Summary
Эта работа предустанавливает передовой протокол для точной оценки нагрузки опухоли путем обнаружения зеленого флуоресцентного белка и биолюминесценции сигналов, а также интеграции метода количественного молекулярного обнаружения.
Abstract
Тройной отрицательный рак молочной железы (TNBC) является агрессивным подтипом рака молочной железы с ограниченными терапевтическими возможностями. По сравнению с пациентами с менее агрессивными опухолями молочной железы, 5-летняя выживаемость пациентов TNBC составляет 77% из-за их характерного лекарственно-устойчивого фенотипа и метастатического бремени. С этой целью были созданы моделя мочеиспускательного фактора, направленные на выявление новых терапевтических стратегий, ограничивающих рост опухоли TNBC и метастатическое распространение. Эта работа описывает практическое руководство для модели ортотопических TNBC, где MDA-MB-231 раковые клетки молочной железы приостановлено в подвале мембраны матрицы имплантируются в четвертом молочной жирной площадки, которая тесно имитирует поведение раковых клеток у людей. Измерение опухолей по калибру, оценка метастазов легких с помощью in vivo и ex vivo изображений, а также молекулярное обнаружение. Эта модель обеспечивает отличную платформу для изучения терапевтической эффективности и особенно подходит для изучения взаимодействия между первичной опухолью и дистальными метастатическими участками.
Introduction
Приблизительно у одной из восьми женщин в Соединенных Штатах в течение своей жизни будет развиваться инвазивный рак молочной железы, и 10%-20% этих женщин будут диагностированы с агрессивным тройным отрицательным раком молочной железы (TNBC) подтипом. В то время как первичные поражения могут быть удалены хирургическим путем в большинстве случаев, субклинический микрометастаз и химиорезделает делают его неразрешимым заболеванием. Важно отметить, что большинство пациентов с метастатическим TNBC в конечном итоге рецидив, даже если они прошли лечение в ранней стадии1. Таким образом, неоднородность рака, микрометастаз и терапевтическая устойчивость являются тремя основными проблемами, ограничивающими успешные клинические результаты пациентов TNBC. Следовательно, существует настоятельная необходимость лучше понять полиморфный молекулярный фон TNBC и разработать эффективные терапевтические агенты, которые ограничивают метастатическое заболевание.
Метастазопухоли опухоли является многоступенчатый процесс, где опухолевые клетки контролирует и узурпирует свою микросреду, чтобы содействовать своему собственному распространению через деградацию мембраны и опухолевые клетки бежать от первичного поражения, через вход в (т.е. интравазация) и выход из (т.е. экстравазация) сосуды, и в конечном итоге адаптации и колонизации в дистримуляции2. Модели животных были разработаны для изучения метастазов рака молочной железы, где обычно внедряются две методологии: прямая инъекция кровообращения и ортотопическая имплантация. Обычно используемые методы для прямого инъекции кровообращения включают инъекции хвостовой вена, в то время как другие подходы, включая прямую инъекцию сердца3, прямой инъекции мозга4, и прямой инъекции печени5 также были использованы. Прямая инъекция кровообращения часто называют моделью искусственного метастаза, которая быстра и проста, но менее физиологически точна, потому что обходит опухоль от первичного поражения и интравазации6,,7,8. По сравнению с прямыми моделями инъекций, ортотопическая модель рака молочной железы занимает больше времени для возникновения обнаруживаемых метастатических поражений в отдаленных органах, таких как легкие, но это более физиологически актуально, потому что она тесно имитирует многоступенчатый метастатический процесс, как это происходит у людей. Важно отметить, что исследование 2013 года9 сравнило инъекцию хвостовой вены и ортотопические модели и обнаружило, что раковые клетки молочной железы вводятся в хвостовую вену, а те, которые изолированы от метастатических поражений легких после инъекции хвостовой вена, продемонстрировали аналогичные глобальные профили экспрессии генов. В отличие от этого, глобальный профиль экспрессии генов ортотопически вводили клетки рака молочной железы резко отличается от метастатических поражений легких, возникающих из ортотопически вводили клетки9. Эти наблюдения показывают, что ортотопическая модель более физиологически актуальна, потому что метастатические поражения проходят процесс отбора, аналогичный многоступенчатому процессу метастаза, как это происходит у людей.
Эта работа описывает ортотопический рак молочной железы (MDA-MB-231-Luc/GFP) модель в обнаженных мышей, которая была оптимизирована в нашей лаборатории для методов обнаружения изображений, а также выявление новых биомаркеров и развитие целевых химиотерапевтических агентов.
