Summary
גידולים נוירואנדוקריניים (רשתות) מקורם בתאים נוירואנדוקריניים של הרכס העצבי. הם הולך ומאתגר לאט לתרבות. אנו מציגים אסטרטגיה חלופית לגידול רשתות מהמעי הקטן על ידי הקפדה עליהם כספרואידים. הספרואידים הללו יש המעי הקטן סמנים נטו יכול לשמש בדיקות סמים.
Abstract
קטן גידולים נוירואנדוקריניים (SBNETs) הם סוגי סרטן נדירים שמקורם בתאי enterochromaffin של הבטן. מחקר בתחום זה היה מוגבל כי מעט מאוד החולה נגזר שורות ברשת SBNET נוצרו. תאים SBNET מובחנת היטב הם איטיים הגדלים וקשה להפיץ. קווי התאים הבודדים שהוקמו אינם זמינים, ולאחר זמן בתרבות לא ניתן להמשיך לבטא את המאפיינים של תאי NET. יצירת קווי תא חדש יכול להימשך שנים רבות מאז SBNET תאים יש זמן הכפלה ארוכה ושלבי העשרה רבים נחוצים כדי לחסל במהירות חלוקת סרטן הקשורים באופן מהיר. כדי להתגבר על מגבלות אלה, פיתחנו פרוטוקול התרבות SBNET תאים מפני גידולים שהוסרו בניתוח כמו spheroids ב מטריצה החילוץ (ECM). ECM צורות מטריצה תלת ממדית העוטף בתאי SBNET ומחקה את הגידול מיקרו הסביבה לאפשר לתאי SBNET לצמוח. כאן, אנו לאפיין את שיעור הצמיחה של SBNET spheroids מתוארים שיטות כדי לזהות סמנים SBNET באמצעות מיקרוסקופ immunofluorescence ואימונוהיסטוכימיה כדי לאשר כי spheroids הם תאי גידול נוירואנדוקריניים. בנוסף, השתמשנו ב-SBNET spheroids לבדיקת רעילות ציטופצין של rapamycin.
Introduction
קטן גידולים נוירואנדוקריניים (SBNETs) מקורם תאים enterochromaffin של המעי הדק. למרות ש-SBNETs ידועים בדרך כלל כשהם גדלים לאט, הם בדרך כלל מגרורות לכבד1. בעוד הסרת כירורגי או אבלציה הגידול יכול להיחשב במקרים רבים, הישנות היא כמעט אוניברסלית, ולכן, טיפול רפואי ממלא תפקיד חשוב בניהול. מאמצים עצומים הושקעו כדי ליצור חדש שורות SBNET תאים עבור בדיקות סמים. עם זאת, היתה מעט מאוד הצלחה. רק 6 שורות של תאי sbnet (krj-I, CND2, GOT1, P-sts, L-sts, H-sts) דווחו2,3,4,5; ולמרבה הצער קו תא אחד כבר לא מבטא סמנים נטו6 ושלושה אחרים sbnet תאים קווי (krj-I, L-Sts, H-sts) היו נחושים להיות נגזר lymphoblasts השתנה במקום רשתות7. כדי להאיץ את זיהוי התרופות לצורך התמקדות בבקרי גבול, יש צורך בשיטות חלופיות לבדיקת סמים מחוץ לרשת.
כאן, אנו מנצלים את הזמינות של SBNETs מחדש והקמנו דרך לתרבות אלה בעלי מטופלים שנוצרו על ידי המטופל כספרואידים הגדלים ב-ECM. המטרה הכוללת של כתב היד הזה היא לתאר שיטה לתרבות SBNET כתלת-מימדי (3D) תרבות והליכי חלוקה לרמות כדי לאפיין את הספרואידים לשמירת סמנים SBNET על ידי immunofluorescence כתמים ואימונוהיסטוכימיה.
בנוסף, אנו מדגימים כיצד אלה מזהי SBNET הניתנים לשימוש לבדיקת ההשפעה של rapamycin, תרופה נגד סרטן עבור רשתות8. הרציונל מאחורי פרוטוקול זה הוא לפתח שיטה חדשה לגדל בתאי SBNET בתוך מבחנה ולהשתמש בהם לבדיקת סמים. היתרון של טכניקה זו על השיטה המסורתית של הקמת קו SBNET cell היא כי תרבויות תלת-ממד של Sbnet ניתן להשיג במהירות ובדיקות סמים ניתן לעשות בתוך 3 שבועות. מסנני SBNET יכולים לשמש כמודל לביצוע מסכי סמים מחוץ לרשת כדי לזהות תרופות חדשות עבור מטופלים מסוג SBNET. מאז SBNET קווי התאים אינם זמינים באופן נרחב, 3D תלת-ממד של SBNET spheroids יכול לשמש כמודל חדש בתחום החוץ לחקר בקרי Sbnet וניתן לשתף בין מדענים בשדה.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
כל הניסויים באמצעות דגימות גידולים נוירואנדוקריניים אנושיים אושרו על ידי אוניברסיטת איווה החולים והוועדה IRB (פרוטוקול מספר 199911057). רשימה של כל החומרים והציוד מתוארת בטבלת החומרים. בטבלה 1מצויים רשימה של מדיית צמיחה ופתרונות מפתח.
