Summary
Neuroendokrina tumörer (NETs) härstammar från neuroendokrina celler i neurala Crest. De är långsamt växande och utmanande för kulturen. Vi presenterar en alternativ strategi för att odla nät från tunntarm genom odling av dem som spheroids. Dessa spheroids har små tarm nät markörer och kan användas för drogtester.
Abstract
Små tarm neuroendokrina tumörer (SBNETs) är sällsynta cancerformer som härrör från enterochromaffin celler i tarmen. Forskning inom detta område har begränsats eftersom mycket få patient härledda SBNET cellinjer har genererats. Väl differentierade SBNET celler är långsamt växande och är svåra att propagera. De få cell linjer som har upprättats är inte lätt tillgängliga, och efter tid i kulturen får inte fortsätta att uttrycka egenskaper hos netto celler. Generera nya cellinjer kan ta många år sedan SBNET celler har en lång fördubbling tid och många berikande steg behövs för att eliminera den snabbt dividera cancer-associerade fibroblaster. För att övervinna dessa begränsningar har vi utvecklat ett protokoll till kultur SBNET celler från kirurgiskt borttagna tumörer som spheroids i extracellulära matrix (ECM). ECM bildar en 3-dimensionell matris som kapslar SBNET celler och härmar tumören mikro-miljö för att tillåta SBNET celler att växa. Här har vi karakteriserat tillväxttakten för SBNET spheroids och beskrivna metoder för att identifiera SBNET markörer med hjälp av immunofluorescensmikroskopi och immunohistokemi för att bekräfta att spheroids är neuroendokrina tumörceller. Dessutom använde vi SBNET spheroids för att testa cytotoxicitet av rapamycin.
Introduction
Små tarm neuroendokrina tumörer (SBNETs) härstammar från enterochromaffin celler i tunntarmen. Även om sbnets är allmänt kända för att växa långsamt, de ofta metastasera till levern1. Medan kirurgiskt avlägsnande eller tumör ablation kan övervägas i många fall, upprepning är nästan universell, och, därför, medicinsk behandling spelar en viktig roll i förvaltningen. Enorma ansträngningar har investerats för att generera nya SBNET cellinjer för drogtester. Men det har varit mycket liten framgång. Endast 6 sbnet cellinjer (KRJ-I, CND2, GOT1, P-STS, L-STS, H-STS) har rapporterats2,3,4,5; och tyvärr en cell linje inte längre uttrycker netto markörer6 och tre andra sbnet cellinjer (KRJ-I, L-STS, H-STS) bestämdes att härledas från transformerade lymfoblaster i stället för nät7. För att påskynda identifieringen av läkemedel för att inrikta sig på SBNETs, behövs alternativa metoder för in vitro-drogtester.
Här drar vi nytta av tillgängligheten av resected SBNETs och har etablerat ett sätt att odla dessa patient-härledda SBNETs som spheroids växer i ECM. Det övergripande målet med detta manuskript är att beskriva en metod för att odla SBNET som en tredimensionell (3D) kultur och skissera förfaranden för att karakterisera dessa spheroids för bibehållande av SBNET markörer genom immunofluorescensfärgning och immunohistokemi.
Dessutom visar vi hur dessa SBNET spheroids kan användas för att testa effekten av rapamycin, en anti-cancerläkemedel för NETs8. Logiken bakom detta protokoll är att utveckla en ny metod för att odla SBNET-celler in vitro och använda dem för drogtester. Fördelen med denna teknik över den traditionella metoden för att etablera en SBNET cellinjer är att 3D-kulturer av SBNETs snabbt kan erhållas och drogtester kan göras inom 3 veckor. SBNET spheroids kan potentiellt användas som en modell för att utföra in vitro-läkemedel skärmar för att identifiera nya läkemedel för SBNET patienter. Eftersom SBNET cellinjer inte är allmänt tillgängliga, 3D-kulturer av SBNET spheroids kan fungera som en ny in vitro-modell för att studera SBNETs och kan delas mellan forskare inom området.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Alla experiment med Human neuroendokrina tumör prover har godkänts av University of Iowa Hospital and Clinics IRB kommittén (protokollnummer 199911057). En lista över alla material och all utrustning beskrivs i material tabellen. En lista över tillväxtmedia och nyckellösningar finns i tabell 1.
