Summary
Dette arbejde forudindstiller en avanceret protokol til præcist at vurdere tumor belastning ved påvisning af grønne fluorescerende protein og bioluminescens signaler samt integration af kvantitative molekylære detektionsteknik.
Abstract
Triple-negativ brystkræft (TNBC) er en aggressiv brystkræft subtype med begrænsede terapeutiske muligheder. Sammenlignet med patienter med mindre aggressive brysttumorer, 5-års overlevelsesrate af TNBC patienter er 77% på grund af deres karakteristiske resistente fænotype og metastatisk byrde. Mod dette formål, murine modeller er blevet etableret med henblik på at identificere nye terapeutiske strategier, der begrænser TNBC tumorvækst og metastatisk spredning. Dette arbejde beskriver en praktisk vejledning for TNBC ortotop model, hvor MDA-MB-231 brystkræftceller suspenderet i en kælder membran matrix er implanteret i den fjerde mælkefedt pad, som nøje efterligner kræft celle adfærd hos mennesker. Måling af tumorer ved caliper, lunge metastase vurdering via in vivo og ex vivo imaging, og molekylær detektion diskuteres. Denne model giver en fremragende platform til at studere terapeutisk effekt og er specielt velegnet til studiet af samspillet mellem den primære tumor og distale metastatiske steder.
Introduction
Omkring en ud af otte kvinder i USA vil udvikle invasiv brystkræft i løbet af hendes levetid, og 10%−20% af disse kvinder vil blive diagnosticeret med den aggressive tredobbelt negativ brystkræft (TNBC) subtype. Mens primære læsioner kan fjernes kirurgisk i de fleste tilfælde, gør den subkliniske mikrometastase og kemoresistens det til en uhåndterlig sygdom. Vigtigere er det, de fleste patienter med metastatisk TNBC i sidste ende tilbagefald, selv om de gennemgik behandling i den tidlige fase1. Således, kræft heterogenitet, micrometastasis, og terapeutisk resistens er tre store udfordringer, der begrænser den vellykkede kliniske resultat af TNBC patienter. Derfor er der et presserende behov for bedre at forstå den polymorfe molekylære baggrund af TNBC og udvikle effektive terapeutiske midler, der begrænser metastatisk sygdom.
Tumor metastase er en multistep proces, hvor tumorcelle kontrol og tilraner sin mikromiljø til at fremme sin egen udbredelse via membran nedbrydning og tumor celle undslippe fra den primære læsion, via indrejse i (dvs. intravasation) og exit fra (dvs. extravasation) vaskulaturen, og i sidste ende tilpasning og kolonisering inden for distale væv senge2. Dyremodeller er blevet udviklet til at studere brystkræft metastase, hvor to metoder er almindeligt gennemført: direkte blodcirkulation injektion og ortotop implantation. Almindeligt anvendte metoder til direkte blodcirkulationinjektion omfatter hale vene injektion, mens andre tilgange, herunder direkte hjerteindsprøjtning3,direkte hjerneinjektion4,og direkte leverinjektion5 har også været ansat. Den direkte blodcirkulation injektion er ofte omtalt som en kunstig metastase model, som er hurtig og nem, men mindre fysiologisk nøjagtige, fordi det omgår tumor flugt fra den primære læsion og intravasation6,7,8. Sammenlignet med direkte injektion modeller, ortotop brystkræft model tager længere tid for forekomsten af påviselige metastatiske læsioner i fjerntliggende organer såsom lungen, men det er mere fysiologisk relevant, fordi det nøje efterligner multitrin metastatisk proces, som det sker hos mennesker. Vigtigt er det, en 2013 undersøgelse9 sammenlignet hale vene injektion og ortotopi modeller og fandt, at brystkræftceller injiceres i halen vene og dem isoleret fra lunge metastatiske læsioner efter hale vene injektion udstillet lignende globale genekspression profiler. I modsætning hertil var den globale genekspressionsprofil for ortopiskede injicerede brystkræftceller dramatisk anderledes end for lungemetastatiske læsioner, der opstod som følge af ortotopisk injicerede celler9. Disse observationer tyder på, at ortotopmodellen er mere fysiologisk relevant, fordi de metastatiske læsioner gennemgår en udvælgelsesproces svarende til multitrinsprocessen af metastase, som det sker hos mennesker.
Dette arbejde beskriver en ortopisk brystkræft (MDA-MB-231-Luc/GFP) model i nøgen mus, der blev optimeret i vores laboratorium for billedbehandling detektionsteknikker samt identifikation af nye biomarkører og udvikling af målrettede kemoterapeutiske midler.
Protocol
Analyse af tumorvækst blev udført ved hjælp af protokoller godkendt af Udvalget for Etik af Animal Of Animal Experiments af National Cancer Institute og overholdt anbefalingerne fra USA National Research Council's "Guide for pleje og brug af Laboratory Animals", USA's offentlige sundhedstjenestes "Guide for care and use of Laboratory Animals" og "Policy on Humane Care and Use of Laboratory Animals".