1. המעי הגס קטן גידול נוירואנדוקרינים (SBNET) אוסף ודיסוציאציה של התא
- השג את החולה resected דגימות SBNET לאחר ברקמות הגידול אישור מן הליבה פתולוגיה כירורגית.
- חותכים את SBNETs לתוך קוביות 5 מ"מ ומאחסנים 25 מ ל של מדיום DMEM דיה/F12 בצינור חרוט עבור התחבורה למעבדה.
- העבר את הגידולים ב-DMEM המכיל 1% FBS, 1% פניצילין/סטרפטומיצין (עט/דלקת), 1% גלוטמין (לשטוף את המדיום) ו הדגירה של המדיום הזה לשטוף עבור 15 דקות.
- העברת גידולים למנה חדשה וגידולים הגון לפחות מ 1 מ"מ חתיכות באמצעות מספריים מעוקל סטרילי.
- העברת רקמות טחון לצינור חדש 50 mL המכיל 25 מ ל של כביסה בינונית.
- צנטריפוגה את המדגם ב 500 x g עבור 15 דקות ב 4 ° c.
- להיפטר supernatant ולהשעות את כדורי ב 10 מ ל של כביסה בינונית המכילה קולגן (100 U/mL) ו DNase (0.1 mg/mL).
- אפשר את העיכול של גידולים כתוש להתרחש בחממה 37 ° c עם טלטול איטי (50 rpm) עבור 1.5 h.
2. תרבות של SBNETs כספרואידים סרטניים ב-ECM
- לאחר השלמת העיכול (שלב 1.8), צנטריפוגה ב 500 x g עבור 15 דקות ב 4 ° c, להיפטר supernatant ולהשעות את הגלולה ב 15 מ ל של כביסה בינונית.
- מקום מסננת תא 70 יקרומטר על גבי צינור חדש 50 ml והעברה 10 מ ל של בינוני לשטוף על מסננת התא. מערבולת בינונית ולכסות את הצד של צינור פלסטיק כדי למנוע תאים נטו לדבוק בצד של צינור פלסטיק.
- לסנן את התא ההשעיה דרך מסננת התא.
- צנטריפוגה ב 500 x g עבור 15 דקות ב 4 ° c, להיפטר supernatant, להשעות מחדש את הגלולה ב 200 μl של כביסה בינונית (נפח הכולל הוא ~ 250 μl) ומניחים אותו על הקרח.
- העברה 5 μL של תאים כדי 500 μL של כביסה בינונית (1/100 הגורם לדילול). השתמש בתאים מדולל עבור ספירת תאים באמצעות הומוציטוטומטר כדי להשיג את מספר התאים למילי-ליטר. הכפל ב-100 כדי לתקן את פקטור הדילול.
- הכפל את מספר התאים ל-mL שהושג בשלב 2.5 על-ידי הנפח הכולל של תאים בהשעיה שהושג בשלב 2.4 (~ 250 μL).
- צנטריפוגה ב 500 x g עבור 15 דקות ב 4 ° c, למחוק את supernatant, ולהשעות מחדש את התאים ecm נוזלי (1 x 106 תאים/mL) ולשמור על קרח.
- העבר 5-20 μL של SBNET spheroids ב ECM לצלחת 96-באר ולאפשר ECM נוזלי לגבש ידי הצבת צלחת בחממה 37 ° c עבור 5 דקות.
- הוסף 200 μL של מדיום תרבות SBNET (DMEM/F12 + 10% FBS + 1% עט/דלקת + 1% גלוטמין + 10 מילימטר ניטינאמיד +10 + 10 μg/mL אינסולין) לכל באר של הצלחת 96-באר המכילה את ה-SBNET spheroids ב ECM.
- לחילופין, תרבות SBNET אורגנואידים במדיה של תאי גזע דומה למה שתוארה בעבר לגידול של הכבד האנושי אולסרטן הלבלב , המפורטים בטבלת החומרים.
- . שינוי מדיה כל 5-7 ימים
3. הכמת של SBNET גודל ספרואיד באמצעות ImageJ
- קח 5-10 תמונות של SBNET הספרואידים ביום 1, 4, 7, 14, 23 ו 97 של התרבות באמצעות מטרה 10x.
- פתח תמונות שנשמרו ב-ImageJ. עבור לכרטיסיה ' ניתוח ', בחר באפשרות ' קבע מדידות ' והגדר בדיקה באזור .
- השתמשו בכלי בחירה אליפטית מסרגל הכלים כדי ליצור אליפסואיד או עיגול מסביב לספרואיד ממוקד היטב.