1. liten tarm neuroendokrina tumör (SBNET) insamling och cell dissociation
- Få resected PATIENTSBNET prover efter tumör vävnader bekräftelse från kirurgisk patologi kärna.
- Skär SBNETs i 5 mm kuber och förvara i 25 mL DMEM/F12 medium i ett koniskt rör för transport till laboratoriet.
- Överför tumörerna i DMEM innehållande 1% FBS, 1% penicillin/streptomycin (Pen/STREP), 1% glutamin (Wash medium) och inkubera i detta tvätt medium i 15 min.
- Överföra tumörer till en ny maträtt och finhacka tumörer till mindre än 1 mm bitar med hjälp av sterila böjda sax.
- Överför de malda vävnaderna till ett nytt 50 mL-rör som innehåller 25 mL tvätt medium.
- Centrifugera provet på 500 x g i 15 min vid 4 ° c.
- Kassera supernatanten och Omsuspendera pelletsen i 10 mL tvättmedel innehållande kollagenas (100 U/mL) och DNase (0,1 mg/mL).
- Låt rötning av de malda tumörer inträffa i en 37 ° c inkubator med långsam skakning (50 rpm) för 1,5 h.
2. kultur av SBNETs som tumör spheroids i ECM
- Efter att matsmältningen har slutförts (steg 1,8), Centrifugera vid 500 x g i 15 min vid 4 ° c, Kassera supernatanten och Omsuspendera pelleten i 15 ml tvätt medium.
- Placera en 70 μm cell SIL ovanpå en ny 50 mL tub och överför 10 mL av tvätt mediet över cell SIL. Snurra tvätt mediet för att täcka sidan av plaströr för att förhindra att nät celler fastnar på sidan av plaströr.
- Filtrera cellsuspensionen genom cell SIL.
- Centrifugera vid 500 x g i 15 min vid 4 ° c, Kassera supernatanten, Omsuspendera pelleten i 200 μl tvättmedel (total volym är ~ 250 μl) och placera den på is.
- Överför 5 μL celler till 500 μL tvätt medium (1/100 utspädningsfaktor). Använd de utspädda cellerna för cellräkning med hjälp av en hemocytometern för att få antalet celler per milliliter. Multiplicera med 100 för att korrigera för utspädningsfaktorn.
- Multiplicera antalet celler per mL som erhållits i steg 2,5 med den totala mängden celler i suspension som erhållits i steg 2,4 (~ 250 μL).
- Centrifugera vid 500 x g i 15 min vid 4 ° c, Kassera supernatanten och Omsuspendera cellerna i flytande ECM (1 x 106 celler/ml) och håll på isen.
- Överför 5-20 μL av SBNET spheroids i ECM till en 96-brunn plattan och låt vätskan ECM att stelna genom att placera plattan i en 37 ° c inkubator i 5 min.
- Tillsätt 200 μL SBNET kultur medium (DMEM/F12 + 10% FBS + 1% penna/STREP + 1% glutamin + 10 mM nikotinamid + 10 μg/mL insulin) till varje brunn på 96-brunnen plattan som innehåller SBNET spheroids i ECM.
- Alternativt, kultur SBNET organoider i stamceller Media liknar vad som tidigare har beskrivits för odling av antingen mänskliga levern eller bukspottskörteln organoider9 och listas i tabellen av material.
- Ändra Media varje 5-7 dagar.
3. kvantifiering av sbnet sfäroid storlek med imagej
- Ta 5-10 bilder av SBNET spheroids på dag 1, 4, 7, 14, 23 och 97 av kulturen med en 10X mål.
- Öppna sparade bilder i ImageJ. Gå till fliken analysera , Välj alternativet Ställ in mätningar och placera en kontroll på områdes alternativet.
- Använd verktyget oval markering från verktygsraden för att generera en ellipsoid eller cirkel runt en välfokuserad sfäroid.
- Gå till fliken analysera och välj alternativet mått . Upprepa steg 3,4 och 3,5 för att få områdes mätning från 25-50 SBNET spheroids. Värdena anges i pixel kvadrat.
- Konvertera pixel området till μm2 genom att dividera storleken på varje pixel med längden på varje pixel till μm konverteringsfaktor för mikroskopibilder.
Obs: SBNET celler växer främst som spheroids och någon gång som ellipsoids.