1. Forberedelse af celler til implantation
BEMÆRK: MDA-MB-231 humane bryst adenocarcinomceller (kommercielt erhvervet) blev stabilt transfemected med luciferase genIII og forbedret grøn fluorescerende protein (GFP) markør ved lentivirus og dyrkes i nærværelse af udvælgelsen antibiotika (puromycin) .
- Cellekulturen startes med 1 x 106 MDA-MB-231-Luc/GFP-celler, og der tilsættes 15 ml forvarmede (37 °C) RPMI 1640 medium med 10% føtal kvægserum (FBS) i en T75-kulturkolbe. Cellerne vokser i en temperaturstyret cellekulturkuvøse ved 37 °C med 5% CO2. Udskift hele mediet mindst 2x om ugen.
BEMÆRK: Forstyr ikke cellevæksten, og hold dagligt øje med cellevækstforholdene. Cellerne skal subkulturimede, når de når 85%−90% sammenblanding for at opretholde spredningsfasen. - En uge før celleimplantationstrinnet fjernes puromycinen fra cellekulturkolben ved først at fjerne hele mediet i dyrkningskolben, hvorefter der er fyldt 2x med 10 ml 1x fosfatbufferet saltvand (PBS) og til sidst erstatte mediet med komplet medium uden puromycin. Under trinnene til medium-tilføjelse og skylning må cellerne ikke forstyrres. Husk ikke at bruge hele mediet med valg antibiotika fra nu af for alle medium genopfyldning trin.
- På dagen for at forberede cellerne til implantation, fjerne alle komplette medium før trypsinisering for at undgå at deaktivere trypsin. Der tilsættes 5 ml trypsin til kolben for at trypsinisere cellerne. Overvåg cellerne, og kontroller, at de løsner sig fra dyrkningskolben.
- Når størstedelen af cellerne løsrive, tilsættes 10 ml komplet medium for at neutralisere trypsinaktiviteten. Derefter overføres cellesuspensionen til et 50 ml centrifugerør og centrifugeres ved ~ 150 x g for at pelletere cellerne. Supernatanten fjernes efter centrifugering, og tilsæt derefter 10 ml 1x PBS for at resuspendere cellerne og forberede celletællingen.
- Tæl cellerne med en celletæller og juster cellekoncentrationen til 20 x 106 celler/ml i kold 1x PBS, der indeholder 25% kældermembranmatrix. Injicer 2 x 106 celler i 0,1 ml 1x PBS med 25% kældermembranmatrix i den fjerde mælkefedtpude på hver mus. Medbring ekstra nåle og sprøjter til celleimplantationen, og hold celle-kælder-membran-matrix-blandingen på is før implantation.
BEMÆRK: Der er død plads i sprøjten og nålen. Afhængigt af valget af kanyle og sprøjtelængde, type og størrelse kan en tuberkulinsprøjte med en nål på 0,5 ud af 26 G have op til 70 μL dødplads10. Forbered 40%−50% mere celleimplantation mix for at kompensere for det døde rum og andre utilsigtede tab.
2. Ortotop brystkræft model og tumor størrelse måling
- Lad 6 uger gamle kvindelige athymiske nøgenmus akklimatisere sig til boliganlægget i mindst 1 uge før celleimplantationen.
BEMÆRK: Brug af mus af samme alder reducerer datavariationen. - For hver runde skal fem mus med isofluran med 4% med filtreret (0,2 μm) luft med en strømningshastighed på 1 L/min. i 3−4 min. Vær opmærksom på musens åndedrætshastighed og mønsterændring, og brug en tåklemme for at sikre, at musene er under korrekt anæstesi. Når de ikke længere bevæger sig, skal du fjerne en mus og placere en næsekegle over dens næse og mund med samme anæstesi.
- Svaber venstre 4th mælkekirtlen med alkohol. Brug fine rottetandpincet til at løfte 4th mælkekirtlen en smule for at indsætte 25 G nålen. Sørg for, at nålen er skrå op og derefter lidt trække stemplet for at sikre nålen ikke rammer nogen blodkar. Hvis der ikke kommer blod ind i sprøjten, skal du langsomt injicere 100 μL af celle-kælder-membran-matrix mix i mælkefedtpuden.
BEMÆRK: Der vises et rundt, hævet område under huden. - Vent 10-15 s for kælderen membran matrix at hærde, derefter fjerne nålen. Gentag processen med de resterende mus i induktionskammeret. Læg alle brugte nåle og sprøjter i en skarp kasse.
- Brug det samme mælkekirtelinjektionssted til alle mus. Hold godt øje med injektionsstedet, og bemærk, at enhver celleimplantationsblanding, der lækker ud fra injektionsstedet.
BEMÆRK: Inden for få minutter begynder musen at genvinde bevidstheden. - Lad xenograft at vokse frit uden afbrydelse i 7−10 dage før enhver tumor størrelse måling.