Protocol
Анализ роста опухоли проводился с использованием протоколов, утвержденных Комитетом по этике экспериментов на животных Национального института рака и в соответствии с рекомендациями Национального исследовательского совета США «Руководство по уходу и использованию Лабораторные животные", "Руководство службы общественного здравоохранения США по уходу и использованию лабораторных животных" и "Политика по гуманной помощи и использованию лабораторных животных".
1. Подготовка клеток к имплантации
ПРИМЕЧАНИЕ: MDA-MB-231 клетки аденокарциномы молочной железы человека (коммерчески приобретенные) были застылы с геном люциферазы III и усиленным зеленым флуоресцентным белком (GFP) маркером лентивирусом и выращены в присутствии отборного антибиотика (пуромицин) .
- Начните с культуры клеток с 1 х 106 MDA-MB-231-Luc/GFP клеток и добавить 15 мл прегрева (37 кК) RPMI 1640 среды с 10% плода бычья сыворотки (FBS) в T75 культуры колбу. Держите клетки, растущие в контролируемом температурой инкубаторе клеточной культуры при температуре при температуре с 5% CO2. Замените полную среду не менее 2 раз в неделю.
ПРИМЕЧАНИЕ: Не нарушайте рост клеток и следите за условиями выращивания клеток ежедневно. Клетки должны быть субкультурными, когда они достигают 85%-90% устойчивости для поддержания фазы распространения. - За неделю до шага имплантации клеток, удалить пуромицин из колбы клеточной культуры, сначала удалив все среды в культуре колбу, затем промыть 2x с 10 мл 1x фосфат буферного соления (PBS), и, наконец, заменив среду с полной среде без пуромицина. Во время среднедобавляльных и промывочных шагов не нарушайте клетки. Помните, чтобы не использовать полную среду с выбором антибиотиков с этого момента для всех средних шагов пополнения.
- В день подготовки клеток к имплантации, удалить все средства до трипсиза, чтобы избежать деактивации трипсина. Добавьте 5 мл трипсина в колбу, чтобы провести промысел клеток. Мониторинг клеток и убедитесь, что они отсоединяются от культуры колбы.
- После того, как большинство клеток отделить, добавить 10 мл полной среде, чтобы нейтрализовать активность трипсина. Затем перенесите суспензию клетки на центрифугу мощностью 50 мл и центрифугу на 150 х г, чтобы пролететь клетки. Удалите супернатант после центрифугации, а затем добавьте 10 мл 1x PBS, чтобы повторно приостановить клетки и подготовиться к подсчету клеток.
- Подсчитайте клетки с клеточной счетчик и настроить концентрацию клеток до 20 х 106 клеток / мл в холодной 1x PBS, содержащий 25% подвалм мембранной матрицы. Введите 2 х 106 клеток в 0,1 мл 1x PBS с 25% подвалм мембранной матрицы в четвертом молочного жира площадку каждой мыши. Принесите дополнительные иглы и шприцы для имплантации клеток и держите клеточную-мембранно-матричную смесь на льду до имплантации.
ПРИМЕЧАНИЕ: Существует мертвое пространство в шприц и иглы. В зависимости от выбора иглы и шприца длина, тип и размер, шприц туберкулина с 0,5 в 26 G игла может иметь до 70 Зл мертвого пространства10. Подготовьте на 40%-50% больше смеси имплантации клеток, чтобы компенсировать мертвое пространство и любые другие случайные потери.
2. Ортотопическая модель рака молочной железы и измерение размера опухоли
- Разрешить 6-недельный самка агимических обнаженных мышей акклиматизироваться в жилом учреждении, по крайней мере за 1 неделю до имплантации клеток.
ПРИМЕЧАНИЕ: Использование мышей того же возраста уменьшит изменение данных. - Для каждого раунда, анестезируйте пять мышей с изофлюранина на 4% с фильтрованным (0,2 мкм) воздуха при скорости потока 1 л / мин в течение 3'4 мин. Обратите внимание на скорость дыхания мыши и изменения шаблона, и использовать щепотку ног, чтобы убедиться, что мыши находятся под надлежащей анестезией. Как только они больше не двигаются, удалите одну мышь и поместите нос конуса над носом и ртом с той же анестезией.
