Summary
Нейроэндокринные опухоли (NET) происходят из нейроэндокринных клеток нервного гребня. Они медленно растут и бросают вызов культуре. Мы представляем альтернативную стратегию для выращивания NETs из тонкой кишки, культивируя их как сфероиды. Эти сфероиды имеют маркеры NET тонкой кишки и могут быть использованы для тестирования на наркотики.
Abstract
Опухоли тонкой кишки (SBNETs) являются редкими раковыми заболеваниями, происходящими из энтерохромаффиновых клеток кишечника. Исследования в этой области были ограничены, потому что очень мало пациентов, полученных SBNET клеточных линий были созданы. Хорошо дифференцированные клетки SBNET медленно растут и их трудно размножаться. Несколько установленных клеточных линий не всегда доступны, и через некоторое время в культуре может не продолжать выражать характеристики клеток NET. Создание новых клеточных линий может занять много лет, так как клетки SBNET имеют долгое время удвоения и многие шаги по обогащению необходимы для того, чтобы устранить быстрое разделение связанных с раком фибробластов. Чтобы преодолеть эти ограничения, мы разработали протокол к культуре SBNET клеток из хирургически удаленных опухолей, как сфероиды во внеклеточной матрицы (ECM). ECM образует трехмерную матрицу, которая инкапсулирует клетки SBNET и имитирует микро-среду опухоли, позволяя клеткам SBNET расти. Здесь мы охарактеризовали темпы роста сфероидов SBNET и описали методы выявления маркеров SBNET с помощью иммунофлюоресценциальной микроскопии и иммуногистохимии, чтобы подтвердить, что сфероиды являются нейроэндокринными опухолевыми клетками. Кроме того, мы использовали сфероиды SBNET для тестирования цитотоксичности рапамицина.
Introduction
Опухоли тонкой кишки нейроэндокринных (SBNETs) происходят из энтерохромаффина клеток тонкой кишки. Хотя SBNETs, как известно, растут медленно, они обычно метастазируют в печень1. Хотя хирургическое удаление или абляция опухоли может быть рассмотренво во многих случаях, рецидив почти универсальный, и, следовательно, медицинская терапия играет важную роль в управлении. Огромные усилия были вложены для создания новых линий клеток SBNET для тестирования на наркотики. Однако успеха получило очень мало. Только 6 сотовых линий SBNET (KRJ-I, CND2, GOT1, P-STS, L-STS, H-STS) были зарегистрированы2,3,4,5; и, к сожалению, одна клеточная линия больше не выражает NET маркеры6 и три других SBNET клеточных линий (KRJ-I, L-STS, H-STS) были определены, чтобы быть производным от преобразованных лимфобластов вместо NETs7. Для ускорения выявления лекарств для таргетирования СБНЕТ необходимы альтернативные методы тестирования на наркотики in vitro.
Здесь мы пользуемся наличием резецированных SBNETs и создали способ культуры этих пациентов полученных SBNETs как сфероиды, растущие в ECM. Общая цель этой рукописи заключается в описании метода культуры SBNET как трехмерной (3D) культуры и наброски процедур для характеристики этих сфероидов для удержания маркеров SBNET путем обертывания иммунофлюоресценции и иммуногистохимии.
Кроме того, мы демонстрируем, как эти сфероиды SBNET могут быть использованы для тестирования эффекта рапамицина, противоракового препарата для NETs8. Обоснованием этого протокола является разработка нового метода для выращивания клеток SBNET in vitro и их использования для тестирования на наркотики. Преимущество этого метода по сравнению с традиционным методом создания клеточной линии SBNET заключается в том, что 3D культуры SBNETs могут быть быстро получены и тестирование на наркотики может быть сделано в течение 3 недель. Сфероиды SBNET потенциально могут быть использованы в качестве модели для выполнения экранов в пробирке наркотиков для выявления новых препаратов для пациентов SBNET. Поскольку линии клеток SBNET не являются широко доступными, 3D культуры сфероидов SBNET могут служить новой моделью in vitro для изучения SBNETs и могут быть распространены среди ученых в этой области.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Все эксперименты с использованием образцов нейроэндокринной опухоли человека были одобрены комитетом больницы и клиник Университета Айовы (Протокол No 199911057). Список всех материалов и оборудования описан в таблице материалов. Список медиа-медиа роста и ключевых решений можно найти в таблице 1.