- Undersøg alle mus for xenograft størrelse. Mål tumorstørrelse med en caliper. Bestem tumorvolumen (mm3) med følgende ligning:
hvor L er den længste dimension, og W er den korteste dimension vinkelret på L. - Identificer og fjern afvigende værdier, der overskrider en standardafvigelse for middelværdien. Brug kun mus med sammenlignelige tumorstørrelser til eksperimenter. Tilfældigt opdele musene i forskellige behandlingsgrupper og begynde behandlinger.
- Mål tumorstørrelse ved caliper 2x om ugen. Vær opmærksom på alle de fysiske ændringer af xenografts (dvs. nekrose, laceration).
3. In vivo bioluminescens og ex vivo fluorescens imaging
BEMÆRK: I denne undersøgelse udføres både todimensional bioluminescens og fluorescensscanning ved forsøgets endepunkt. Den bioluminescens imaging (BLI) blev udført ved hjælp af en kommerciel præklinisk optisk scanner udstyret med en 16-bit afkølet CCD kamera og opvarmet billeddannelse fase.
- Før billeddannelse bedøves op til fem tumorbærende mus i induktionskammeret ved indstilling af isofluran ved 3% med filtreret (0,2 μm) luft med en strømningshastighed på 1 L/min. Bestem anæstesi ved en tåknivspids. Sørg for, at induktionskammeret holdes inde i en udluftet hætte for at minimere personalets eksponering for isofluran.
- Administrere D-luciferin (150 mg/kg) til de bebedøvet mus ved en intraperitoneal rute ved hjælp af en 27 G nål, og overføre en bedøvet mus til billeddannelseskammeret. Ved scannerbilleddannet holdes isofluranen på 2%−2,5% med O2 som bærer med en strømningshastighed på 1 L/min.
BEMÆRK: Hold musens kropstemperatur ved ~37 °C under proceduren ved at holde en opvarmet pude under anæstesiinduktionskammeret, billedbehandlingstabellen (hvis stadiet ikke opvarmes) og efterprocedurens genvindingsbur. - Før forsøgsmus billede, skal du anskaffe luciferinkinetik ved at billeddannelse tre ekstra tumorbærende mus (dyr, der ikke er tildelt nogen studiegrupper) med 2 min. intervaller i i alt 40 minutter ved hjælp af følgende parametre: excitationfilter-blokeret, emissionsfilter-åben, f/stop 1, FOV-D, medium binning (8 x 8) og automatisk eksponering. Brug det maksimale bioluminescenssignal, der måles, til at definere det optimale vindue for billedanskaffelsestid for alle efterfølgende tidspunkter.
- Mens du udfører metastase billeddannelse, skjold den høje BLI signal fra den primære tumor ved at dække det med et ærme skåret ud fra en sort handske. Anskaf billedet ved hjælp af de samme parametre, der er beskrevet i trin 3.3, hvor musens ventrale side vender mod kameraet for at få billeddannelse af lungemetastaser og musens rygside, der vender mod kameraet for at få hjernemetastasebilleddannelse.
BEMÆRK: Det er vigtigt at teste et par forskellige mærker af sorte handsker til at vælge den ene med minimal auto luminescens. - Ved hjælp af en scanner og dataanalyse software, tegne en standard form region af interesse (ROI) over brysthulen eller hjernen sikre, at hele organ af interesse er dækket for at evaluere den metastatiske byrde. Kvantificer produktionen af bioluminescens (BL) som total flux (fotoner/sekund).
- Umiddelbart efter BLI aflives musen via CO2 kvælning (i henhold til ACUC's retningslinjer og institutionsgodkendte dyreprotokoller) og udtræk lungen og hjernen med dissekere saks og pincet til ex vivo-billeddannelse.
BEMÆRK: Lungen, der er udvundet til ex vivo-billeddannelse og til lungemetastasering, kan ikke udføres på den samme mus på grund af uforenelige procedurer. - Skyl hurtigt alle organer med 1x PBS for at fjerne eventuelle overfladiske blodpletter og placere organer på en lav autofluorescens, sort plastplade. Transport organer til en multispektral fluorescens scanner udstyret med spektral unmixing kapacitet (solid-state flydende krystal bølgelængde tuning) med en 12-bit CCD kamera til GFP afsløring.
- Anskaf multispektrale GFP-billeder (excitationsfilter = 457 ± 23 nm; emissionsfilter = 490 nm lang passage) af de udtrukne organer og ikke-tumorbærende kontrolmus ved at scanne gennem 500−720 nm ved en trinstørrelse på 10 nm. Brug udsted organer fra ikke-tumor leje kontrol mus til at korrigere for autofluorescens.
- Når multispektral GFP-billeddannelse er opnået, skal du bestemme de optimale billedindstillinger. Udfør billederhvervelse af alle målorganer og udfør billedanalyse (dvs. generer et spektralbibliotek for autofluorescens og GFP til spektral unmixing procedure) i henhold til producentens protokol.
4. Molekylær påvisning af metastatiske brystkræftceller
- Efter ex vivo-billeddannelse fryses hele hjernen i flydende nitrogen, og opbevares ved -80 °C i en fryser, indtil den er klar til DNA-ekstraktionen.