- Swab левой4-й молочной железы с алкоголем. Используя мелкие щипцтого зуба крысы, поднимите4-й молочной железы немного, чтобы вставить 25 G иглы. Убедитесь, что игла bevel вверх, а затем слегка тянуть поршень, чтобы убедиться, что игла не попадает в кровеносные сосуды. Если кровь не попадает в шприц, продолжайте медленно вводить 100 л клеточно-подвал-мембранно-матричную смесь в маммарийской жировой площадке.
ПРИМЕЧАНИЕ: Круглая, приподнятая область появится под кожей. - Подождите, чтобы мембранная матрица подвала затвердела, а затем удалите иглу. Повторите процесс с оставшимися мышами в индукционной камере. Поместите все использованные иглы и шприцы в острую коробку.
- Используйте тот же сайт инъекции молочной железы для всех мышей. Держите закрыть глаза на месте инъекции и обратите внимание на любой клеточной имплантации смесь просачивается из места инъекции.
ПРИМЕЧАНИЕ: В течение нескольких минут, мышь начнет прийти в сознание. - Разрешить ксенотрансплантат расти свободно без каких-либо перерывов в течение 7-10 дней до любого измерения размера опухоли.
- Изучите всех мышей на размер ксенотрансплантата. Измерьте размер опухоли с помощью калипера. Определите объем опухоли (мм3)со следующим уравнением:
где L является самым длинным измерением и W является кратчайшим измерением перпендикулярно L. - Выявлять и удалять выбросы, превышающие одно стандартное отклонение среднего значения. Используйте только мышей с сопоставимыми размерами опухоли для экспериментов. Случайно разделить мышей на различные группы лечения и начать лечение.
- Измерьте размер опухоли по калиперу 2 раза в неделю. Следите за всеми физическими изменениями ксенотрансплантатов (т.е. некроза, рваной раны).
3. В vivo биолюминесценции и ex vivo флуоресценции изображений
ПРИМЕЧАНИЕ: В этом исследовании, как двумерные биолюминесценции и флуоресценции изображения проводятся в конечной точке эксперимента. Биолюминесценция (BLI) была выполнена с помощью коммерческого доклинического оптического сканера, оснащенного 16-битной охлажденной камерой CCD и нагретой стадией визуализации.
- Перед визуализацией анестезируйте до пяти опухолевых мышей в индукционной камере, установив изофлуран на 3% с фильтрованным (0,2 мкм) воздухом при скорости потока 1 л/мин в течение 3-4 мин. Определите анестезию щепоткой. Убедитесь, что индукционная камера хранится внутри вентилируемого капюшона, чтобы свести к минимуму воздействие изофруран омовена.
- Администрирование D-люциферина (150 мг/кг) для анестезирующих мышей интраперитонеальным маршрутом с помощью иглы 27 G и перенесите анестезию мыши в камеру изображения. В камере визуализации сканера, поддерживать изофлуран на 2% и 2,5% с O2 в качестве носителя с скоростью потока 1 л / мин.
ПРИМЕЧАНИЕ: Поддержание температуры тела мыши на уровне 37 градусов по Цельсию во время процедуры, сохраняя подогрев омыльной площадки под наркозозом индукционной камеры, стол изображений (если этап не нагревается), и послепроцедурной клетки восстановления. - Перед визуализацией исследования мышей, получить люциферина кинетики путем визуализации трех дополнительных опухолей подшипников мышей (животных, не назначенных для каких-либо групп исследования) в общей сложности 40 минут, используя следующие параметры: возбуждение фильтр-заблокирован, выбросы фильтр-открытый, f/stop 1, FOV-D, средний binning (8 х 8), и автоматическое воздействие. Используйте пиковый биолюминесценционный сигнал, измеренный для определения оптимального временного окна приобретения изображения для всех последующих точек времени.
- Выполняя метастазирование, защитите высокий сигнал BLI от первичной опухоли, покрывая его рукавом, вырезанным из черной перчатки. Приобретите изображение, используя те же параметры, описанные в шаге 3.3 с брюшной стороной мыши, обращенной к камере для визуализации метастаз легких, и сонной стороной мыши, обращенной к камере для визуализации метастазизов мозга.
ПРИМЕЧАНИЕ: Важно проверить несколько различных марок черных перчаток, чтобы выбрать один с минимальным автоматической люминесценции. - Используя программное обеспечение для анализа сканеров и данных, нарисуйте стандартную область формы, интересуемый (ROI) над грудной полости или мозгом, гарантируя, что весь орган, представляющий интерес, будет покрыт для оценки метастатического бремени. Количественное биолюминесценции (BL) выход как общий поток (фотоны/секунда).