1. Небольшая нейроэндокривая опухоль кишечника (SBNET) сбор и диссоциация клеток
- Получить резектые образцы пациента SBNET после подтверждения опухолевых тканей от хирургической патологии core.
- Разрежьте SBNET s на 5 мм кубиками и храните в 25 мл среды DMEM/F12 в конической трубке для транспортировки в лабораторию.
- Передача опухолей в DMEM, содержащий 1% FBS, 1% пенициллина / стрептомицина (Pen/Strep), 1% глутамина (Wash Medium) и инкубировать в этом мочевом среднем в течение 15 мин.
- Перенесите опухоли в новое блюдо и фарш опухоли менее 1 мм штук с помощью стерильных изогнутых ножниц.
- Перенесите измельченные ткани в новую трубку 50 мл, содержащую 25 мл стиральной среды.
- Центрифуги образца на 500 х г в течение 15 мин при 4 градусах Цельсия.
- Откажитесь от супернатанта и отбросите гранулы в 10 мл стиральной среды, содержащей коллагеназу (100 U/mL) и DNase (0,1 мг/мл).
- Разрешить пищеварение фарш опухоли происходят в инкубаторе 37 градусов с медленной тряски (50 об/мин) для 1,5 ч.
2. Культура SBNETs как опухолевые сфероиды в ECM
- После завершения пищеварения (шаг 1.8), центрифуга при 500 х г в течение 15 мин при 4 градусах Цельсия, отбросить супернатант и повторно заткнить гранулы в 15 мл Wash Medium.
- Поместите 70 мкм ячейки ситечко на вершине новой трубки 50 мл и передачи 10 мл мыть яйцы medium над ячейкой ситечко. Swirl Wash Medium, чтобы покрыть сторону пластиковой трубки, чтобы предотвратить прилипание net клеток к стороне пластиковой трубки.
- Фильтр клеточной подвески через клеточный ситечко.
- Центрифуга при 500 х г в течение 15 мин при 4 градусах По Цельсию, отбросьте супернатант, отбросьте гранулы в 200 л стиральной среды (общий объем составляет 250 градусов по Цельсию) и поместите его на лед.
- Передача 5 злителков на 500 л стиральной среды (коэффициент разбавления 1/100). Используйте разбавленные клетки для подсчета клеток с помощью гемоситометра, чтобы получить количество клеток на миллилитр. Умножьте на 100, чтобы исправить фактор разбавления.
- Умножьте количество ячеек на мл, полученных в шаге 2,5, на общий объем клеток в подвеске, полученных в шаге 2.4 (250 л).
- Центрифуга при 500 х г в течение 15 мин при 4 градусах По Цельсию, отбросить супернатант, и resuspend клеток в жидком ECM (1 х 106 клеток / мл) и держать на льду.
- Перенесите 5-20 л сфероидов SBNET в ECM в 96-хорошую пластину и дайте жидкости ECM затвердеть, поместив пластину в инкубатор 37 градусов по Цельсию в течение 5 мин.
- Добавьте 200 кЛ культуры SBNET (DMEM/F12 , 10% FBS , 1% PEN/STREP - 1% глутамина no 10 мМ никотинамида, 10 мкм инсулина) к каждой скважине 96-хорошей пластины, содержащей сфероиды SBNET в ECM.
- Кроме того, культура SBNET органоидов в стволовых клеток средств, аналогичныхтому, что ранее было описано для выращивания либо человеческой печени или поджелудочной железы органоидов9 и перечислены в таблице материалов .
- Меняйте носители каждые 5-7 дней.
3. Количественная оценка размера сфероидов SBNET с использованием ImageJ
- Возьмите 5-10 фотографий сфероидов SBNET на 1, 4, 7, 14, 23 и 97 культуры с использованием 10x цели.
- Откройте сохраненные изображения в ImageJ. Перейдите на вкладку «Анализ», выберите опцию Set Measurements и разместите чек на опции Area.
- Используйте инструмент овального выбора из панели инструментов для создания эллипсоида или круг вокруг хорошо сфокусированного сфероида.
- Перейдите на вкладку «Анализ» и выберите опцию «Мера». Повторите шаги 3.4 и 3.5 для того, чтобы получить измерение области от 25-50 сфероидов SBNET. Значения приведены в квадрате пикселей.
- Преобразуйте область пикселей домм 2, разделив размер каждого пикселя с длиной каждого пикселя на коэффициент преобразования микроскопических изображений.
ПРИМЕЧАНИЕ: SBNET клетки растут в основном как сфероиды и когда-то, как эллипсоиды.