- For DNA-ekstraktion, sætte hele hjernen i en 5 ml homogeniserende rør med 2 ml DNA lysis buffer. Brug en homogenisator med effektindstillingen ved 50 til at homogenisere det snap-frosne hele hjernevæv. Når hjernevævet er fuldstændig homogeniseret, overføres 1 ml suspensionen (lysate) til et DNase-frit og RNase-frit 2 ml mikrocentrifugerør og fortsætte med at isolere DNA'et i henhold til producentens protokol.
BEMÆRK: For at minimere overførsel af DNA-kontaminering skal homogenisatoren rengøres grundigt efter hver prøve ved først at skylle den med 75 % ethanol i DNase-frit og RNase-frit vand, hvorefter der skylles med 1 M NaOH-opløsning efterfulgt af en skylning med 75 % ethanol i DNase-frit og derefter skylning med 1 M NaOH-opløsning efterfulgt af en skylning med 75 % ethanol i DNase-fri og RNase-frit vand for effektivt at reducere og ødelægge eventuelle DNA-rester. - Der tilsættes 0,5 ml 100% ethanol af DNA-lysisbuffer til lysatet. Prøven blandes ved inversion, og der opbevares ved stuetemperatur i 3 min.
BEMÆRK: Må ikke vendes for mange gange eller for kraftigt. DNA'et vil være synligt som en uldlignende bundfald. - Brug en pipettespids til at overføre DNA'et til et frisk DNase-frit og RNase-frit 2 ml mikrocentrifugerør. Prøven lufttørres i 1 min. Tilsæt 1 ml 75% ethanol, og mikrocentrifugerøret 3−6x inverteres for at vaske DNA-prøven. Kassér ethanolen efter hver vask ved pipettering. Gentag vasketrin 2x.
- Lufttørrer DNA-prøven i 10 s. Derefter tilsættes 52 μL på 8 mM NaOH for at opløse DNA-prøven. Pipet 2 μL af DNA-prøven til DNA-kvantitation, og brug de resterende 50 μL til en PCR-analyse i realtid efter koncentrationsjustering.
BEMÆRK: NaOH hjælper med at opløse DNA-prøven fuldtud. - Quantiet 2 μL af hver DNA-prøve med et spektrofotometer og anvende et absorbansforhold mellem A260/280 som reference til kvalitetskontrol. Beregn DNA-koncentrationen med denne formel:
- DNA-koncentrationen justeres til 50 ng/μL. For hver DNA-prøve skal du bruge 50 NG DNA som startskabelon til en PCR-analyse i realtid. Brug 8 mM NaOH-opløsning eller DNase-frit og RNase-frit vand til at fortynde DNA-prøven.
- Design primer parret er specifikke for eksogen grøn fluorescens protein (GFP) sekvens in-house ved hjælp af en open source primer design webportal for real-time PCR påvisning af GFP tag i metastatiske celler, der invaderede og koloniserede distale steder.
BEMÆRK: Denne undersøgelse anvendte F: 5'-AGAACGGCATCAAGGTGAAC-3', R: 5'-TGCTCAGGTAGTGGTTGTCG-3'. - Brug et hurtigt PCR-reagens i realtid og en PCR-maskine i realtid, der understøtter en hurtig PCR-protokol i realtid. Ud over de regelmæssige 30 cyklus forstærkning trin, tilføje en dissociation kurve trin til slutningen af kørslen for påvisning af eventuelle uspecifikke forstærkning.
BEMÆRK: Følgende betingelser blev anvendt til molekylær detektion: 95 °C 2 min varm start, 40 cyklusser på 95 °C 5 s, 60 °C 15 s og endelig en smeltekurveanalyse. GFP amplicon er 135 bp i størrelse. - Brug en naiv musehjerne DNA (ikke en MDA-MB-231 celle implantat) som en negativ kontrol. Brug DNA udvundet fra MDA-MB-231-GFP/Luc-cellerne som en positiv kontrol. Tilføj alle PCR-reagenser uden DNA-skabelon som et NO Template Control (NTC).
BEMÆRK: Der kræves en PCR-kontrol for hver PCR-analyse.
5. Metastatisk brystkræft celle detektion i lungerne
- For mus undergruppe valgt til metastatisk lunge nodule tælle, bedøve mus med isofluran (som i trin 2.2) umiddelbart efter ex vivo imaging, udføre en hjerte-punktering til blodtapning, og derefter aflive ved cervikal dislokation.
- Åbn brysthulen med dissekere saks og skæres forbi hjertet og thymus at udsætte luftrøret.
- Sæt en 10 ml sprøjte med en 22 G nål, der indeholder Bouins opløsning, ind i luftrøret. Skub sprøjten stemplet, indtil de kollapsede lunger er hævede med ~ 2 ml af Bouin's opløsning. Fjern sprøjten og nålen, når lungerne er oppustet.
- Placer hele lungen i et 15 ml rør, der indeholder Bouins opløsning, vend forsigtigt røret om et par gange, og lad det ligge i blød i 24 timer ved stuetemperatur.