- Сразу же после BLI, эвтаназии мыши через CO2 удушья (в зависимости от руководящих принципов ACUC и учреждения утвержденных животных протоколов) и извлечь легких и мозга с вскрытия ножницами и щипцы для ex vivo изображений.
ПРИМЕЧАНИЕ: Легкое, извлеченное для визуализации ex vivo и для подсчета узлов легочных узлов, не может быть выполнено на той же мыши из-за несовместимых процедур. - Быстро промыть все органы с 1x PBS, чтобы удалить любые поверхностные пятна крови и место органов на низкой аутофлооресценции, черная пластиковая пластина. Транспорт органов к многоспектральному флуоресценционному сканеру, оснащенному спектральной возможностью несмешивания (твердое состояние жидкой кристаллической длины волны настройки) с 12-битной камерой CCD для обнаружения GFP.
- Приобретите многоспектральные gFP-изображения (фильтр excitation No 457 и 23 нм; эмиссионный фильтр длиной 490 нм) извлеченных органов и неопухолевых подшипников-контрольных мышей путем сканирования через 500-720 нм при размере шага 10 нм. Используйте вырезанные органы из неопухолевых подшипников контроль ных мышей, чтобы исправить для автофлуоресценции.
- После многоспектральной визуализации GFP определите оптимальные настройки изображения. Выполняйте приобретение изображений всех целевых органов и проводите анализ изображений (т.е. создает спектральную библиотеку для автофлюоресценции и GFP для процедуры спектрального несмешивания) в соответствии с протоколом производителя.
4. Молекулярное обнаружение метастатических раковых клеток молочной железы
- После изображения ex vivo, оснастки заморозить весь мозг в жидком азоте и хранить при -80 градусов по Цельсию в морозильной камере до готовности к извлечению ДНК.
- Для извлечения ДНК, положить весь мозг в 5 мл гомогенизации трубки с 2 мл буфера лизиса ДНК. Используйте гомогенизатор с настройкой мощности на 50, чтобы гомогенизировать оснастки замороженных всей ткани мозга. После того, как ткань мозга полностью гомогенизирована, перенесите 1 мл суспензии (лизата) в DNase-бесплатно и RNase-бесплатно 2 мл микроцентрифуги трубки и продолжать изолировать ДНК в соответствии с протоколом производителя.
ПРИМЕЧАНИЕ: Чтобы свести к минимуму перенос ДНК загрязнения, тщательно очистить гомогенизатор после каждого образца, сначала промыть его с 75% этанола в DNase-бесплатной и RNase-свободной воды, а затем промыть с 1 M NaOH решение, а затем промыть с 75% этанола в DNase-бесплатно и RNase-свободной воды для того чтобы эффектно уменьшить и уничтожить любое остаток дна. - Добавьте 0,5 мл 100% этанола из буфера лиза ДНК в лизат. Смешайте образец путем инверсии и хранить при комнатной температуре в течение 3 мин.
ПРИМЕЧАНИЕ: Не инвертировать слишком много раз или слишком энергично. ДНК будет видна как шерстяной осадок. - Используйте наконечник пипетки для передачи ДНК на свежий DNase-бесплатно и RNase-бесплатно 2 мл микроцентрифуг трубки. Дайте пробе воздуха высохнуть в течение 1 мин. Добавить 1 мл 75% этанола и инвертировать микроцентрифуг трубки 3'6x для мытья образца ДНК. Откажитесь от этанола после каждой стирки путем пипетки. Повторите шаг стирки 2x.
- Воздух высушивает образец ДНК в течение 10 с. Затем добавьте 52 кл. 8 мМ NaOH, чтобы растворить образец ДНК. Пипет 2 Зл образца ДНК для количественной оценки ДНК, и использовать оставшиеся 50 Зл для анализа ПЦР в режиме реального времени после корректировки концентрации.
ПРИМЕЧАНИЕ: NaOH помогает полностью утолить образец ДНК. - Количественная 2 зл и каждый образец ДНК с помощью спектрофотометра и использование коэффициента абсорбции между A260/280 в качестве ссылки проверки качества. Рассчитайте концентрацию ДНК с помощью этой формулы:
- Отрегулируйте концентрацию ДНК до 50 нг/Л. Для каждого образца ДНК, используйте 50 нг ДНК в качестве стартового шаблона для анализа ПЦР в режиме реального времени. Используйте 8 мМ NaOH раствор или DNase-бесплатно и RNase-свободной воды, чтобы разбавить образец ДНК.