4. Характеристика сфероидов SBNETS с помощью иммунофлюоресценции
- Перенесите органоиды, выращенные в ECM, в трубку 1,5 мл с помощью пипетки P1000.
- Центрифуга при 1500 х г в течение 1 мин и удалить супернатант.
- Вымойте органоидную культуру, добавив 1 мл PBS, перемешайте, центрифугу при 1500 х г в течение 1 мин и удалите супернатант.
- Зафиксировать органоиды, добавив 500 л параформальдегида и инкубировать в течение 15 мин.
- Вымойте культуру дважды с 1 мл PBS.
- Permeabilize культуры, добавив 500 л PBS 3% BSA 0,1% Тритон X 100 в течение 5 мин.
- Затем мыть в течение трех раз с 1 мл PBS и 3% BSA.
- Инкубировать на 1 ч с первичными антителами против синаптофизина (SYP)10 при 1/600 разбавления или хромогранина A (CGA)11 и рецепторе соматостатина 2 (SSTR2)12 при 1/400 разбавления в буфере антител (2,5% крупного сыворотки альбумина, 0,1% азид, 25 мм Tris pH 7.4, 150 мМ хлорид натрия).
ПРИМЕЧАНИЕ: Используйте 300 зл и более раствора антител на трубку. - Вымойте три раза с 1 мл PBS и 3% BSA.
- Инкубировать вторичными антителами в сочетании с FITC при 1/500 разбавления в буфере антител в течение 1 ч. Используйте 300 л или более антитела раствора на трубку.
- Вымойте 3 раза с 1 мл PBS и 3% BSA. Убедитесь в том, чтобы аспирировать и отказаться от всех супернатант.
- Добавьте 5 злмонтажа среды, содержащей ядерное пятно DAPI.
- Используйте пипетку P20 для передачи 5 зЛ сфероидов SBNET со ступени 4.12 на стеклянную горку и печать с крышкой скольжения.
- Сфотографруй с помощью флуоресцентного микроскопа с помощью 10x, 20x или 40x целей.
5. Характеристика сфероидов SBNET иммуногистохимией (IHC)
- Перенесите сфероиды SBNET из культуры в трубку 1,5 мл с помощью пипетки P1000.
- Центрифуга при 1500 х г в течение 1 мин и удалить супернатант.
- Исправить Сфероиды SBNET, добавив 500 л 10% формалина в трубку от шага 5.2 и инкубировать при комнатной температуре в течение 2-5 дней до встраивания парафина и сократить 4 мкм толщиной сфероидов разделов.
- Депарафинизацию, регидратацию и использование теплового эпитопа поиска в Антигена Поиск решение при pH 9 путем нагрева до 97 градусов по Цельсию в течение 20 минут с помощью 3-в-1 автоматизированной станции обработки слайдов для подготовки слайдов для инкубации антител.
- Блок слайды и инкубировать с первичными антителами против SYP10 на 1/100 разбавления в течение 15 минут, CgA11 на 1/800 разбавления в течение 15 минут, и SSTR212 на 1/ 5,000 разбавления в течение 30 минут.
- Инкубировать с вторичной системой обнаружения антител в течение 15 минут для анти-SYP и CGA окрашивания и 30 минут для анти-SSTR2 окрашивания. Сфотографируйте с помощью 400x цели.
6. Лечение органоидов SBNET с рапамицином
- Растворите рапамицин в DMSO, чтобы получить решение запаса 10 мМ.
- Подготовьте среду культуры SBNET с DMSO (например, 1 мл культуры SBNET среднего - 1 л DMSO) и среду культуры SBNET с 10 мкм рапамицина (например, 1 мл культуры SBNET среднего - 1 л 10 мМ рапамицина складского раствора).
- Передача 200 мультимедиа с культурой SBNET со средой культуры СМСО или 10 мкм рапамицин в сфероидные культуры SBNET.
- Инкубировать сфероиды SBNET в течение 5 дней в инкубаторе 37 градусов по Цельсию.
- Добавьте 1 мкм имхидия-омодимера и инкубировать в течение 30 мин. Удалите среду, содержащую гомидий, промойте с 200 зл. PbS, и перенесите 200 Л ПБС на каждую скважину.
- Возьмите микроскопические изображения сфероидов SBNET с помощью и без медикаментозного лечения с помощью красного куба фильтра с 10x, 20x или 40x целей флуоресцентного микроскопа.