- Efter 24 timer fjernes Bouins opløsning fra røret, lungen skylles med vand, og derefter placeres den tilbage i røret med 70% ethanol. Tæl metastase (hvide pletter eller knuder) på lungernes overflader ved hjælp af et dissekeret mikroskop.
6. Dataindsamling og -analyse
- Optag tumor volumen data, samt in vivo og ex vivo imaging data, på et elektronisk regneark for nem indtastning af data, indsamling og forvaltning.
- Ved forsøgets afslutning overføres alle data til det elektroniske regneark og statistisk software til dataplotning og statistiske analyser.
Representative Results
Tumorvolumenmåling efter caliper er en veletableret metode til vurdering af behandlingseffekten (figur 1). Antallet af celler implanteret, brug af kælderen membran matrix, mikrobiom, facilitet renlighed, og injektionsstedet er de vigtigste faktorer, der påvirker tumor vækstrate.
I modsætning til GFP-billeddannelse krævede BLI administration af luciferasesubstrat mindst 15−20 min før BLI-billeddannelse. Desuden, musen stamme, celle linje, behandlinger, og luciferase reporter alle påvirker bioluminescens signalniveauer. For at opnå sammenlignelige signaler mellem forsøgsgrupperne skal der således udføres en kinetisk undersøgelse før billeddannelse for at bestemme den bedste billeddannelsestidsramme (figur 2).
På grund af det overlegne signal-til-baggrundsforhold26,27, var hele kroppen in vivo bioluminescensscanning ganske følsom ved påvisning af metastasesignal på lavt niveau sammenlignet med GFP-tilgangen (figur 3). Desuden gav bioluminescenssignalet en dybere gennemtrængning end GFP med et par millimeter. Bioluminescenssignalproduktion kræver imidlertid ATP, som er en begrænsende faktor ved vurderingen af ex vivo-vævsprøver. Hvis dyrene forarbejdes hurtigt, kan BLI være en holdbar metode til at opnå kvantitative resultater på metastase. En måde at opnå dette på er ved at behandle et dyr ad gangen. Denne fremgangsmåde var imidlertid ikke mulig for denne undersøgelse, fordi der blev anvendt en stor gruppe mus. BLI signal blev ikke opdaget, når organerne blev afbildet omkring 45 min post luciferin injektion. Brugen af en dobbelt reporter celle linje er nyttig i denne situation. På grund af GFP-molekylets stabile karakter vil forskerne have tilstrækkelig tid til at behandle slagtekroppen, før de opfangede GFP-signalerne fra målorganerne (figur 4).
Figur 5 giver et virkeligt eksempel på, hvordan caliper tumor størrelse målinger kunne fordreje data fortolkning, fordi xenograft mistet det meste af det levedygtige tumor celleindhold, men stadig fastholdt sin store masse og form. Histopatologiske undersøgelse af disse xenografts angivet nekrose inde i massen (Figur 5B).
For forskere, der udfordrer billeddannelse resultater vedrørende hjernen metastase i ortotop brystkræft model, molekylær detektion af real-time PCR kan give overbevisende beviser (Figur 6). I dette tilfælde var den eksogene GFP DNA-sekvens den bedste måde at løse dette problem på, fordi den transfected GFP DNA-sekvens ikke naturligt findes hos mennesker eller gnavere.
Figur 1: Måling af tumorvolumen. Tumor volumen / loading måling med en caliper startede på dag 10 efter xenograft implantation og derefter blev målt 2x en uge indtil udgangen af forsøget. Fejllinjer beregnes af SEM-værdien. Klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 2: Bestemmelse af det optimale vindue til billedanskaffelse. Venstre: En mus med en stor xenograft og en mus med en lille xenograft blev valgt til den optimale luciferin kinetiske områdebestemmelse. Højre: Luciferin kinetisk kurve opnået ved at erhverve billederne hver 2 min i 40 min. Et plateau blev observeret mellem 15−22 min, som blev brugt som en optimal billedanskaffelsestid for alle efterfølgende billeddiagd. Klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 3: Bli-billeddannelse i hele kroppen. L: Helkrops BLI-billeddannelse. M: Ventral udsyn med underkroppen dækket med et ærme af en sort handske. R: Dorsal visning med underkroppen dækket med et ærme af en sort handske. En aksillær lymfeknude metastase detekteres i ventrale visning af BLI imaging. Klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 4: Ex vivo BLI/GFP-signaldetektion. GFP signaler blev opdaget i hjernen og lungerne fra den samme mus 20 min efter musen blev ofret. BLI signal blev ikke opdaget 45 min post luciferin injektion. Der blev ikke fundet noget GFP-signal i den naive musehjerne og lunge. Klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 5: Fordele ved optiske billeddannelsesteknikker i forhold til kalipermålinger. (A) Repræsentativt billede, der viser i vivo GFP signaldetektion i en primær tumor. Kun en mindre del af xenograft en GFP signal, hvilket tyder på, at en betydelig del af massen var stroma. Dette kan ikke bestemmes ved traditionelle calipermålinger og kan føre til en unøjagtig konklusion. Dette eksempel fremhæver vigtigheden af optisk billeddannelse for dyremodelundersøgelsen. (B) Histopatologisk del af den samme mus, der viser, at den nekrotiske region (dvs. indre region) også bidrog til tumorstørrelsesberegningen. Klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 6: Analyse af smeltekurve. Smeltekurven plot viser specificiteten af GFP amplicons. DNA fra hjernen fra MDA-MB-231-Luc/GFP-implanterede mus og DNA isoleret fra MDA-MB-231-Luc/GFP celler dyrket i kultur (positiv kontrol) blev assayed. Pcr-analysen i realtid blev udført for at vurdere GFP-indholdet i hjernevævet. (A,B) Smeltekurverne for den positive kontrol og dna'et udvundet fra henholdsvis musehjernen. (C) De overlappende kurver af paneler A og B, der angiver de maksimale signaler fra musehjernen SNA'er er specifikke for den eksogene GFP-sekvens. Klik her for at se en større version af dette tal.