- Дизайн грунтовки пара, специфичная для экзогенного зеленого белка флуоресценции (GFP) последовательности в доме с помощью веб-портала с открытым исходным кодом грунтовки дизайн для обнаружения в режиме реального времени PCR тега в метастатических клетках, которые вторглись и колонизированы дистальных сайтов.
ПРИМЕЧАНИЕ: Это исследование используется F: 5'-AGAACCATCAAGGTGAAC-3', R: 5'-TGCTCAGGGGGGGGTGTGTCG-3'. - Используйте быстрый реагент ПЦР в реальном времени и пкр-машину в реальном времени, которая поддерживает быстрый протокол ПЦР в реальном времени. В дополнение к регулярным шагам усиления 30 циклов, добавьте шаг кривой диссоциации к концу запуска для обнаружения любого неспецифического усиления.
ПРИМЕЧАНИЕ: Для молекулярного обнаружения были использованы следующие условия: 95 градусов по Цельсию 2 мин горячего старта, 40 циклов 95 градусов по Цельсию 5 с, 60 градусов по Цельсию 15 с и, наконец, анализ ампложения. Размер ампликона GFP составляет 135 б.п. - Используйте наивную ДНК мозга мыши (не имплантат клетки MDA-MB-231) в качестве отрицательного контроля. Используйте ДНК, извлеченные из клеток MDA-MB-231-GFP/Luc, в качестве положительного контроля. Добавьте все реагенты ПЦР без шаблона ДНК в качестве элемента управления (NTC).
ПРИМЕЧАНИЕ: Контроль ПЦР необходим для каждого асссеа ПЦР.
5. Метастатическое обнаружение раковых клеток молочной железы в легких
- Для мышей подгруппа выбрана для метастатического учета легких конкреции, анестезирует мышей с изофлуран (как в шаге 2.2) сразу после изображения ex vivo, выполнить прокол сердца для сбора крови, а затем эвтаназии путем вывиха шейки матки.
- Откройте грудную полость с вскрытия ножницами и вырезать мимо сердца и тимуса, чтобы разоблачить трахеи.
- Вставьте шприц 10 мл с иглой 22 G, содержащей раствор Буина, в трахею. Нажмите шприц поршень, пока рухнул легких опухшие с 2 мл раствора Буин. Удалите шприц и иглу, как только легкие были завышены.
- Поместите все легкое в трубку 15 мл, содержащую раствор Буина, аккуратно инвертировать трубку несколько раз, и дайте впитаться в течение 24 ч при комнатной температуре.
- После 24 ч, удалить раствор Буин из трубки, промыть легкое водой, а затем поместить его обратно в трубку с 70% этанола. Считайте метастазирование (белые пятна или конкреции) на поверхностях легких с помощью рассекающего микроскопа.
6. Сбор и анализ данных
- Запись данных об объеме опухоли, а также данных in vivo и ex vivo, в электронной электронной таблице для легкого ввода, сбора и управления данными.
- В конце эксперимента все данные будут передаваться в электронную электронную таблицу и статистическое программное обеспечение для построения данных и статистического анализа.
Representative Results
Измерение объема опухоли по калибру является устоявшимся методом оценки эффективности лечения(рисунок 1). Количество имплантированных клеток, использование мембранной матрицы, микробиома, чистоты объекта и места инъекций являются ключевыми факторами, влияющими на темпы роста опухоли.
В отличие от gFP-изображения, BLI требовала введения субстрата люциферазы по крайней мере за 15–20 минут до получения BLI изображения. Кроме того, штамм мыши, клеточная линия, лечение и лучифераза репортер все влияют на уровень биолюминесценции сигнала. Таким образом, для получения сопоставимых сигналов между исследуемыми группами необходимо провести кинетический исследование BLI для определения наилучших временных рамок изображения(рисунок 2).
Из-за превосходного соотношения сигнала к фону26,27, все тело в vivo биолюминесценции изображения была довольно чувствительной в обнаружении низкого уровня метастазов сигнала по сравнению с gFP подход (Рисунок 3). Кроме того, биолюминесценционный сигнал обеспечивал более глубокое проникновение, чем GFP, на несколько миллиметров. Тем не менее, производство биолюминесценционных сигналов требует АТФ, что является ограничивающим фактором при оценке образцов тканей ex vivo. Если животные обрабатываются быстро, то BLI может быть жизнеспособным подходом для получения количественных результатов по метастазам. Одним из способов достижения этой цели является обработка одного животного за один раз. Однако, этот подход не был осуществим для этого изучения потому что большая когорта мышей была использована. BLI сигнал не был обнаружен, когда органы были изображены около 45 мин после инъекции люциферина. Использование двойной линии ячейки репортера полезно в этой ситуации. Из-за стабильного характера молекулы GFP, исследователи будут иметь достаточно времени для обработки туши до захвата сигналов GFP от органов-мишеней(Рисунок 4).