ПРИМЕЧАНИЕ: Мертвые клетки, окрашенные в него, появляются красным цветом, используя красный куб фильтра G коммерчески доступного микроскопа(Таблица материалов). Кроме того, сигнал может быть захвачен с помощью спектрофотометра при возбуждении 535 нм и 624 нм эмиссии.
7. Расщепление сфероидов SBNET
ПРИМЕЧАНИЕ: Это делается для расширения и для обмена с другими исследователями.
- Используйте пипетку P1000, чтобы механически сломать ECM и аспирировать ECM с сфероидами SBNET к стерильной трубке 1,5 мл.
- Центрифуга при 1000 х г при 4 градусах Цельсия, удалите все супернатанты и поместите трубку на лед.
- Добавьте в гранулы 2-4 x объема нового ECM. Смешайте новый ECM со старыми ECM и SBNET сфероидов труба вверх и вниз 10x. Как избежать введения пузырьков воздуха.
- Передача 5-20 л смеси сфероидов ECM и SBNET на новую пластину и дайте ECM затвердеть.
- Накрыть новым средством SBNET и перевести в инкубатор. Скорость восстановления составляет примерно от 95 до 100%.
- Для доставки сфероидов SBNET в другую лабораторию перенесите сфероиды SBNET с новым ECM на колбу T25 и дайте ECM затвердеть.
- Заполните флягу T25 сфероидной средой SBNET, плотно завинчите крышку и подготовьте пакет груза.
- После получения сфероидной культуры SBNET удалите среду культуры и выполните шаг 7.1 до 7.5, чтобы вернуть сфероиды SBNET в культуру.
8. Криохранилище и восстановление сфероидов SBNET
- Перенос сфероидов SBNET из 5-10 небольших скважин в трубку 15 мл. Центрифуга при температуре 500 х г в течение 15 мин при температуре 4 градуса Цельсия, удалите супернатант, отдохните в морозильной среде (90% FBS и 10% DMSO), храните в контейнере для замораживания ячеек и поместите это при -80 градусов по Цельсию.
- Передача в жидкий азот для более длительного хранения.
- Чтобы восстановить сфероиды SBNET, поместите замороженный флакон на лед и подождите, пока содержимое полностью разморозится. Переворачивайте трубку и повторно поместите на лед, чтобы ускорить процесс оттаивания.
- После того, как образец размораживаются, помещается внутри предварительно охлажденной центрифуги и спина на 1000 х г в течение 10 минут.
- Удалите супернатант и повторно сфероиды в ECM. Держите трубку на льду, перенесите 20 л на новую пластину и подождите, пока ECM затвердеет.
- Передача 200 зл и номинала культуры SBNET с 10 мкм ингибитора ROCK (Y-27632)13 и передача в инкубатор.
- Разрешить SBNET сфероидов, чтобы восстановить и расти в течение 1 недели. Удалите старую культурную среду, пополнить с 200 Зл культуры среды SBNET и вернуться в инкубатор.
- Разрешить SBNET сфероидов продолжать расти.
ПРИМЕЧАНИЕ: Это занимает по крайней мере 1 неделю для быстро растущих сфероидов, чтобы начать восстанавливаться после криоконсервации13. SBNET сфероидов занять как минимум 2-4 недель, чтобы начать расти. Многие клетки SBNET умрут в течение первых 2 недель, а выживаемость составляет менее 10%. Так как это очень трудоемкий и низкий процесс выхода, лучше поделиться с другими исследователями SBNET сфероидов в культуре фляги (как описано в шаге 7). Криохранилище и восстановление должны использоваться только в качестве резервного плана в случае бактериального загрязнения происходит.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Есть в настоящее время только 2 SBNET клеточных линий, установленных и опубликованных2,3,4,5, и они не легко доступны для многих исследователей. Здесь мы предлагаем культуре SBNET в качестве сфероидов в ECM и использовать его в качестве альтернативной модели для изучения чувствительности препарата SBNET. Опухоли, полученные из SBNET, что метастазы в печень была собрана, переваривается, чтобы освободить клетки SBNET, и смешивается с жидкостью ECM для создания сфероидов культуры SBNET (Рисунок 1A). Ки-67 этого SBNET составил 4,3%. Хотя сфероиды SBNET имеют медленные темпы роста, их рост можно контролировать с помощью микроскопической визуализации(рисунок 1А). Это занимает около 14 дней для SBNET сфероидов удвоить размер, когда культура средств массовой информации меняется один раз в неделю(рисунок 1B). После 14 дней в культуре, Сфероиды SBNET не увеличиваются в размерах. Вместо этого некоторые ячейки SBNET будут отделяться от соседнего местоположения и образуют новые сфероиды. Чтобы размразить культуру сфероидов SBNET, собирай ECM, содержащий сфероиды SBNET, и пересаживих их в новую культурную плиту с новой культурой среды (Шаг 7).