Discussion
Til undersøgelse af TNBC hos dyr er der udviklet to murinemodeller: MDA-MB-231 humane brystadenocarcinomceller i immunkompromitterede mus (dvs. athymiske nøgenmus, NSG-mus) og 4T1 i immunkompetente BALB/c-mus. Begge modeller har deres fordele. Valget af dyremodel for en undersøgelse afhænger af forskningsmålene. For eksempel er MDA-MB-231-modellen en human TNBC-cellelinje dyrket i immunkompromitterede mus, der efterligner immunsupprimerede humane brystkræftpatienter. På den anden side, den invasive fænotype af ortopisk 4T1 triple-negative murine brystkræftceller i BALB / c mus nøje efterligner den metastatiske proces, da det forekommer i fase IV menneskelige brystkræftpatienter. I modsætning til intravenøs celle injektion tilgang, human MDA-MB-231 brystkræftceller blev ligeledes injiceret i mælkefedt pad11,12 i ortotop brystkræft model11,13. Jo længere tumorvækst og erhvervede metastatiske evne er mere fysiologisk relevant, således er det ikke en kunstig metastatisk kræft model4,14. En sådan spontan metastase model nøje efterligner menneskerbrystkræft udvikling bortset fra indledningen fase. Dette er en afgørende model for in vivo lægemiddel screening og terapeutisk effekt vurdering i metastatisk brystkræft.
Tumorimplantationsstedet i musen spiller en afgørende rolle i at give et mikromiljø, der opretholder tumorvækst og udvælgelse af metastatisk fænotype svarende til den, der forekommer hos mennesker. Den proksimale lymfeknude og tilstedeværelsen af fedtvæv er de vigtigste faktorer , der påvirker sygdomsprogressionen af brystkræft15,16. Hos en human patient er lymfeknuden og fedtvævet begge vigtige interagerende faktorer, der påvirker maligniteten og forekomsten af brystkræft17,18,19. Således kan udvælgelsen af den korrekte anatomiske placering for injektionsstedet i høj grad påvirke relevansen af tumormodellen i forhold til den menneskelige sygdom. Denne undersøgelse brugte den fjerde mælkekirtel som implantationsstedet primært på grund af de førnævnte krav, og at det er anatomisk mere tilgængeligt og lettere at manipulere.
Forskellige tumor volumen beregningsmetoder er tilgængelige, og en forsker kan vælge noget, de ønsker. Algoritmen udvalgt til denne undersøgelse er baseret på resultaterne af Faustino-Rocha et al., der sammenlignede forskellige tumor volumen beregning formler og konkluderede, at formlen nedenfor er den mest nøjagtige20.
Kælder membran matrix er en vigtig ekstracellulær matrix, der anvendes i forskellige in vitro21 og in vivo22,23 assays. Der er modstridende rapporter22,24,25 om indflydelsen af kælderen membran matrix på xenograft malignitet. Det synes kun at påvirke den oprindelige etablering af xenograft og har ingen yderligere effekt på xenograft vækst25. For xenograft implantation beskrevet, kælderen membran matrix blev blandet med kræftceller for at øge celle / gel mix opløsning viskositet før implantation. Tilstedeværelsen af kældermembranmatrixen reducerer tabet af mixopløsning fra injektionsstedet og holder blandeopløsningen på implantationsstedet, hvilket øger ensartetheden af det implanterede xenograftvolumen.