Рисунок 5 является реальным примером того, как измерения размера размера катела могут исказить интерпретацию данных, потому что ксенотрансплантат потерял большую часть жизнеспособного содержания опухолевых клеток, но все еще поддерживал свою большую массу и форму. Гистопатологическая экспертиза этих ксенотрансплантатов показала некроз внутри массы(рисунок 5В).
Для исследователей, которые бросают вызов результатам визуализации в отношении метастазировать мозга в ортотопической модели рака молочной железы, молекулярное обнаружение в режиме реального времени ПЦР может обеспечить убедительные доказательства (Рисунок 6). В этом случае экзогенная последовательность ДНК GFP была лучшим способом решения этой проблемы, поскольку трансинфицированная последовательность ДНК GFP, естественно, не существует у людей или грызунов.
Рисунок 1: Измерение объема опухоли. Измерение объема опухоли/загрузки с помощью капилята началось на 10-й день после имплантации ксенотрансплантата, а затем измерялось 2жды в неделю до конца эксперимента. Бары ошибок рассчитываются по значению SEM. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой цифры.
Рисунок 2: Определение оптимального окна приобретения изображения. Слева: Одна мышь с большим ксенотрансплантатом и одна мышь с небольшим ксенотрансплантатом были выбраны для оптимального определения кинетического диапазона люцерина. Справа: Люциферин кинетической кривой, полученной путем приобретения изображений каждые 2 мин в течение 40 минут. Плато наблюдалось между 15–22 мин, которое использовалось в качестве оптимального времени для получения изображения для всех последующих изображений. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой цифры.
Рисунок 3: Все тело BLI изображений. L: Визуализация всего тела BLI. M: Вентральный вид с нижней части тела, покрытой рукавом черной перчатки. R: Дорсальный вид с нижней части тела, покрытой рукавом черной перчатки. Метастазирует подмышечный лимфатический узлы в брюшной области с помощью BLI-изображения. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой цифры.
Рисунок 4: Ex vivo BLI/GFP обнаружение сигнала. Сигналы GFP были обнаружены в мозге и легких от той же мыши 20 минут после мыши был принесен в жертву. BLI сигнал не был обнаружен 45 мин после инъекции люциферина. Сигнал GFP не был обнаружен в мозге и легких наивных мышей. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой цифры.
Рисунок 5: Преимущества методов оптической визуализации по сравнению с измерениями калибра. (A) Представитель изображение, показывающее in vivo GFP обнаружение сигнала в первичной опухоли. Лишь незначительная часть ксенотранспланта показала сигнал GFP, что свидетельствует о том, что значительная часть массы была стромы. Это не может быть определено традиционными измерениями калибра и может привести к неточному выводу. Этот пример подчеркивает важность оптической визуализации для исследования модели животных. (B) Гистопатология разделе той же мыши, показывающие, что некротический регион (т.е. внутренняя область) также способствовали расчет размера опухоли. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой цифры.
Рисунок 6: Анализ кривой плавления. График кривой плавления, показывающий специфику ампликонов GFP. ДНК из мозга, полученного от MDA-MB-231-Luc/GFP-имплантированных мышей и ДНК, изолированной из MDA-MB-231-Luc/GFP клеток, выращенных в культуре (положительный контроль) были анализированы. В режиме реального времени ПЦР анализ был выполнен для оценки содержания GFP в ткани мозга. (A, B) Таяние кривых положительного контроля и ДНК, извлеченных из мозга мыши, соответственно. (C) перекрывающиеся кривые панелей A и B, указывающие на пиковые сигналы от DNAs мозга мыши специфичны для экзогенной последовательности GFP. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой цифры.