4. karakterisering av SBNETS spheroids genom immunofluorescensering
- Överför de organoider som odlas i ECM till ett 1,5 mL-rör med en P1000 pipett.
- Centrifugera vid 1 500 x g i 1 min och ta bort supernatanten.
- Tvätta Organoid kulturen genom att tillsätta 1 mL PBS, blanda, Centrifugera vid 1 500 x g i 1 min och ta bort supernatanten.
- Fixera organoiderna genom att tillsätta 500 μL 4% PARAFORMALDEHYD och inkubera i 15 min.
- Tvätta kulturen två gånger med 1 mL PBS.
- Permeabilize kulturen genom att tillsätta 500 μL PBS + 3% BSA + 0,1% Triton X 100 för 5 min.
- Tvätta sedan tre gånger med 1 mL PBS + 3% BSA.
- Inkubera i 1 h med primära antikroppar mot synaptophysin (SYP)10 vid 1/600 spädning eller kromogranin a (CGA)11 och somatostatin receptor 2 (SSTR2)12 vid 1/400 spädning i antikroppbuffert (2,5% bovint serumalbumin, 0,1% natrium azid, 25 mM Tris pH 7,4, 150 mM natriumklorid).
Anmärkning: Använd 300 μL eller mer av antikropps lösning per tub. - Tvätta tre gånger med 1 mL PBS + 3% BSA.
- Inkubera med sekundära antikroppar kopplade till FITC vid 1/500 utspädning i antikroppbuffert för 1 h. Använd 300 μL eller mer av antikropps lösning per tub.
- Tvätta 3 gånger med 1 mL PBS + 3% BSA. Se till att aspirera och kasta alla supernatanten.
- Tillsätt 5 μL monteringsmedium som innehåller den nukleära fläcken DAPI.
- Använd en P20-pipett för att överföra 5 μL av SBNET spheroids från steg 4,12 till en glas rutschbana och försegla med en täckslip.
- Ta bilder med hjälp av ett fluorescerande Mikroskop med hjälp av målen 10X, 20x eller 40x.
5. SBNET spheroids karaktärisering av immunohistokemi (IHC)
- Överför SBNET spheroids från odlingsplattan till en 1,5 mL tub med hjälp av en P1000 pipett.
- Centrifugera vid 1 500 x g i 1 min och ta bort supernatanten.
- Fix SBNET spheroids genom att tillsätta 500 μL av 10% formalin till röret från steg 5,2 och inkubera i rumstemperatur för 2-5 dagar före paraffin inbäddning och skär 4 μm tjocka sfäroid sektioner.
- Deparaffinize, rehydrate, och använda värmeinducerad epitop hämtning i antigen lösning vid pH 9 genom upphettning till 97 ° c i 20 min med hjälp av 3-i-1 automatiserad bildbehandling station för att förbereda diabilder för antikropp inkubation.
- Blockera diabilder och inkubera med primära antikroppar mot SYP10 vid en 1/100 utspädning för 15 min, CGA11 vid en 1/800 utspädning för 15 min, och SSTR212 vid en 1/5000 utspädning för 30 min.
- Inkubera med det sekundära antikropps detekterings systemet i 15 minuter för anti-SYP och CgA-färgning och 30 min för anti-SSTR2 färgning. Ta bilder med ett 400x mål.
6. behandling av SBNET organoider med rapamycin
- Lös rapamycin i DMSO för att få en 10 mM stamlösning.
- Förbered SBNET odlingssubstrat med DMSO (t. ex. 1 mL SBNET odlingssubstrat + 1 μL DMSO) och SBNET odlingssubstrat med 10 μM rapamycin (t. ex. 1 mL SBNET odlingssubstrat + 1 μL 10 mM rapamycin stamlösning).
- Överför 200 μl media med sbnet kultur medium med DMSO eller 10 μm rapamycin till sbnet sfäroid kulturer.
- Inkubera SBNET spheroids i 5 dagar i 37 ° c inkubator.
- Tillsätt 1 μm etidiumbromid homodimer och inkubera i 30 min. ta bort mediet innehållande etidiumbromid homodimer, tvätta med 200 μl PBS och överför 200 μl PBS till varje brunn.
- Ta mikroskopi bilder av SBNET spheroids med och utan läkemedelsbehandling med hjälp av den röda filterkuben med 10X, 20x, eller 40x mål av ett fluorescerande Mikroskop.