Den MDA-MB-231 celle linje er en ondartet udødeliggjort menneskelige bryst adenocarcinom celle linje og er et populært værktøj i brystkræft forskning på grund af sin triple-negative status. Brugen af dobbelt reporters (luciferase og GFP) cellelinje giver større fleksibilitet i håndteringen af in vivo- og ex vivo-billeddannelse. Det er veletableret, at bioluminescenssignalet har større følsomhed, dybdedetekterbarhed og overlegen kontrast (signal-støj-forhold) end GFP-signaler. På grund af dette, Det er en udbredt billeddannelse modalitet for hele kroppen billeddannelse. Desværre er bioluminescensdetektion begrænset af et smalt tidsvindue (~15−20 min post luciferininjektion), hvor signaldetekteringen er lineær. BLI-signalet aftager hurtigt, når dyrene aflives. Dette bliver et eksperimentelt design spørgsmål, hvis mange mus skal aflives og høst flere væv eller organer er påkrævet. I disse undersøgelser, blod blev høstet ved direkte hjerte punktering, hjernen, primær tumor, lunge, og påvirket lymfeknude blev undersøgt i 40 mus. Da organerne blev høstet og klar til ex vivo-billeddannelse, var bioluminescenssignalet ikke målbart. Derfor er GFP-detektion mere velegnet i disse situationer. Emissionen af GFP-signalet er i det synlige område, og ved disse bølgelængder er signalabsorptionen på grund af blod (dvs. hæmoglobin) betydeligt højere. Også, autofluorescens i det synlige område på grund af NADH, lipo-pigmenter, og flavins resulterer i en betydelig baggrund, der gør det vanskeligt at skelne mellem et lavt niveau GFP signal og autofluorescens baggrund. Anvendelse af en multispektral fluorescens billeddannelse tilgang i stedet for traditionelle filter-par imaging og ved hjælp af spektrale unmixing algoritmer hjælper med at identificere ægte GFP signal i det organ af interesse. Ved at kombinere styrkerne ved bioluminescensbilleddannelse i hele kroppen in vivodetektion og multispektral GFP-billeddannelse i ex vivo-organ/vævsevalueringerne kan kvantificerbare data derfor maksimeres i en stor gruppe mus.
Uanset hvilken fremgangsmåde der er valgt til en dyreundersøgelse, anbefales det stærkt at udvinde alt blod før udtagning af organer/væv, især for undersøgelser, der er rettet mod den metastatiske byrde. Denne protokol registrerer GFP-signaler fra hele blodprøver fra musene (data, der ikke er vist) i ortotopbrystkræftmodellen ved pcr-analyser i realtid. Minimering af blodvolumen i organer / væv vil reducere falsk positivt signal i målorganerne.
Afslutningsvis, ortotop brystkræft model ved hjælp af MDA-MB-231-Luc/GFP celler er en meget relevant dyremodel, der nøje efterligner den menneskelige TNBC patient tilstand. Denne model er afgørende for at studere, overvågning, og vurdere terapeutisk effekt i en tumor mikromiljø svarende til mennesker. Brugen af dobbelt reporter cellelinjer yderligere øger det praktiske i denne ortotop brystkræft model.
Disclosures
Forfatterne har intet at afsløre.
Acknowledgments
Forfatterne vil gerne anerkende støtte fra Intramural Research Program af National Institutes of Health, National Cancer Institute, Bethesda MD, Kræft og Inflammation Program, og Frederick National Laboratory - Small Animal Imaging Program, Leidos Biomedical Research, Inc, Frederick Maryland, USA.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Bouins Solution | Sigma | HT10132-1L | Lung metastatic nodule staining |
| D-Luciferin, Potassium Salt | GoldBio | LUCK-1G | Luciferase substrate |
| DNAzol | ThermoFisher | 10503027 | DNA extraction Kit |
| Excel | Microsoft | Spreadsheet software | |
| homogenizer | Virtis | Cyclone Virtishear | For tissue homogenization |
| IVIS SPECTRUM scanner | Perkin Elmer | fluorescence and BLI imaging system | |
| Maestro GNIR-FLEX fluorescence scanner | Perkin Elmer | fluorescence imaging system | |
| MatriGel Matrix | Corning | 356234 | Store at -20C and keep old (4 C) when in use. |
| MDA-MB-231 / Luciferase-2A-GFP Stable Cell Line | GenTarget | SC044 | Dual Reporter human breast cancer cell line |
| Microscope | ThermoFisher | EVOS | histology image capture |
| Phosphate-Buffered Saline | ThermoFisher | 10010049 | rinse buffer |
| Primer3 | MIT | Primer Design | |
| Prism | GraphPad | Statistical Analysis Software | |
| Puromycin | ThermoFisher | A1113803 | Antibiotics |
| RPMI 1640 media | ThermoFisher | 61870127 | Culture media |
| SeniFAST SYBR Lo-ROX kit | Bioline | BIO-94020 | Fast Real-Time PCR Reagent |
| StepOne Plus Real-Time PCR system | ThermoFisher | Real-Time PCR machine |
References
- Abramson, V. G., Lehmann, B. D., Ballinger, T. J., Pietenpol, J. A. Subtyping of triple-negative breast cancer: implications for therapy. Cancer. 121, 8-16 (2015).
- Zhuang, X., Zhang, H., Hu, G. Cancer and Microenvironment Plasticity: Double-Edged Swords in Metastasis. Trends in Pharmacological Sciences. 40 (6), 419-429 (2019).
- Campbell, J. P., Merkel, A. R., Masood-Campbell, S. K., Elefteriou, F., Sterling, J. A. Models of bone metastasis. Journal of Visualized Experiments. (67), e4260 (2012).