Discussion
Для изучения TNBC у животных были разработаны две модели мурин: MDA-MB-231 клеток аденокарциномы молочной железы человека у иммунно-компрометированных мышей (т.е. агимических обнаженных мышей, NSG мышей), и 4T1 у иммунокомпетентных МЫшей BALB/c. Обе модели имеют свои преимущества. Выбор модели животного для исследования зависит от целей исследования. Например, модель MDA-MB-231 представляет собой человеческую клеточную линию TNBC, выращенную у мышей с ослабленным иммунитетом, которая имитирует иммунодепрессированных больных раком молочной железы человека. С другой стороны, инвазивный фенотип ортотопических 4T1 тройной отрицательный морин раковых клеток молочной железы у мышей BALB/c тесно имитирует метастатический процесс, как это происходит в стадии IV больных раком молочной железы человека. В отличие от внутривенных инъекционных клеток подход, человека MDA-MB-231 раковые клетки молочной железы были аналогичным образом введены в молочной жировой площадки11,12 в ортотопической модели рака молочной железы11,13. Чем дольше рост опухоли и приобретенные метастатические способности более физиологически актуальны, таким образом, это не искусственный метастатический рак модель4,14. Такая модель спонтанного метастаза тесно имитирует развитие рака молочной железы человека, за исключением стадии инициации. Это важнейшая модель для скрининга препарата In vivo и терапевтической оценки эффективности при метастатическом раке молочной железы.
Место имплантации опухоли в мыши играет решающую роль в обеспечении микросреды, которая поддерживает рост опухоли и выбор метастатического фенотипа, аналогичного тому, что происходит у людей. Проксимальный лимфатический узло и наличие жировой ткани являются ключевыми факторами, влияющими на прогрессирование заболевания раком молочной железы15,16. У пациента, лимфатический узла и жировой ткани являются ключевыми взаимодействующими факторами, влияющими на злокачественность и заболеваемость раком молочной железы17,18,19. Таким образом, выбор правильного анатомического расположения для места инъекции может сильно повлиять на релевантность опухолевой модели по сравнению с болезнью человека. В этом исследовании использовалась четвертая молочной железы в качестве места имплантации главным образом из-за вышеупомянутых требований и что она анатомически более доступна и проще в использовании.
Различные методы расчета объема опухоли доступны, и исследователь может выбрать любой, что они считают нужным. Алгоритм, выбранный для этого исследования, основан на выводах Фаустино-Роши и др., который сравнил различные формулы расчета объема опухоли и пришел к выводу, что формула ниже является наиболее точной20.
Подвал мембранной матрицы является важной внеклеточной матрицы, используемой в различных in vitro21 и in vivo22,23 анализов. Есть противоречивые сообщения22,24,25 о влиянии мембранной матрицы подвала на злокачественность ксенотрансплантата. Это, кажется, только влияют на первоначальное создание ксенотрансплантата и не имеют дальнейшего влияния на рост ксенотрансплантата25. Для ксенотрансплантата имплантации описано, подвал мембраны матрицы была смешана с раковыми клетками, чтобы увеличить клеточной / гель микс раствора вязкости до имплантации. Наличие мембранной матрицы в подвале уменьшает потерю раствора смеси из места инъекции и удерживает раствор смеси в месте имплантации, тем самым увеличивая однородность имплантированного объема ксенотрансплантата.
Линия клеток MDA-MB-231 является злокачественной увековеченной аденокарциномой клеточной линии молочной железы человека и является популярным инструментом в исследованиях рака молочной железы из-за его тройного отрицательного статуса. Использование двойной репортеров (люциферазы и GFP) клеточной линии позволяет большую гибкость в обработке in vivo и ex vivo изображений. Хорошо известно, что биолюминесценционный сигнал обладает большей чувствительностью, глубиной и превосходным контрастом (соотношение сигнала к шуму), чем сигналы GFP. Из-за этого, это широко используемая модальность изображения для всего тела изображения. К сожалению, обнаружение биолюминесценции ограничено узким временной окном (15–20 минут после инъекции люциферина), в течение которого обнаружение сигнала является линейным. BlI сигнал быстро уменьшается, когда животные усыплены. Это становится экспериментальной проблемой дизайна, если многие мыши должны быть усыплены и уборки нескольких тканей или органов не требуется. В этих исследованиях кровь была собрана путем прямого прокола сердца, мозг, первичная опухоль, легкие, и пораженные лимфатические узлы были исследованы у 40 мышей. К тому времени, когда органы были собраны и готовы к изображению ex vivo, сигнал биолюминесценции был необнаружен. Таким образом, обнаружение GFP более подходит в таких ситуациях. Выброс сигнала GFP находится в видимом диапазоне, и при этих длинах волн поглощение сигнала за счет крови (т.е. гемоглобина) значительно выше. Кроме того, автофлуоресценция в видимом диапазоне из-за NADH, липопигментов и флавинов приводит к значительному фону, что затрудняет различение между низкоуровневым сигналом GFP и фоном автофлюоресценции. Использование многоспектрального подхода к визуализации флуоресценции вместо традиционной визуализации фильтр-пары и использование спектральных алгоритмов несмешивания помогает определить истинный сигнал GFP в интересуемом органе. Таким образом, путем объединения сильных биолюминесценции изображения во всем теле in vivo обнаружения и многоспектральных GFP изображений в ex vivo органа / ткани оценки, количественные данные могут быть максимально в большой когорте мышей.