Чтобы подтвердить, что органоидные культуры содержат клетки SBNET, мы описываем простой и быстрый метод окрашивания сфероидов для маркеров SBNET, таких как синаптофизин, хромогранин А и рецептор соматостатина типа 2 (SSTR2) с использованием иммунофлюоресценции (ИФ) микроскопии ( Шаг 4). Использование антител, специфических против синаптофизина, хромогранина А и SSTR2, наши данные IF показали, что эти маркеры локализованы в цитоплазме и в мембране клеток SBNET(рисунок 2A, зеленый) после 1 или 9 месяцев в культуре (Figure 2B ). Для обеспечения специфичности антител SYP, CgA и SSTR2, мы выполнили те же процедуры окрашивания на органоидной линии от опухоли поджелудочной железы, которая не выражает SYP, CgA или SSTR2 (Рисунок 2C), как не зеленый сигнал был обнаружен. Основным преимуществом этого эксперимента SBNET spheroid IF является то, что он может быть выполнен в течение 4 ч и дает аналогичную информацию оокрашивании, как иммуногистохимия (IHC; Рисунок 3). Мы предоставляем протокол для выполнения IHC сфероидов SBNET в шаге 5.
Культивирование SBNET как сфероидов является ценным методом для выявления препаратов, которые могут препятствовать росту SBNET. В качестве доказательства принципа, мы относились SBNET сфероидов с рапамицином в течение 5 дней, ингибитор mTOR, класс препаратов, обычно используемых для лечения NETs8. По сравнению с нашим контролем SBNET сфероид, рапамицин-обработанные сфероид формируется винограда, как структура и стал апоптотической или некротической(Рисунок 4A-D). Умирающие клетки могут быть обнаружены с помощью Ethidium гомодимер для окрашивание ДНК и РНК и генерировать ярко-красный сигнал14. Этот краситель не может проникнуть в клеточную мембрану живых клеток.
Рисунок 1: Пациент полученных тонкой кишки нейроэндокринных опухолей (SBNETs), выращенных в внеклеточной матрицы (ECM) в качестве сфероидов. (A) Изоляция опухолевых клеток от резеченного SBNET и положить в культуру путем смешивания с ECM. Шкала бар представляет 100 мкм. (B) Поверхность области SBNET сфероидов по отношению к количеству дней в культуре количественно с помощью ImageJ. Данные были получены из сфероидов SBNET 1 пациента и представлены как средняя область - стандартная ошибка среднего. Площадь поверхности от 30 до 60 сфероидов были измерены для каждой точки времени. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой цифры.
Рисунок 2: Иммунофлуоресценция (IF) окрашивание сфероидов SBNET. ЕСЛИ окрашивание сфероидов SBNET после (A) 1 месяц в культуре и (B) 9 месяцев в культуре. (C) ЕСЛИ окрашивание органоидов опухоли поджелудочной железы, которые не выражают маркеры SBNET как отрицательный контроль. Опухолевые сфероиды были зафиксированы в 4% параформальдегида и окрашены с помощью антител против синаптофизина (SYP) при 1/600 разбавления, хромогранина А (CGA) при 1/400 разбавления, и рецептора соматостатина 2 (SSTR2) при 1/400. ЕСЛИ изображения были приняты на 100 мс, 200 мс и 400 мс время экспозиции для SYP, CgA и SSTR2 окрашивания, соответственно, используя 10x, 20x или 40x целей. Панель шкалы составляет 50 мкм. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой цифры.
Рисунок 3: Иммуногистохимия (IHC) окрашивание сферои SBNET. Формалин фиксированной и парафина встроенных Сфероидов sBNET разделы были депарафафинизированы, регидратированных, заблокированы и окрашенные с (A) SYP, (B) CgA, и (C) SSTR2 антител. Изображения были сделаны с использованием цели 400x. Панель шкалы составляет 50 мкм. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой цифры.