Obs: döda celler färgade med Ethidium homodimer visas som röd med hjälp av den röda filterkuben G av ett kommersiellt tillgängligt Mikroskop (tabell över material). Alternativt kan signalen fångas med hjälp av en spektrofotometer vid 535 nm excitation och 624 nm emission.
7. uppdelning SBNET spheroids
Obs: Detta görs för expansion och för att dela med andra forskare.
- Använd en P1000 pipett för att mekaniskt bryta ECM och aspirera ECM med SBNET spheroids till en steril 1,5 mL tub.
- Centrifugera vid 1 000 x g vid 4 ° c, ta bort alla supernatanten och placera röret på is.
- Tillsätt 2-4x volymen av nya ECM till pelleten. Blanda den nya ECM med den gamla ECM och SBNET spheroids genom Pipettera upp och ner 10X. Undvika att införa luftbubblor.
- Överför 5-20 μL av ECM-och SBNET spheroids-blandningen till en ny platta och låt ECM stelna.
- Täck med nytt SBNET medium och överför till inkubatorn. Återvinningsgraden är cirka 95 till 100%.
- För leverans av SBNET spheroids till ett annat labb, överför SBNET spheroids med ny ECM till en T25 kolv och låt ECM stelna.
- Fyll T25 kolven med sbnet sfäroid medium, skruva på locket tätt, och Förbered försändelse paketet.
- När du får en sbnet sfäroid kultur, ta bort kultur mediet och utför steg 7,1 till 7,5 för att sätta sbnet spheroids tillbaka i kulturen.
8. kryolagring och återvinning av SBNET spheroids
- Överför SBNET spheroids från 5-10 små brunnar till en 15 mL tub. Centrifugera vid 500 x g i 15 min vid 4 ° c, avlägsna supernatanten, Omsuspendera i frys medium (90% FBS + 10% DMSO), förvara i en cell frysning behållare, och placera denna vid-80 ° c.
- Överför till flytande kväve för längre förvaring.
- För att återvinna SBNET spheroids, placera den frusna flaskan på is och vänta tills innehållet är helt tinat. Vänd på röret och sätt på isen igen för att påskynda upptining processen.
- När provet tinats, placeras inuti en pre-kyld centrifug och snurra på 1 000 x g i 10 min.
- Ta bort supernatanten och Omsuspendera spheroids i ECM. Håll röret på is, överföra 20 μL till en ny tallrik, och vänta på ECM att stelna.
- Överför 200 μL SBNET-kulturmedium med 10 μM berg hämmare (Y-27632)13 och överför till inkubatorn.
- Låt SBNET spheroids återhämta sig och växa i 1 vecka. Ta bort det gamla odlingsmediet, Fyll på med 200 μL SBNET kultur medium och återvänd till inkubatorn.
- Låt SBNET spheroids fortsätta att växa.
Obs: det tar minst 1 vecka för snabbt växande spheroids att börja återhämta sig efter frysförvaring13. SBNET spheroids ta minst 2-4 veckor att börja växa. Många SBNET celler kommer att dö inom de första 2 veckorna och överlevnaden är mindre än 10%. Eftersom detta är en mycket tidskrävande och låg avkastning process, är det bättre att dela med andra forskare SBNET spheroids i kulturen kolvar (som beskrivs i steg 7). Cryostorage och Recovery bör endast användas som en backup plan i händelse av en bakteriell förorening inträffar.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Det finns för närvarande endast 2 sbnet cellinjer etablerade och publicerade2,3,4,5 och de är inte lätt tillgängliga för många forskare. Här föreslår vi att kulturen SBNET som spheroids i ECM och använda detta som en alternativ modell för att studera SBNET läkemedels känslighet. Patient-derived tumör från en sbnet att metastaserat till levern samlades, smält för att frigöra sbnet celler, och blandas med flytande ECM för att etablera en sbnet sfäroid kultur (figur 1A). KI-67 av denna SBNET var 4,3%. Även om SBNET spheroids har en långsam tillväxttakt, kan deras tillväxt övervakas genom mikroskopisk avbildning (figur 1a). Det tar cirka 14 dagar för SBNET spheroids att fördubblas i storlek när kulturen Media ändras en gång i veckan (figur 1B). Efter 14 dagar i kulturen, SBNET spheroids inte öka i storlek. Istället, vissa SBNET celler kommer att separera till en angränsande plats och bilda nya spheroids. För att propagera för SBNET spheroids kultur, skörda ECM innehåller SBNET spheroids och reseed dem i ny kultur tallrik med nya odlingssubstrat (steg 7).