- עבור אל הכרטיסיה ' ניתוח ' ובחר באפשרות ' מדידה '. חזור על שלבים 3.4 ו-3.5 כדי לקבל מדידת שטח מ 25-50 SBNET spheroids. הערכים מסופקים בריבוע פיקסל.
- המירו את אזור הפיקסל ל-יקרומטר2 על-ידי חלוקת הגודל של כל אחד מהפיקסלים באורך של כל פיקסל לפקטור יקרומטר של תמונות המיקרוסקופיה.
הערה: SBNET תאים גדלים בעיקר כספירואידים ומתישהו כאליפסואידים.
4. אפיון מספרי הרשת של SBNETS על ידי מאימונולואונציה
- להעביר את האורגנואידים גדל ECM לצינור 1.5 mL באמצעות מP1000.
- צנטריפוגה ב 1,500 x g עבור 1 דקות ולהסיר את supernatant.
- לשטוף את התרבות אורגאיד על ידי הוספת 1 mL של PBS, לערבב, צנטריפוגה ב 1,500 x g עבור 1 דקות ולהסיר את supernatant.
- תקן את האורגנואידים על ידי הוספת 500 μL של 4% פאראפורמלדהיד ו-דגירה עבור 15 דקות.
- שוטפים את התרבות פעמיים עם 1 מ ל של PBS.
- הפריית התרבות על ידי הוספת 500 μL של PBS + 3% BSA + 0.1% טריטון X 100 עבור 5 דקות.
- ואז לשטוף שלוש פעמים עם 1 מ ל של PBS + 3% BSA.
- דגירה עבור 1 h עם נוגדנים הראשי נגד synaptophysin (SYP)10 ב 1/600 דילול או כרומוגרבין A (cga)11 ו הקולטן סומטוסטטין 2 (SSTR2)12 ב 1/400 דילול מאגר נוגדנים (2.5% בסרום אלבומין, 0.1% נתרן azide, 25 מ"מ 7.4 טריס pH, 150 mM נתרן כלוריד).
הערה: השתמש ב-300 μL או יותר פתרון נוגדן לכל צינור. - שטוף שלוש פעמים עם 1 מ ל של PBS + 3% BSA.
- דגירה עם נוגדנים משני מצמידים FITC ב 1/500 דילול במאגר נוגדן עבור 1 h. השתמש 300 μL או יותר פתרון נוגדן לכל צינור.
- רוחצים 3 פעמים עם 1 מ ל של PBS + 3% BSA. הקפידו למחוק ולהשליך את כל הסופרנטאנט.
- הוסף 5 μL של בינוני גובר המכיל DAPI הכתם הגרעיני.
- השתמש בפיפטה P20 כדי להעביר 5 μL של SBNET spheroids משלב 4.12 לשקופית זכוכית וחותם עם תגית כיסוי.
- לקחת תמונות באמצעות מיקרוסקופ פלורסנט באמצעות מטרות 10x, 20x או 40x.
5. האפיון של SBNET באמצעות אימונוהיסטוכימיה (IHC)
- העבר את SBNET spheroids מלוח התרבות לצינור 1.5 mL באמצעות P1000.
- צנטריפוגה ב 1,500 x g עבור 1 דקות ולהסיר את supernatant.
- תקן sbnet spheroids על ידי הוספת 500 μl של 10% פורמלין לצינור משלב 5.2 ו דגירה בטמפרטורת החדר עבור 2-5 ימים לפני הטבעה פרפין וחותכים 4 יקרומטר עובי ספרואיד סעיפים.
- לאחר מכן, לחמם מחדש, ולהשתמש בחום המושרה כאפירופה לאיחזור בפתרון אחזור אנטיגן ב-pH 9 על ידי חימום 97 ° c עבור 20 דקות באמצעות שקופיות 3-in-1 לעיבוד השקופית האוטומטית כדי להכין שקופיות לדגירה נוגדן.
- לחסום שקופיות ו-דגירה עם נוגדנים העיקרי נגד SYP10 ב 1/100 דילול עבור 15 דקות, cga11 ב 1/800 דילול עבור 15 דקות, ו SSTR212 ב 1/5000 דילול עבור 30 דקות.
- דגירה עם מערכת זיהוי נוגדנים משני עבור 15 דקות עבור anti-SYP ו-CgA כתמים 30 דקות עבור anti-SSTR2 כתמים. צלם תמונות באמצעות מטרה של 400 x.
6. טיפול באורגנואידים של SBNET עם rapamycin
- מתמוסס rapamycin ב DMSO כדי להשיג פתרון 10 מ"מ במניה.
- הכן מדיום תרבות SBNET עם DMSO (למשל, 1 מ ל של SBNET בינוני בתרבות + 1 μL של DMSO) ו SBNET בינונית תרבותית עם 10 μM של rapamycin (g., 1 מ ל של SBNET התרבות בינונית + 1 μL של 10 מ"מ מניות rapamycin פתרון).
- העבר 200 μL מדיה עם מדיום תרבות SBNET עם DMSO או 10 μM rapamycin כדי לתרבויות SBNET ספרוoid.