Рисунок 4: Использование сфероидов SBNET для тестирования на наркотики. (A) Яркое поле изображение сфероидов SBNET, обработанных DMSO в течение 5 дней. (B) Изображение сфероидов SBNET, обработанных DMSO и окрашенных с ethidium гомодимер (Ethidium H). (C) Яркое поле изображение мертвого СбНЕТ сфероида формирования винограда, как структура после лечения с 10 мкм рапамицина в течение 5 дней. (D) Мертвые Сфероид SBNET окрашенных Ethidium H появляется как красные точки. Изображения Ethidium H окрашивания были приняты с использованием красного куба фильтра на 100 мс время экспозиции. Панель шкалы составляет 10 мкм. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой цифры.
| Медиа или решение роста | Состав |
| Стиральная средняя | DMEM, содержащий 1% FBS, 1% PEN/STREP, 1% глутамин |
| Среда культуры SBNET | DMEM/F12 - 10% FBS - 1% ПЕН/СТРЕП - 1% Глутамин , 10 мМ никотинамид - 10 мкг/мл инсулина |
| Буфер антител | 2,5% бычьего сывороточки альбумина, 0,1% азида натрия, 25 мМ Tris pH 7.4, 150 мМ хлорид натрия |
| Замораживание среды | 90% FBS и 10% DMSO |
| Средняя изоляция стволовой клетки печени человека | DMEM/F12 , 1% Pen/Strep, 1% GlutaMAX, 10 mM HEPES, 1/50 B27 Дополнение, 1/100 N2 Дополнение, 1 мМ N-ацетилцистеин, 200 нг/мЛ Rspo 1, 50ng/mL EGF, 100 нг/мЛ FGF10, 10 мМ никотинадида, 10 uM для |
| Человеческая среда изоляции стволовых клеток поджелудочной железы | DMEM/F12 , 1% Pen/Strep, 1% GlutaMAX, 10 mM HEPES, 1/50 B27 Дополнение, 1/100 N2 Дополнение, 1 мМ N-ацетилцистеин, 200 нг/мЛ Rspo 1, 25 нг/мЛ Ноггин, 50ng/mL EGF, 100 нг/мЛ FGF10, 10 мм никотинамид, 10 мм форсколин, 5UM A83-01, пГЭ-2 |
Таблица 1. Список медиа-медиа и решения роста.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Опухолевые 3D культуры стали ценным ресурсом для доклинического тестирования нанаркотики 15. Различные опухолевые органоидные биобанки недавно были созданы из рака молочной железы и опухолей рака предстательной железы16,17. В этом исследовании мы предоставляем подробный протокол к культуре SBNET в качестве сфероидов и простой и быстрый метод проверки сфероидных культур для net маркеров иммунофлуоресценции и чувствительности теста наркотиков. Из нашего опыта, Сфероиды SBNET могут расти в различных средствах массовой информации культуры. Они растут немного быстрее в стволовых клеток средств для поджелудочной железы человека или изоляции печени, которые мы адаптировали из ранее опубликованных протоколов9. Мы решили выращивать SBNETs в dMEM/F12 среде, дополненной инсулином и никотинамидом, потому что это дешевле, чем средства стволовых клеток. Увеличение доли сыворотки крупного рогатого скота является еще одной стратегией для содействия росту культур SBNET органоидов; однако это также приведет к увеличению общих расходов на содержание культуры.
Выполнение IF окрашивания и визуализации с флуоресцентной микроскопии с использованием 10x, 20x или 40x целей является быстрым и простым методом для проверки выражения Маркеры SBNET. Тем не менее, это не дает четко определенной локализации по сравнению с IHC(рисунок 2, Рисунок 3). Например, данные АИФ показали, что мембранную локализацию SSTR2 трудно обнаружить. В основном мы обнаруживаем цитосолик SSTR2, о котором ранее сообщалось18. Для лучшей локализации маркерных белков мы рекомендуем использовать IF и конфокальную микроскопию. В целом, IF является полезным методом для быстрого подтверждения маркеров SBNET. Наши антитела (анти-SYP, anti-CgA, anti-SSTR2) не перекрестно реагировали с отрицательными органоидами управления которые не выражают SYP, CgA, или SSTR2 (Рисунок 2C) в эксперименте IF. Это предположение, что флуоресцентные сигналы, которые мы обнаружили, специфичны для сфероидов SBNET.