- Saha, D., et al. In vivo bioluminescence imaging of tumor hypoxia dynamics of breast cancer brain metastasis in a mouse model. Journal of Visualized Experiments. (56), e3175 (2011).
- Goddard, E. T., Fischer, J., Schedin, P. A Portal Vein Injection Model to Study Liver Metastasis of Breast Cancer. Journal of Visualized Experiments. (118), e54903 (2016).
- Lim, E., et al. Monitoring tumor metastases and osteolytic lesions with bioluminescence and micro CT imaging. Journal of Visualized Experiments. (50), e2775 (2011).
- Bauerle, T., Komljenovic, D., Berger, M. R., Semmler, W. Multi-modal imaging of angiogenesis in a nude rat model of breast cancer bone metastasis using magnetic resonance imaging, volumetric computed tomography and ultrasound. Journal of Visualized Experiments. (66), e4178 (2012).
- Katsuta, E., Oshi, M., Rashid, O. M., Takabe, K. Generating a Murine Orthotopic Metastatic Breast Cancer Model and Performing Murine Radical Mastectomy. Journal of Visualized Experiments. (141), e57849 (2018).
- Rashid, O. M., et al. Is tail vein injection a relevant breast cancer lung metastasis model? Journal of Thoracic Disease. 5, 385-392 (2013).
- Bhambhani, V., Beri, R. S., Puliyel, J. M. Inadvertent overdosing of neonates as a result of the dead space of the syringe hub and needle. Archives of Disease in Childhood: Fetal and Neonatal Edition. 90, F444-F445 (2005).
- Zhang, G. L., Zhang, Y., Cao, K. X., Wang, X. M. Orthotopic Injection of Breast Cancer Cells into the Mice Mammary Fat Pad. Journal of Visualized Experiments. (143), e58604 (2019).
- Tavera-Mendoza, L. E., Brown, M. A less invasive method for orthotopic injection of breast cancer cells into the mouse mammary gland. Laboratory Animals. 51, 85-88 (2017).
- Paschall, A. V., Liu, K. An Orthotopic Mouse Model of Spontaneous Breast Cancer Metastasis. Journal of Visualized Experiments. (114), e54040 (2016).
- Kocaturk, B., Versteeg, H. H. Orthotopic injection of breast cancer cells into the mammary fat pad of mice to study tumor growth. Journal of Visualized Experiments. (96), e51967 (2015).
- Fletcher, S. J., et al. Human breast adipose tissue: characterization of factors that change during tumor progression in human breast cancer. Journal of Experimental and Clinical Cancer Research. 36, 26 (2017).
- Giuliano, A. E., et al. Axillary dissection vs no axillary dissection in women with invasive breast cancer and sentinel node metastasis: a randomized clinical trial. Journal of the American Medical Association. 305, 569-575 (2011).
- Rummel, S., Hueman, M. T., Costantino, N., Shriver, C. D., Ellsworth, R. E. Tumour location within the breast: Does tumour site have prognostic ability? Ecancermedicalscience. 9, 552 (2015).
- Kroman, N., Wohlfahrt, J., Mouridsen, H. T., Melbye, M. Influence of tumor location on breast cancer prognosis. International Journal of Cancer. 105, 542-545 (2003).
- Bao, J., Yu, K. D., Jiang, Y. Z., Shao, Z. M., Di, G. H. The effect of laterality and primary tumor site on cancer-specific mortality in breast cancer: a SEER population-based study. PLoS One. 9, e94815 (2014).
- Faustino-Rocha, A., et al. Estimation of rat mammary tumor volume using caliper and ultrasonography measurements. Lab Animal. 42, 217-224 (2013).
- Mullen, P. The use of Matrigel to facilitate the establishment of human cancer cell lines as xenografts. Methods in Molecular Medicine. 88, 287-292 (2004).
- Jensen, R. L., Leppla, D., Rokosz, N., Wurster, R. D. Matrigel augments xenograft transplantation of meningioma cells into athymic mice. Neurosurgery. 42, 130-136 (1998).
- Mullen, P., Langdon, S. P. The use of matrigel in the establishment of ovarian carcinoma cell lines as xenografts. Methods in Molecular Medicine. 39, 199-203 (2001).
- Fliedner, F. P., Hansen, A. E., Jorgensen, J. T., Kjaer, A. The use of matrigel has no influence on tumor development or PET imaging in FaDu human head and neck cancer xenografts. BMC Medical Imaging. 16, 5 (2016).
- Mullen, P., Ritchie, A., Langdon, S. P., Miller, W. R. Effect of Matrigel on the tumorigenicity of human breast and ovarian carcinoma cell lines. International Journal of Cancer. 67, 816-820 (1996).
- Zinn, K. R., et al. Noninvasive bioluminescence imaging in small animals. Journal of the Institute for Laboratory Animal Research. 49, 103-115 (2008).
- Troy, T., Jekic-Mullen, D., Sambucetti, L., Rice, B. Quantitative Comparison of the Sensitivity of Detection of Fluorescent and Bioluminescent Reproters in Animal Models. Molecular Imaging. 3 (1), 9-23 (2004).
