया नहीं किया (चित्र 2सी) IF प्रयोग में. यह सुझाव है कि फ्लोरोसेंट संकेत है कि हम का पता चला SBNET गोलोइड के लिए विशिष्ट हैं.

SBNET spheroids की उपज को बढ़ाने के लिए, इस प्रोटोकॉल के महत्वपूर्ण कदम सेल निस्पंदन कदम के दौरान कर रहे हैं (कदम 2.2) और ऊतक संस्कृति प्लेटों में alicouटिंग के लिए तरल ECM के साथ SBNET मिश्रण (कदम 2.8). SBNET कोशिकाओं को प्लास्टिक से चिपके रहने से रोकने के लिए सेल छलनी झिल्ली और संग्रह ट्यूब को मीडिया के साथ कवर करना सुनिश्चित करें। तरल ECM तेजी से ठोस अगर बर्फ पर नहीं रखा जाएगा. ECM और SBNET कोशिकाओं को ठंडा रखने के क्रम में ऊतक संस्कृति हुड में एक छोटे से बर्फ कंटेनर है सुनिश्चित करें.

इस तकनीक की सीमा SBNET अफ़ीरॉइड की धीमी वृद्धि दर है। प्रयोगों की कुशलता से योजना बनाई जानी चाहिए और SBNET अफ़ीरॉइड की अतिरिक्त मात्रा का उपयोग करने से बचें। एक और सीमा फ्रीज thaw के बाद धीमी वसूली है. यह SBNET spheroids के लिए thawing के बाद 1 महीने से अधिक लेता है बढ़ शुरू करने के लिए. इस सीमा को दूर करने के लिए, हम लगातार संस्कृतियों में SBNET spheroids बनाए रखने और उन्हें जरूरत के रूप में बंटवारे का सुझाव (चरण 7). यहां तक कि संस्कृति में 9 महीने के बाद, SBNET अफ़ीरॉइड अभी भी SBNET मार्करों की अभिव्यक्ति बनाए रखने (चित्र 2बी) .

हालांकि SBNET spheroids के 3 डी संस्कृति अन्य कैंसर सेल लाइनों के पारंपरिक 2 डी संस्कृति की तुलना में अधिक श्रम गहन है, यह SBNET के इन विट्रो संस्कृति के लिए एक अत्यंत मूल्यवान मॉडल है क्योंकि कई SBNET शोधकर्ताओं मौजूदा सेल लाइनों के लिए उपयोग नहीं है. इस प्रोटोकॉल के साथ, वैज्ञानिकों और चिकित्सकों resepted ट्यूमर से SBNET गोलभॉइड संस्कृतियों की स्थापना और उन्हें अन्य प्रयोगशालाओं के साथ साझा कर सकते हैं. इसके अलावा, SBNET spheroids संभवतः SBNET रोगी व्युत्पन्न xenograft माउस मॉडल स्थापित करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है. कुल मिलाकर, यहाँ प्रस्तुत तकनीक culturing के लिए अनुकूलित किया जा सकता है, विशेषता और इस तरह के अग्नाशय या फेफड़ों NETs के रूप में अन्य NETs के दवा परीक्षण प्रदर्शन. ध्यान दें कि organoids की वृद्धि दर NETs और रोगी के नमूनों के विभिन्न प्रकार के बीच अलग अलग होंगे.

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Disclosures

लेखकों को खुलासा करने के लिए कुछ भी नहीं है.

Acknowledgments

यह काम NIH अनुदान P50 CA174521 द्वारा समर्थित किया गया था (जे.आर. होवे और ए.एम. Bellizzi के लिए). पी.एच. कान P50 CA174521 कैरियर संवर्धन कार्यक्रम पुरस्कार के एक प्राप्तकर्ता है.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Anti-rabbit FITC Jackson ImmunoResearch 11-095-152 Secondary antibody couple to a green fluorophore
Antigen Retrieval Solution Agilent Dako S2367 Solution at pH 9 for preparing slides for IHC
Autostainer Link 48 Agilent Dako Not Available Automated system for antibody staining
Cell freezing container Thermo Scientific 5100-0001 Container to for freezing cells
CellSence Olympus Version 1.18 Computer software for using fluorescent microscope
Chromogranin A antibody Abcam-45179 RB-9003-PO Antibodies for IF
Chromogranin A antibody (clone LK2H10) Thermo Scientific MA5-13096 Antibodies for IHC
Collagenase Sigma C0130 Enzyme for digesting tumor tissue
DMEM Gibco 11965-092 Medium for tissue preparation
DMEM/F12 Gibco 11320-033 Medium for organoid cultures
DMSO Sigma D8418 Solvent for dissolving drug
DNAse Sigma DN25 Enzyme for digesting tumor tissue
Ethidium Homodimer Chemodex CDX-E0012-T1E DNA and RNA binding dye
FBS Gibco 16000044 Reagent for culture media
Fluorescent microscope Olympus CKX35 Microscope for taking pictures of SBENT spheroids
Glutamine Gibco A2916801 Reagent for culture media
ImageJ National Institutes of Health Version 1.51 Computer software for image analysis
Insulin Sigma I0516 Reagent for culture media
Matrigel Corning 356235 Matrix to embed and anchore organoids
Mounting medium (VECTASHIELD) Vector Laboratories H-1200 Fixative for labelled-cells with a nuclear stain
Nicotinamide Sigma 72340 Reagent for culture media
Paraformaldehyde Electron Microscopy Sciences 15710 Reagent to fix cells
PEN/STREP Gibco 15140-122 Reagent for culture media
PT Link Agilent Dako Not Available Automated system to prepare slides for IHC staining
Rapamycin Alfa Aesar J62473 Drug that can inhibit NET growth
Secondary antibodies for IHC Agilent Dako K8000 Secondary antibodies for IHC using Polymer-based EnVision FLEX system
SSTR2 antibody GeneScritp A01591 Antibodies for IF
SSTR2 antibody (clone UMB1) Abcam ab134152 Antibodies for IHC
Synaptophysin antibody Abcam 32127 Antibodies for IF
Synaptophysin antibody (clone DAK-SYNAP) Agilent Dako M7315 Antibodies for IHC
TritonX Mallinckrodt 3555 KBGE Reagent to permeablize cells
Y-2763 ROCK inhibitor Adipogen AG-CR1-3564-M005 To improve SBNET spheroid viability after freeze thaw

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References

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कैंसर अनुसंधान अंक 152 छोटे आंत्र neuroendocrine ट्यूमर गोलाभ synaptophysin क्रोमोग्रेनिन ए SSTR2 इम्यूनोफ्लोरेसिस इम्यूनोहिस्टोकेमिस्ट्री extracellular मैट्रिक्स rapamycin
स्थापना और छोटे आंत्र neuroendocrine ट्यूमर Spheroids की विशेषता
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Ear, P. H., Li, G., Wu, M., Abusada, … More

Ear, P. H., Li, G., Wu, M., Abusada, E., Bellizzi, A. M., Howe, J. R. Establishment and Characterization of Small Bowel Neuroendocrine Tumor Spheroids. J. Vis. Exp. (152), e60303, doi:10.3791/60303 (2019).

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