Для повышения урожайности сфероидов SBNET, критические шаги этого протокола находятся на этапе фильтрации клеток (шаг 2.2) и смешивании SBNET с жидким ECM для алицитирования в пластины культуры тканей (шаг 2.8). Убедитесь в том, чтобы покрыть мембрану ситечко клетки и трубку сбора со средствами массовой информации, с тем чтобы предотвратить SBNET клетки от прилипания к пластику. Liquid ECM быстро затвердеет, если не помещается на лед. Убедитесь в том, чтобы иметь небольшой контейнер льда в ткани культуры капот для того, чтобы сохранить ECM и SBNET клеток холодно.
Ограничением этого метода является медленный темп роста сфероидов SBNET. Эксперименты должны быть спланированы эффективно и избегать использования избыточного количества сфероидов SBNET. Другим ограничением является медленное восстановление после замораживания оттепели. Это занимает более 1 месяца после оттаивания для сфероидов SBNET, чтобы начать расти. Чтобы преодолеть это ограничение, мы предлагаем постоянно поддерживать сфероиды SBNET в культурах и расщеплять их по мере необходимости (шаг 7). Даже после 9 месяцев в культуре, Сфероиды SBNET по-прежнему поддерживать выражение маркеров SBNET(Рисунок 2B).
Хотя 3D культура сфероидов SBNET более трудоемкая, чем традиционная 2D-культура других линий раковых клеток, она является чрезвычайно ценной моделью для культуры in vitro SBNET, потому что многие исследователи SBNET не имеют доступа к существующим клеточным линиям. С помощью этого протокола ученые и клиницисты могут создавать сфероидные культуры SBNET из резецированных опухолей и делиться ими с другими лабораториями. Кроме того, сфероиды SBNET потенциально могут быть использованы для создания моделей мыши SBNET, полученных от пациента. В целом, методы, представленные здесь могут быть адаптированы для культивирования, характеристики и выполнения тестирования на наркотики других NETs, таких как поджелудочная железа или легких NETs. Обратите внимание, что темпы роста органоидов будет варьироваться между различными типами NET s и образцов пациента.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Авторам нечего раскрывать.
Acknowledgments
Эта работа была поддержана NIH грантов P50 CA174521 (J.R. Хоу и А. М. Bellizzi). P.H. Ear является получателем премии P50 CA174521 по улучшению карьеры.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Anti-rabbit FITC | Jackson ImmunoResearch | 11-095-152 | Secondary antibody couple to a green fluorophore |
| Antigen Retrieval Solution | Agilent Dako | S2367 | Solution at pH 9 for preparing slides for IHC |
| Autostainer Link 48 | Agilent Dako | Not Available | Automated system for antibody staining |
| Cell freezing container | Thermo Scientific | 5100-0001 | Container to for freezing cells |
| CellSence | Olympus | Version 1.18 | Computer software for using fluorescent microscope |
| Chromogranin A antibody | Abcam-45179 | RB-9003-PO | Antibodies for IF |
| Chromogranin A antibody (clone LK2H10) | Thermo Scientific | MA5-13096 | Antibodies for IHC |
| Collagenase | Sigma | C0130 | Enzyme for digesting tumor tissue |
| DMEM | Gibco | 11965-092 | Medium for tissue preparation |
| DMEM/F12 | Gibco | 11320-033 | Medium for organoid cultures |
| DMSO | Sigma | D8418 | Solvent for dissolving drug |
| DNAse | Sigma | DN25 | Enzyme for digesting tumor tissue |
| Ethidium Homodimer | Chemodex | CDX-E0012-T1E | DNA and RNA binding dye |
| FBS | Gibco | 16000044 | Reagent for culture media |
| Fluorescent microscope | Olympus | CKX35 | Microscope for taking pictures of SBENT spheroids |
| Glutamine | Gibco | A2916801 | Reagent for culture media |
| ImageJ | National Institutes of Health | Version 1.51 | Computer software for image analysis |
| Insulin | Sigma | I0516 | Reagent for culture media |
| Matrigel | Corning | 356235 | Matrix to embed and anchore organoids |
| Mounting medium (VECTASHIELD) | Vector Laboratories | H-1200 | Fixative for labelled-cells with a nuclear stain |
| Nicotinamide | Sigma | 72340 | Reagent for culture media |
| Paraformaldehyde | Electron Microscopy Sciences | 15710 | Reagent to fix cells |
| PEN/STREP | Gibco | 15140-122 | Reagent for culture media |
| PT Link | Agilent Dako | Not Available | Automated system to prepare slides for IHC staining |
| Rapamycin | Alfa Aesar | J62473 | Drug that can inhibit NET growth |
| Secondary antibodies for IHC | Agilent Dako | K8000 | Secondary antibodies for IHC using Polymer-based EnVision FLEX system |
| SSTR2 antibody | GeneScritp | A01591 | Antibodies for IF |
| SSTR2 antibody (clone UMB1) | Abcam | ab134152 | Antibodies for IHC |
| Synaptophysin antibody | Abcam | 32127 | Antibodies for IF |
| Synaptophysin antibody (clone DAK-SYNAP) | Agilent Dako | M7315 | Antibodies for IHC |
| TritonX | Mallinckrodt | 3555 KBGE | Reagent to permeablize cells |
| Y-2763 ROCK inhibitor | Adipogen | AG-CR1-3564-M005 | To improve SBNET spheroid viability after freeze thaw |
References
- Maxwell, J. E., Sherman, S. K., Howe, J. R. Translational Diagnostics and Therapeutics in Pancreatic Neuroendocrine Tumors. Clinical Cancer Research. 22, 5022-5029 (2016).