För att bekräfta att Organoid kulturer innehåller SBNET celler, beskriver vi en enkel och snabb metod för att färga spheroids för SBNET markörer såsom synaptophysin, Chromogranin A, och somatostatin receptor typ 2 (SSTR2) med hjälp av immunofluorescens (IF) mikroskopi ( Steg 4). Med antikroppar specifika mot synaptophysin, Chromogranin A och SSTR2, vår om data visade att dessa markörer är lokaliserade i cytoplasman och på membranet i sbnet celler (figur 2A, i grönt) efter 1 eller 9 månader i kulturen (Figur 2b ). För att säkerställa specificitet SYP, CGA och SSTR2 antikroppar, utförde vi samma färgning förfaranden på en Organoid linje från bukspottkörteln tumör som inte uttrycker SYP, CGA eller SSTR2 (figur 2C) som ingen grön signal upptäcktes. Den största fördelen med detta sbnet sfäroid om experimentet är att det kan utföras inom 4 h och ger liknande färgning information som immunohistokemi (IHC; Figur 3). Vi tillhandahåller ett protokoll för att utföra IHC av SBNET spheroids i steg 5.
Culturing SBNET as spheroids är en värdefull teknik för att identifiera läkemedel som kan hämma SBNET tillväxt. Som ett bevis på princip behandlade vi SBNET spheroids med rapamycin i 5 dagar, en mTOR-hämmare, en klass av läkemedel som vanligen används för att behandla nät8. I jämförelse med vår kontroll sbnet sfäroid, den rapamycin-behandlade sfäroid bildade en druva-liknande struktur och blev apoptotiska eller nekrotiska (figur 4a-D). Döende celler kan upptäckas med hjälp av Ethidium homodimer att färga DNA och RNA och generera en klarröd signal14. Denna färg kan inte tränga igenom cellmembranet i levande celler.
Figur 1: patient-derived tunntarm neuroendokrina tumörer (sbnets) odlas i extracellulära matrix (ECM) som sfäanoider. (a) isolering av TUMÖRCELLER från en resected sbnet och sätta i kulturen genom att blanda med ECM. Skalstapeln motsvarar 100 μm.B) yta av sbnet spheroids med avseende på antalet dagar i kulturen kvantifieras med imagej. Data erhölls från SBNET spheroids av 1 patient och representeras som medelvärdet område ± standardfel av medelvärdet. Ytarean på 30 till 60 spheroids mättes för varje tidspunkt. Vänligen klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 2: immunofluorescensfärgning (IF) av sbnet spheroids. OM färgning av SBNET spheroids efter (a) 1 månad i kultur och (B) 9 månader i kulturen. (C) om färgning av bukspottkörteln tumör organoider som inte uttrycker sbnet markörer som negativa kontroller. Tumör spheroids fastställdes i 4% PARAFORMALDEHYD och färgas med hjälp av antikroppar mot synaptophysin (SYP) på 1/600 utspädning, Chromogranin A (CgA) vid 1/400 utspädning, och somatostatin receptor 2 (SSTR2) vid 1/400. OM bilder togs på 100 MS, 200 MS och 400 MS exponeringstid för SYP, CgA och SSTR2 färgning, respektive med hjälp av 10X, 20x eller 40x mål. Scale bar representerar 50 μm. vänligen klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 3: immunohistokemi (IHC) FÄRGNING av sbnet spheroids. Formalin-fasta och paraffin-inbäddade SBNET spheroids sektioner var deparaffinized, rehydrerad, blockerad och färgas med (a) SYP, (B) CGA, och (C) SSTR2 antikroppar. Bilder har tagits med målet 400x. Scale bar representerar 50 μm. vänligen klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 4: använda sbnet spheroids för drogtester. (a) ljus fälts bild av sbnet SPHEROIDS behandlade med DMSO i 5 dagar. (B) bild av sbnet spheroids behandlade med DMSO och färgas med ethidium homodimer (Ethidium H). (C) ljus fält bild av en död sbnet sfäroid bildar druva-liknande struktur efter behandling med 10 μm rapamycin i 5 dagar. (D) döda sbnet sfäroid färgade med ethidium H visas som röda prickar. Bilder av Ethidium H färgning togs med hjälp av den röda filterkuben på 100 MS exponeringstid. Skalstapeln representerar 10 μm. vänligen klicka här för att se en större version av denna siffra.