- המשך 5 ימים בחממה 37 ° c.
- הוסף 1 μM של אתידיום הומדימר ו-דגירה עבור 30 דקות. להסיר את המדיום המכיל את ההומואידייום, לשטוף עם 200 μL של PBS, ולהעביר 200 μL של PBS לכל טוב.
- קח תמונות מיקרוסקופית של SBNET הספרואידים עם ובלי טיפול תרופתי באמצעות קוביית מסנן אדום עם 10x, 20x, או 40x מטרות של מיקרוסקופ פלורסנט.
הערה: תאים מתים המוכתמים עם אתידיום הומודימר מופיע כאדום באמצעות קוביית הפילטר האדום G של מיקרוסקופ זמין מסחרית (טבלת חומרים). לחלופין, ניתן ללכוד את האות באמצעות ספקטרוסקופיה ב 535 העירור ננומטר ו 624 פליטת nm.
7. פיצול מזהי SBNET
הערה: הדבר נעשה עבור הרחבה ושיתוף עם חוקרים אחרים.
- השתמש בפיפטה P1000 כדי לשבור מכנית את ECM ומתיז את ECM עם מזהי SBNET לצינור 1.5 mL סטרילי.
- צנטריפוגה ב 1,000 x g ב 4 ° c, להסיר את כל supernatant ולמקם את הצינור על הקרח.
- הוסף 2-4x את הנפח של ECM חדש לתוך הגלולה. מערבבים את ECM החדשה עם מזהי ECM ו-SBNET הישנים על ידי ליטוף למעלה ולמטה 10x. הימנעות היכרות בועות אוויר.
- העבר 5-20 μL של התערובת של ECM ו-SBNET לצלחת חדשה ומאפשרים לחזק את ECM.
- לכסות עם בינוני SBNET חדש ולהעביר לחממה. שיעור ההחלמה הוא כ 95 עד 100%.
- עבור משלוח SBNET spheroids למעבדה אחרת, העבר SBNET spheroids עם ECM חדש T25 תרמוס ולאפשר ECM לגבש.
- מלא את הבקבוקון T25 עם מדיום ספרואיד בינונית, לעזאזל על המכסה הדוק, ולהכין חבילת משלוח.
- עם קבלת תרבות SBNET ספרואיד, להסיר את בינוני התרבות ולבצע צעד 7.1 כדי 7.5 לשים בחזרה בתוך התרבות SBNET.
8. קריואחסון והתאוששות של SBNET הספרואידים
- העבר את מזהי SBNET באמצעות 5-10 בארות קטנות עד לשפופרת של 15 מ ל. צנטריפוגה ב 500 x g עבור 15 דקות ב 4 ° c, הסר supernatant, השהה מחדש בינוני בהקפאה (90% fbs + 10% dmso), לאחסן בתא הקפאה מכולה, ולמקם את זה ב-80 ° c.
- העבר לחנקן הנוזלי לאחסון ארוך יותר.
- כדי לשחזר SBNET spheroids, למקם את הבקבוקון קפוא על הקרח ולחכות עד התוכן הוא הופכה לחלוטין. להפוך את הצינור ולמקם מחדש על קרח כדי להאיץ את תהליך הפשרה.
- לאחר המדגם הוא מופקר, ממוקם בתוך צנטריפוגה טרום מקורר ספין ב 1,000 x g עבור 10 דקות.
- הסר את הסופרנטאנט והשהה מחדש את הספרואידים ב-ECM. שמור את השפופרת על הקרח, להעביר 20 μL לצלחת חדשה, ולחכות ECM לגבש.
- העבר 200 μL של מדיום תרבות SBNET עם 10 μM של מעכבי סלע (Y-27632)13 והעברה לחממה.
- אפשר מזהי SBNET כדי להתאושש ולצמוח במשך שבוע אחד. הסר את מדיום התרבות הישנה, לחדש עם 200 μL של מדיום התרבות SBNET ולחזור לחממה.
- אפשר לבקרי SBNET להמשיך לצמוח.