- Pfragner, R., et al. Establishment of a continuous cell line from a human carcinoid of the small intestine (KRJ-I). International Journal of Oncology. 8, 513-520 (1996).
- Kolby, L., et al. A transplantable human carcinoid as model for somatostatin receptor-mediated and amine transporter-mediated radionuclide uptake. American Journal of Pathology. 158, 745-755 (2001).
- Van Buren, G., et al. The development and characterization of a human midgut carcinoid cell line. Clinical Cancer Research. 13, 4704-4712 (2007).
- Pfragner, R., et al. Establishment and characterization of three novel cell lines - P-STS, L-STS, H-STS - derived from a human metastatic midgut carcinoid. Anticancer Research. 29, 1951-1961 (2009).
- Ellis, L. M., Samuel, S., Sceusi, E. Varying opinions on the authenticity of a human midgut carcinoid cell line--letter. Clinical Cancer Research. 16, 5365-5366 (2010).
- Hofving, T., et al. The neuroendocrine phenotype, genomic profile and therapeutic sensitivity of GEPNET cell lines. Endocrine Related Cancer. 25, 367-380 (2018).
- Moreno, A., et al. Antitumor activity of rapamycin and octreotide as single agents or in combination in neuroendocrine tumors. Endocrine Related Cancer. 15, 257-266 (2008).
- Broutier, L., et al. Culture and establishment of self-renewing human and mouse adult liver and pancreas 3D organoids and their genetic manipulation. Nature Protocols. 11, 1724-1743 (2016).
- Saito, Y., et al. Establishment of Patient-Derived Organoids and Drug Screening for Biliary Tract Carcinoma. Cell Reports. 27, 1265-1276 (2019).
- Park, S. J., et al. Detection of bone marrow metastases of neuroblastoma with immunohistochemical staining of CD56, chromogranin A, and synaptophysin. Applied Immunohistochemisty and Molecular Morphology. 18, 348-352 (2010).
- Clifton-Bligh, R. J., et al. Improving diagnosis of tumor-induced osteomalacia with Gallium-68 DOTATATE PET/CT. The Journal of Clinical Endocrinology and Metabolism. 98, 687-694 (2013).
- Clinton, J., McWilliams-Koeppen, P. Initiation, Expansion, and Cryopreservation of Human Primary Tissue-Derived Normal and Diseased Organoids in Embedded Three-Dimensional Culture. Current Protocols in Cell Biology. 82, 66 (2019).
- Markovits, J., Roques, B. P., Le Pecq, J. B. Ethidium dimer: a new reagent for the fluorimetric determination of nucleic acids. Analytical Biochemistry. 94, 259-264 (1979).
- Weeber, F., Ooft, S. N., Dijkstra, K. K., Voest, E. E. Tumor Organoids as a Pre-clinical Cancer Model for Drug Discovery. Cell Chemical Biology. 24, 1092-1100 (2017).
- Sachs, N., et al. A Living Biobank of Breast Cancer Organoids Captures Disease Heterogeneity. Cell. 172, 373-386 (2018).
- Puca, L., et al. Patient derived organoids to model rare prostate cancer phenotypes. Nature Communication. 9, 2404 (2018).
- Singh, S. P., et al. SSTR2-based reporters for assessing gene transfer into non-small cell lung cancer: evaluation using an intrathoracic mouse model. Human Gene Therapy. 22, 55-64 (2011).