| Tillväxtmedia eller lösning | Sammansättning |
| Tvätta mediet | DMEM innehållande 1% FBS, 1% penna/STREP, 1% glutamin |
| SBNET kultur medium | DMEM/F12 + 10% FBS + 1% penna/STREP + 1% glutamin + 10 mM nikotinamid + 10 μg/mL insulin |
| Antikroppsbuffert | 2,5% bovint serumalbumin, 0,1% natriumazid, 25 mM Tris pH 7,4, 150 mM natriumklorid |
| Frys medium | 90% FBS + 10% DMSO |
| Humant lever stamcells isolerings medium | DMEM/F12, 1% penna/STREP, 1% GlutaMAX, 10 mM HEPES, 1/50 B27 tillägg, 1/100 N2 tillägg, 1 mM N-acetylcystein, 200 ng/mL RSPO 1, 50ng/mL EGF, 100 ng/mL FGF10, 10 mM nikotinamid, 10 uM Forskolin, 5uM A83-01 |
| Mänskliga bukspottskörteln stamcells isolerings medium | DMEM/F12, 1% penna/STREP, 1% GlutaMAX, 10 mM HEPES, 1/50 B27 tillägg, 1/100 N2 tillägg, 1 mM N-acetylcystein, 200 ng/mL RSPO 1,25 ng/mL noggin, 50ng/mL EGF, 100 ng/mL FGF10, 10 mM nikotinamid, 10 uM Forskolin, 5uM A83-01, 3 uM PGE-2 |
Tabell 1. Lista över tillväxt medier och lösning.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Tumör 3D-kulturer har blivit en värdefull resurs för prekliniska drogtester15. Olika tumör Organoid biobanker har nyligen etablerats från bröstcancer och prostatacancertumörer16,17. I denna studie ger vi ett detaljerat protokoll till kultur SBNET som spheroids och en enkel och snabb metod för att validera sfäroid kulturer för netto markörer genom immunofluorescensbildning och test läkemedels känslighet. Från vår erfarenhet kan SBNET spheroids växa i olika kulturmedia. De växer något snabbare i stamceller media för mänsklig bukspottkörtel eller lever isolering som vi anpassat från tidigare publicerade protokoll9. Vi valde att odla SBNETs i DMEM/F12 medium kompletterat med insulin och nikotinamid eftersom detta är billigare än stamcells medier. Öka andelen foster bovint serum är en annan strategi för att främja tillväxten av SBNET Organoid kulturer; Detta skulle dock också öka den totala kostnaden för kultur underhåll.
Utföra om färgning och avbildning med en fluorescerande mikroskopi med hjälp av mål 10X, 20x eller 40x är en snabb och enkel metod för att testa för uttrycket SBNET markörer. Det ger dock inte en väldefinierad lokalisering i jämförelse med IHC (figur 2, figur 3). Till exempel, om data visade att membranet lokalisering av SSTR2 är svårt att upptäcka. Vi detekterar främst cytosoliska SSTR2, som tidigare har rapporterats18. För att få en bättre lokalisering av markör proteiner rekommenderar vi att du använder IF och konfokal mikroskopi. Sammantaget, om är en användbar metod för att snabbt bekräfta SBNET markörer. Våra antikroppar (anti-SYP, anti-CGA, anti-SSTR2) korsreagerar inte med de negativa kontroll organoider som inte uttrycker SYP, CGA eller SSTR2 (figur 2C) i IF-experimentet. Detta förslag att de fluorescerande signaler som vi upptäckte är specifika för SBNET spheroids.
För att öka avkastningen av SBNET spheroids, de kritiska stegen i detta protokoll är under cellfiltrering steg (steg 2,2) och blanda SBNET med flytande ECM för Ali citerar till vävnadskulturer plattor (steg 2,8). Se till att täcka cell SIL membranet och samlingsröret med media för att förhindra att SBNET cellerna fastnar på plasten. Flytande ECM kommer snabbt stelna om den inte släpps ut på is. Se till att ha en liten Isbehållare i vävnaden kultur huva för att hålla ECM och SBNET celler kallt.