הערה: זה לוקח לפחות 1 שבוע עבור spheroids הגוברת במהירות כדי להתחיל להתאושש לאחר הקפאת ההזמנה13. SBNET הספרואידים לקחת לפחות 2-4 שבועות כדי להתחיל לגדול. תאי SBNET רבים ימותו בתוך 2 השבועות הראשונים ושיעור ההישרדות הוא פחות מ -10%. מאחר שזהו תהליך התשואה מאוד ארוך ונמוך, עדיף לשתף עם חוקרים אחרים SBNET spheroids במבחנות תרבות (כפי שמתואר בשלב 7). קריואחסון והתאוששות צריך לשמש רק כתוכנית גיבוי במקרה של זיהום חיידקי מתרחשת.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
יש כרגע רק 2 sbnet שורות תא שהוקמו ופורסמו2,3,4,5 והם לא זמינים לחוקרים רבים. כאן, אנו מציעים תרבות SBNET כמו spheroids ב ECM ולהשתמש בזה כמודל אלטרנטיבי לחקור את רגישות התרופה SBNET. החולה-נגזר הגידול מתוך SBNET כי גרורות לכבד נאסף, מתעכל לשחרר את התאים SBNET, מעורבב עם ECM נוזלי להקמת תרבות SBNET ספרוoid (איור 1א). קי-67 של SBNET זה היה 4.3%. למרות מזהי SBNET בעלי קצב גדילה איטי, ניתן לנטר את התפתחותם על ידי דימותמיקרוסקופי(איור 1א). זה לוקח בערך 14 ימים עבור SBNET spheroids כפול בגודל כאשר מדיית התרבות משתנה פעם בשבוע (איור 1B). לאחר 14 ימים בתרבות, הספרואידים של SBNET אינם גדלים בגודלם. במקום זאת, תאים מסוימים של SBNET לא יעכבו את המיקום השכן ויוצרים מזהים חדשים. כדי להפיץ את תרבות SBNET spheroids, לקצור את ה-ECM המכילה מזהי SBNET ולשחזר אותם בלוח תרבות חדש עם מדיום תרבות חדשה (שלב 7).
כדי לאשר כי התרבויות האורגנואיד מכילות תאים SBNET, אנו מתארים שיטה פשוטה ומהירה להכתים את הספרואידים עבור סמני SBNET כגון synaptophysin, כרומוגראין A, ואת סוג הקולטן הסומטוסטטין 2 (SSTR2) באמצעות מיקרוסקופ immunofluorescence ( שלב 4). באמצעות נוגדנים ספציפיים נגד synaptophysin, כchromogranin A ו SSTR2, הנתונים שלנו IF הראו כי סמנים אלה הם מותאמים בציטופלסמה ובקרום של SBNET תאים (איור 2A, בירוק) אחרי 1 או 9 חודשים בתרבות (Figure 2b ). כדי להבטיח את הספציפיות של syp, cga ו SSTR2 נוגדנים, ביצעת את ההליכים כתמים זהה על קו אורגנואיד מגידול בלבלב שאינו מבטא syp, cga או SSTR2 (איור 2ג) כמו אות ירוק לא זוהה. היתרון העיקרי של הניסוי הזה SBNET ספרואיד אם הוא שניתן לבצע בתוך 4 h ונותן מידע דומה מכתים כמו האימונוהיסטוכימיה (IHC; איור 3). אנו מספקים פרוטוקול לביצוע IHC של מזהי SBNET בשלב 5.
השיטה היא טכניקה רבת-ערך לזיהוי תרופות שיכולות לעכב את צמיחת SBNET. כהוכחה לעקרון, התייחסו ל-SBNET spheroids עם rapamycin במשך 5 ימים, מעכב mTOR, מחלקה של תרופות המשמשות בדרך כלל לטיפול בנטס8. בהשוואה לשליטה שלנו SBNET ספרואיד, rapamycin טיפל ספרואיד יצרו מבנה דמוי ענבים והפך האפוטוטיק או נקרוטיק (איור 4א-ד). תאים גוססים ניתן להבחין באמצעות אתידיום הומודימר כדי להכתים DNA ו-RNA וליצור סימן אדום בהיר14. הצבע הזה לא יכול לחדור. לקרום התא של תאים חיים
איור 1: מטופל-נגזר המעי הקטן גידולים נוירואנדוקרינים (sbnets) גדל בתוך מטריצה החילוץ (ecm) כמו spheroids. (א) בידוד של תאים סרטניים מתוך sbnets מחדש ולשים בתרבות על ידי ערבוב עם ecm. סרגל שינוי קנה מידה מייצג 100 μm. (ב) אזור פני שטח של sbnet spheroids ביחס למספר הימים של התרבות המוכמת באמצעות imagej. הנתונים הושגו מתוך SBNET spheroids של 1 מטופל מיוצגים באזור ממוצע ± השגיאה הסטנדרטית של הממוצע. שטח הפני של 30 כדי 60 spheroids נמדדו עבור כל נקודת זמן. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.
איור 2: מאימונולואוורנציה (IF) מכתים של sbnet הספרואידים. אם צביעת הספרואידים של SBNET לאחר (A) 1 חודש בתרבות ו-(ב) 9 חודשים בתרבות. (ג) אם צביעת של אורגנואידים גידול לבלב שאינם מבטאים סמני sbnet כפקדים שליליים. Spheroids הגידול היו קבועים 4% פאראפורמלדהיד ומוכתם באמצעות נוגדנים נגד synaptophysin (SYP) ב 1/600 דילול, כchromogranin A (CgA) ב 1/400 דילול, ו קולטן סוסטטין 2 (SSTR2) ב 1/400. אם התמונות צולמו ב 100 ms, 200 ms ו 400 ms זמן חשיפה עבור SYP, CgA ו SSTR2 כתמים, בהתאמה באמצעות 10x, 20x או 40x יעדים. סרגל קנה מידה מייצג 50 μm. נא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.