Begränsningen av denna teknik är den långsamma tillväxttakten i SBNET spheroids. Experiment måste planeras effektivt och undvika att använda en överskjutande mängd av SBNET spheroids. En annan begränsning är den långsamma återhämtningen efter frys Tina. Det tar över 1 månad efter upptinning för SBNET spheroids att börja växa. För att övervinna denna begränsning föreslår vi att kontinuerligt bibehålla SBNET spheroids i kulturer och dela upp dem efter behov (steg 7). Även efter 9 månader i kulturen, SBNET spheroids fortfarande behålla uttrycket av SBNET markörer (figur 2B).
Även om 3D-kulturen av SBNET spheroids är mer arbetsintensiva än traditionella 2D-kulturen av andra cancer cellinjer, är det en mycket värdefull modell för in vitro-kultur av SBNET eftersom många SBNET forskare inte har tillgång till de befintliga cellinjer. Med detta protokoll kan forskare och kliniker etablera SBNET sfäroid kulturer från resected tumörer och dela dem med andra laboratorier. Dessutom kunde SBNET spheroids potentiellt användas för att etablera SBNET patient-härledda xenograft musmodeller. Sammantaget kan de tekniker som presenteras här anpassas för odling, karaktärisering och utförande av drogtester av andra nät såsom bukspottkörtel eller lung nät. Observera att tillväxttakten för organoider kommer att variera mellan olika typer av nät och patientprover.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Författarna har inget att avslöja.
Acknowledgments
Detta arbete stöddes av NIH Grants P50 CA174521 (till Jr Howe och A.M. Bellizzi). P.H. ear är mottagare av P50 CA174521 karriär Enhancement program Award.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Anti-rabbit FITC | Jackson ImmunoResearch | 11-095-152 | Secondary antibody couple to a green fluorophore |
| Antigen Retrieval Solution | Agilent Dako | S2367 | Solution at pH 9 for preparing slides for IHC |
| Autostainer Link 48 | Agilent Dako | Not Available | Automated system for antibody staining |
| Cell freezing container | Thermo Scientific | 5100-0001 | Container to for freezing cells |
| CellSence | Olympus | Version 1.18 | Computer software for using fluorescent microscope |
| Chromogranin A antibody | Abcam-45179 | RB-9003-PO | Antibodies for IF |
| Chromogranin A antibody (clone LK2H10) | Thermo Scientific | MA5-13096 | Antibodies for IHC |
| Collagenase | Sigma | C0130 | Enzyme for digesting tumor tissue |
| DMEM | Gibco | 11965-092 | Medium for tissue preparation |
| DMEM/F12 | Gibco | 11320-033 | Medium for organoid cultures |
| DMSO | Sigma | D8418 | Solvent for dissolving drug |
| DNAse | Sigma | DN25 | Enzyme for digesting tumor tissue |
| Ethidium Homodimer | Chemodex | CDX-E0012-T1E | DNA and RNA binding dye |
| FBS | Gibco | 16000044 | Reagent for culture media |
| Fluorescent microscope | Olympus | CKX35 | Microscope for taking pictures of SBENT spheroids |
| Glutamine | Gibco | A2916801 | Reagent for culture media |
| ImageJ | National Institutes of Health | Version 1.51 | Computer software for image analysis |
| Insulin | Sigma | I0516 | Reagent for culture media |
| Matrigel | Corning | 356235 | Matrix to embed and anchore organoids |
| Mounting medium (VECTASHIELD) | Vector Laboratories | H-1200 | Fixative for labelled-cells with a nuclear stain |
| Nicotinamide | Sigma | 72340 | Reagent for culture media |
| Paraformaldehyde | Electron Microscopy Sciences | 15710 | Reagent to fix cells |
| PEN/STREP | Gibco | 15140-122 | Reagent for culture media |
| PT Link | Agilent Dako | Not Available | Automated system to prepare slides for IHC staining |
| Rapamycin | Alfa Aesar | J62473 | Drug that can inhibit NET growth |
| Secondary antibodies for IHC | Agilent Dako | K8000 | Secondary antibodies for IHC using Polymer-based EnVision FLEX system |
| SSTR2 antibody | GeneScritp | A01591 | Antibodies for IF |
| SSTR2 antibody (clone UMB1) | Abcam | ab134152 | Antibodies for IHC |
| Synaptophysin antibody | Abcam | 32127 | Antibodies for IF |
| Synaptophysin antibody (clone DAK-SYNAP) | Agilent Dako | M7315 | Antibodies for IHC |
| TritonX | Mallinckrodt | 3555 KBGE | Reagent to permeablize cells |
| Y-2763 ROCK inhibitor | Adipogen | AG-CR1-3564-M005 | To improve SBNET spheroid viability after freeze thaw |
References
- Maxwell, J. E., Sherman, S. K., Howe, J. R. Translational Diagnostics and Therapeutics in Pancreatic Neuroendocrine Tumors. Clinical Cancer Research. 22, 5022-5029 (2016).