איור 3: אימונוהיסטוכימיה (ihc) כתמים של מזהי sbnet. Formalin-קבוע ו פרפין-מוטבע בסעיפים SBNET מוטבעים החלקים היו מחסומים, מהתייבשות, נחסם ומוכתם עם (א) syp, (ב) cga, ו (ג) SSTR2 נוגדנים. תמונות נלקחו באמצעות מטרה 400x. סרגל קנה מידה מייצג 50 μm. נא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.
איור 4: שימוש ב-sbnet spheroids לבדיקת סמים. (א) תמונת שדה מוארת של בקרי הספרואידים שטופלו ב-dmso במשך 5 ימים. (ב) התייחס לדימוי של sbnet באמצעות ה-dmso והוכתם באתידיום הומודימר (אתידיום H). (ג) בהיר תמונת שדה של sbnet מת מבנה ספרואיד היוצרים לאחר הטיפול עם 10 μm של rapamycin עבור 5 ימים. (ד) מוכתם בsbnet המוכתם עם אתידיום H מופיע כנקודות אדומות. תמונות של הצביעת של אתידיום נלקחו באמצעות קוביית מסנן אדום ב 100 ms זמן חשיפה. סרגל בקנה מידה מייצג 10 μm. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.
| התפתחות מדיה או פתרון | רכב |
| שטיפת בינונית | DMEM המכיל 1% FBS, 1% עט/דלקת, 1% גלוטמין |
| מדיום לתרבות של SBNET | DMEM/F12 + 10% FBS + 1% עט/דלקת + 1% גלוטמין + 10 מילימטר ניטינאמיד + 10 μg/mL אינסולין |
| מאגר נוגדנים | 2.5% סרום אלבומין, 0.1% נתרן עזידה, 25 מ"מ בטריס pH 7.4, 150 mM נתרן כלוריד |
| הקפאה בינונית | 90% FBS + 10% DMSO |
| בידוד תאי גזע אנושי בינוני | DMEM/F12, 1% עט/דלקת, 1% גלוטמקס, 10 מ"מ HEPES, 1/50 B27 מוסף, 1/100 N2 תוספת, 1 מ"מ N-acetylcysteine, 200 ng/mL Rspo 1, 50ng/mL EGF, 100 ng/mL FGF10, 10 מילימטר ניטינאמיד, 10 uM forskolin, 5uM A83-01 |
| תאי גזע הלבלב האדם בידוד בינוני | Dמאמ/F12, 1% עט/דלקת, 1% גלוטמקס, 10 מ"מ HEPES, 1/50 B27, 1/100 N2 תוספת, 1 מ"מ N-acetylcysteine, 200 ng/ml Rspo 1, 25 ng/mL ראש, 50ng/מ"ל EGF, 100 ng/mL FGF10, 10 מילימטר ניטינאמיד, 10 uM forskolin, 5uM A83-01, 3 uM PGE-2 |
. שולחן 1 מדיה צמיחה ופתרון.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
גידולים 3D הגידול הפכו משאב רב ערך עבור בדיקות תרופות טרום קלינית15. הגידול שונים אורגנואיד ביואידים הוקמו לאחרונה מסרטן השד וסרטן הערמונית גידולים16,17. במחקר זה, אנו מספקים פרוטוקול מפורט לתרבות SBNET כמו spheroids ושיטה פשוטה ומהירה כדי לאמת את התרבויות ספרואיד עבור סמנים נטו על ידי immunofluorescence ולבדוק רגישות לסמים. מניסיוננו, הספרואידים של SBNET יכולים לצמוח במדיית תרבות שונים. הם גדלים מעט מהר יותר בתקשורת תא גזע עבור הלבלב האנושי או הכבד בידוד שאנו מותאמים מפרוטוקולים שפורסמו בעבר9. בחרנו לגדל את SBNETs ב-Dמאמ/F12 בינונית בתוספת אינסולין וניטינאמיד כי זה יקר פחות מאשר תא גזע התקשורת. הגדלת אחוז הסרום של השור העוברי היא אסטרטגיה נוספת כדי לקדם את התפתחותם של התרבויות האורגנואיד של SBNET; עם זאת, הדבר יגביר גם את העלות הכוללת לתחזוקת התרבות.
ביצוע כתמים והדמיה עם מיקרוסקופ פלורסנט באמצעות מטרות 10x, 20x או 40x היא שיטה מהירה ופשוטה כדי לבדוק את הביטוי של SBNET סמנים. עם זאת, הוא אינו מספק לוקליזציה מוגדרת היטב בהשוואה ל-IHC (איור 2, איור 3). לדוגמה, הנתונים IF הראו שהלוקליזציה של הממברנה של SSTR2 קשה לזיהוי. אנחנו בעיקר לזהות את cytosolic SSTR2, אשר דווחה בעבר18. כדי לקבל התאמה טובה יותר של החלבונים סמן, אנו ממליצים להשתמש IF ו קונפוקלית יקרוסקופיה. בסך הכל, IF היא שיטה שימושית כדי לאשר במהירות סמנים SBNET. הנוגדנים שלנו (anti-syp, אנטי-cga, anti-SSTR2) לא לחצות את התגובה עם מארגני שליטה שלילית שאינם מבטאים syp, cga, או SSTR2 (איור 2ג) בניסוי IF. ההצעה הזאת היא שאותות הפלורסצנט שזיהינו הם ספציפיים לאתר האינטרנט של SBNET.
כדי להגדיל את התשואה של SBNET spheroids, השלבים הקריטיים של פרוטוקול זה הם במהלך שלב סינון התאים (שלב 2.2) וערבוב SBNET עם ECM נוזלי עבור הציטוט לוחות תרבות רקמות (שלב 2.8). הקפד לכסות את קרום מסננת התא ואת צינור האוסף עם מדיה כדי למנוע את התאים SBNET מדבק הפלסטיק. ECM נוזלי יהיה לחזק במהירות אם לא להציב על הקרח. ודא שיש מיכל קרח קטן במכסה המנוע של הרקמה כדי לשמור על תאים ECM ו-SBNET קר.
המגבלה של טכניקה זו היא שיעור הצמיחה איטי של SBNET הספרואידים. יש לתכנן ניסויים ביעילות ולהימנע משימוש בכמות עודפת של מזהי SBNET. מגבלה נוספת היא ההתאוששות איטית לאחר הקפאת ההפשרה. זה לוקח יותר מחודש 1 לאחר הפשרה עבור הספרואידים SBNET להתחיל לצמוח. כדי להתגבר על מגבלה זו, אנו ממליצים לשמור ברציפות על מזהי SBNET בתרבויות ולפצל אותם לפי הצורך (שלב 7). גם לאחר 9 חודשים בתרבות, הספרואידים SBNET עדיין לשמור על הביטוי של SBNET סמנים (איור 2ב).
למרות תרבות תלת-ממד של SBNET spheroids היא עבודה יותר אינטנסיבית מאשר תרבות דו-ממדית המסורתית של קווי תאים אחרים של סרטן, זה מודל יקר מאוד עבור תרבות מבחנה של SBNET, כי רבים חוקרים SBNET אין גישה קווי התא הקיים. עם פרוטוקול זה, מדענים ומטפלים יכולים להקים תרבויות SBNET ספרואיד מפני גידולים מחדש ולשתף אותם עם מעבדות אחרות. בנוסף, sbnet spheroids יכול לשמש כדי ליצור sbnet מטופל נגזר מודלים של עכבר מבע שתל. באופן כללי, ניתן להתאים את הטכניקות המוצגות לכאן לצורך התאמה, אפיון וביצוע בדיקות סמים של רשתות אחרות כגון רשתות הלבלב או הריאות. שימו לב כי קצב הצמיחה של האורגנואידים ישתנה בין הסוגים השונים של רשתות ודגימות מטופלים.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
. למחברים אין מה לגלות
Acknowledgments
עבודה זו נתמכה על ידי NIH מענקים P50 CA174521 (למען י. י. האו ו-בליצי). P.H. האוזן הוא הנמען של הפרס P50 CA174521 הקריירה תוכנית שיפור.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Anti-rabbit FITC | Jackson ImmunoResearch | 11-095-152 | Secondary antibody couple to a green fluorophore |
| Antigen Retrieval Solution | Agilent Dako | S2367 | Solution at pH 9 for preparing slides for IHC |
| Autostainer Link 48 | Agilent Dako | Not Available | Automated system for antibody staining |
| Cell freezing container | Thermo Scientific | 5100-0001 | Container to for freezing cells |
| CellSence | Olympus | Version 1.18 | Computer software for using fluorescent microscope |
| Chromogranin A antibody | Abcam-45179 | RB-9003-PO | Antibodies for IF |
| Chromogranin A antibody (clone LK2H10) | Thermo Scientific | MA5-13096 | Antibodies for IHC |
| Collagenase | Sigma | C0130 | Enzyme for digesting tumor tissue |
| DMEM | Gibco | 11965-092 | Medium for tissue preparation |
| DMEM/F12 | Gibco | 11320-033 | Medium for organoid cultures |
| DMSO | Sigma | D8418 | Solvent for dissolving drug |
| DNAse | Sigma | DN25 | Enzyme for digesting tumor tissue |
| Ethidium Homodimer | Chemodex | CDX-E0012-T1E | DNA and RNA binding dye |
| FBS | Gibco | 16000044 | Reagent for culture media |
| Fluorescent microscope | Olympus | CKX35 | Microscope for taking pictures of SBENT spheroids |
| Glutamine | Gibco | A2916801 | Reagent for culture media |
| ImageJ | National Institutes of Health | Version 1.51 | Computer software for image analysis |
| Insulin | Sigma | I0516 | Reagent for culture media |
| Matrigel | Corning | 356235 | Matrix to embed and anchore organoids |
| Mounting medium (VECTASHIELD) | Vector Laboratories | H-1200 | Fixative for labelled-cells with a nuclear stain |
| Nicotinamide | Sigma | 72340 | Reagent for culture media |
| Paraformaldehyde | Electron Microscopy Sciences | 15710 | Reagent to fix cells |
| PEN/STREP | Gibco | 15140-122 | Reagent for culture media |
| PT Link | Agilent Dako | Not Available | Automated system to prepare slides for IHC staining |
| Rapamycin | Alfa Aesar | J62473 | Drug that can inhibit NET growth |