- Pfragner, R., et al. Establishment of a continuous cell line from a human carcinoid of the small intestine (KRJ-I). International Journal of Oncology. 8, 513-520 (1996).
- Kolby, L., et al. A transplantable human carcinoid as model for somatostatin receptor-mediated and amine transporter-mediated radionuclide uptake. American Journal of Pathology. 158, 745-755 (2001).
- Van Buren, G., et al. The development and characterization of a human midgut carcinoid cell line. Clinical Cancer Research. 13, 4704-4712 (2007).
- Pfragner, R., et al. Establishment and characterization of three novel cell lines - P-STS, L-STS, H-STS - derived from a human metastatic midgut carcinoid. Anticancer Research. 29, 1951-1961 (2009).
- Ellis, L. M., Samuel, S., Sceusi, E. Varying opinions on the authenticity of a human midgut carcinoid cell line--letter. Clinical Cancer Research. 16, 5365-5366 (2010).
- Hofving, T., et al. The neuroendocrine phenotype, genomic profile and therapeutic sensitivity of GEPNET cell lines. Endocrine Related Cancer. 25, 367-380 (2018).
- Moreno, A., et al. Antitumor activity of rapamycin and octreotide as single agents or in combination in neuroendocrine tumors. Endocrine Related Cancer. 15, 257-266 (2008).
- Broutier, L., et al. Culture and establishment of self-renewing human and mouse adult liver and pancreas 3D organoids and their genetic manipulation. Nature Protocols. 11, 1724-1743 (2016).
- Saito, Y., et al. Establishment of Patient-Derived Organoids and Drug Screening for Biliary Tract Carcinoma. Cell Reports. 27, 1265-1276 (2019).
- Park, S. J., et al. Detection of bone marrow metastases of neuroblastoma with immunohistochemical staining of CD56, chromogranin A, and synaptophysin. Applied Immunohistochemisty and Molecular Morphology. 18, 348-352 (2010).
- Clifton-Bligh, R. J., et al. Improving diagnosis of tumor-induced osteomalacia with Gallium-68 DOTATATE PET/CT. The Journal of Clinical Endocrinology and Metabolism. 98, 687-694 (2013).
- Clinton, J., McWilliams-Koeppen, P. Initiation, Expansion, and Cryopreservation of Human Primary Tissue-Derived Normal and Diseased Organoids in Embedded Three-Dimensional Culture. Current Protocols in Cell Biology. 82, 66 (2019).
- Markovits, J., Roques, B. P., Le Pecq, J. B. Ethidium dimer: a new reagent for the fluorimetric determination of nucleic acids. Analytical Biochemistry. 94, 259-264 (1979).
- Weeber, F., Ooft, S. N., Dijkstra, K. K., Voest, E. E. Tumor Organoids as a Pre-clinical Cancer Model for Drug Discovery. Cell Chemical Biology. 24, 1092-1100 (2017).
- Sachs, N., et al. A Living Biobank of Breast Cancer Organoids Captures Disease Heterogeneity. Cell. 172, 373-386 (2018).
- Puca, L., et al. Patient derived organoids to model rare prostate cancer phenotypes. Nature Communication. 9, 2404 (2018).
- Singh, S. P., et al. SSTR2-based reporters for assessing gene transfer into non-small cell lung cancer: evaluation using an intrathoracic mouse model. Human Gene Therapy. 22, 55-64 (2011).