| Secondary antibodies for IHC | Agilent Dako | K8000 | Secondary antibodies for IHC using Polymer-based EnVision FLEX system |
| SSTR2 antibody | GeneScritp | A01591 | Antibodies for IF |
| SSTR2 antibody (clone UMB1) | Abcam | ab134152 | Antibodies for IHC |
| Synaptophysin antibody | Abcam | 32127 | Antibodies for IF |
| Synaptophysin antibody (clone DAK-SYNAP) | Agilent Dako | M7315 | Antibodies for IHC |
| TritonX | Mallinckrodt | 3555 KBGE | Reagent to permeablize cells |
| Y-2763 ROCK inhibitor | Adipogen | AG-CR1-3564-M005 | To improve SBNET spheroid viability after freeze thaw |
References
- Maxwell, J. E., Sherman, S. K., Howe, J. R. Translational Diagnostics and Therapeutics in Pancreatic Neuroendocrine Tumors. Clinical Cancer Research. 22, 5022-5029 (2016).
- Pfragner, R., et al. Establishment of a continuous cell line from a human carcinoid of the small intestine (KRJ-I). International Journal of Oncology. 8, 513-520 (1996).
- Kolby, L., et al. A transplantable human carcinoid as model for somatostatin receptor-mediated and amine transporter-mediated radionuclide uptake. American Journal of Pathology. 158, 745-755 (2001).
- Van Buren, G., et al. The development and characterization of a human midgut carcinoid cell line. Clinical Cancer Research. 13, 4704-4712 (2007).
- Pfragner, R., et al. Establishment and characterization of three novel cell lines - P-STS, L-STS, H-STS - derived from a human metastatic midgut carcinoid. Anticancer Research. 29, 1951-1961 (2009).
- Ellis, L. M., Samuel, S., Sceusi, E. Varying opinions on the authenticity of a human midgut carcinoid cell line--letter. Clinical Cancer Research. 16, 5365-5366 (2010).
- Hofving, T., et al. The neuroendocrine phenotype, genomic profile and therapeutic sensitivity of GEPNET cell lines. Endocrine Related Cancer. 25, 367-380 (2018).
- Moreno, A., et al. Antitumor activity of rapamycin and octreotide as single agents or in combination in neuroendocrine tumors. Endocrine Related Cancer. 15, 257-266 (2008).
- Broutier, L., et al. Culture and establishment of self-renewing human and mouse adult liver and pancreas 3D organoids and their genetic manipulation. Nature Protocols. 11, 1724-1743 (2016).
- Saito, Y., et al. Establishment of Patient-Derived Organoids and Drug Screening for Biliary Tract Carcinoma. Cell Reports. 27, 1265-1276 (2019).
- Park, S. J., et al. Detection of bone marrow metastases of neuroblastoma with immunohistochemical staining of CD56, chromogranin A, and synaptophysin. Applied Immunohistochemisty and Molecular Morphology. 18, 348-352 (2010).
- Clifton-Bligh, R. J., et al. Improving diagnosis of tumor-induced osteomalacia with Gallium-68 DOTATATE PET/CT. The Journal of Clinical Endocrinology and Metabolism. 98, 687-694 (2013).
- Clinton, J., McWilliams-Koeppen, P. Initiation, Expansion, and Cryopreservation of Human Primary Tissue-Derived Normal and Diseased Organoids in Embedded Three-Dimensional Culture. Current Protocols in Cell Biology. 82, 66 (2019).
- Markovits, J., Roques, B. P., Le Pecq, J. B. Ethidium dimer: a new reagent for the fluorimetric determination of nucleic acids. Analytical Biochemistry. 94, 259-264 (1979).
- Weeber, F., Ooft, S. N., Dijkstra, K. K., Voest, E. E. Tumor Organoids as a Pre-clinical Cancer Model for Drug Discovery. Cell Chemical Biology. 24, 1092-1100 (2017).
- Sachs, N., et al. A Living Biobank of Breast Cancer Organoids Captures Disease Heterogeneity. Cell. 172, 373-386 (2018).
- Puca, L., et al. Patient derived organoids to model rare prostate cancer phenotypes. Nature Communication. 9, 2404 (2018).
- Singh, S. P., et al. SSTR2-based reporters for assessing gene transfer into non-small cell lung cancer: evaluation using an intrathoracic mouse model. Human Gene Therapy. 22, 55-64 (2011).