Независимо от того, какой подход выбран для исследования на животных, извлечение всей крови до извлечения органов / ткани настоятельно рекомендуется, особенно для исследований, направленных на метастатическое бремя. Этот протокол обнаруживает сигналы GFP от всего образца крови, полученные от мышей (данные не показаны) в ортотопической модели рака молочной железы в режиме реального времени ПЦР-анализов. Минимизация объема крови в органах/тканях уменьшит ложноположительный сигнал в органах-мишенях.
В заключение, ортотопические модели рака молочной железы с использованием MDA-MB-231-Luc / GFP клетки является весьма актуальной модели животных, которые тесно имитируют человека TNBC состояние пациента. Эта модель имеет важное значение для изучения, мониторинга и оценки терапевтической эффективности в микросреде опухоли, похожей на человека. Использование двойной репортер клеточной линии еще больше повышает практичность этой ортотопической модели рака молочной железы.
Disclosures
Авторам нечего раскрывать.
Acknowledgments
Авторы хотели бы отметить поддержку Программы интрамуральных исследований Национальных институтов здравоохранения, Национального института рака, Bethesda MD, программы рака и воспаления, и Национальной лаборатории Фредерика - Программа визуализации малых животных, Лейдос биомедицинских исследований, Inc, Фредерик Мэриленд, США.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Bouins Solution | Sigma | HT10132-1L | Lung metastatic nodule staining |
| D-Luciferin, Potassium Salt | GoldBio | LUCK-1G | Luciferase substrate |
| DNAzol | ThermoFisher | 10503027 | DNA extraction Kit |
| Excel | Microsoft | Spreadsheet software | |
| homogenizer | Virtis | Cyclone Virtishear | For tissue homogenization |
| IVIS SPECTRUM scanner | Perkin Elmer | fluorescence and BLI imaging system | |
| Maestro GNIR-FLEX fluorescence scanner | Perkin Elmer | fluorescence imaging system | |
| MatriGel Matrix | Corning | 356234 | Store at -20C and keep old (4 C) when in use. |
| MDA-MB-231 / Luciferase-2A-GFP Stable Cell Line | GenTarget | SC044 | Dual Reporter human breast cancer cell line |
| Microscope | ThermoFisher | EVOS | histology image capture |
| Phosphate-Buffered Saline | ThermoFisher | 10010049 | rinse buffer |
| Primer3 | MIT | Primer Design | |
| Prism | GraphPad | Statistical Analysis Software | |
| Puromycin | ThermoFisher | A1113803 | Antibiotics |
| RPMI 1640 media | ThermoFisher | 61870127 | Culture media |
| SeniFAST SYBR Lo-ROX kit | Bioline | BIO-94020 | Fast Real-Time PCR Reagent |
| StepOne Plus Real-Time PCR system | ThermoFisher | Real-Time PCR machine |
References
- Abramson, V. G., Lehmann, B. D., Ballinger, T. J., Pietenpol, J. A. Subtyping of triple-negative breast cancer: implications for therapy. Cancer. 121, 8-16 (2015).
- Zhuang, X., Zhang, H., Hu, G. Cancer and Microenvironment Plasticity: Double-Edged Swords in Metastasis. Trends in Pharmacological Sciences. 40 (6), 419-429 (2019).
- Campbell, J. P., Merkel, A. R., Masood-Campbell, S. K., Elefteriou, F., Sterling, J. A. Models of bone metastasis. Journal of Visualized Experiments. (67), e4260 (2012).
- Saha, D., et al. In vivo bioluminescence imaging of tumor hypoxia dynamics of breast cancer brain metastasis in a mouse model. Journal of Visualized Experiments. (56), e3175 (2011).
- Goddard, E. T., Fischer, J., Schedin, P. A Portal Vein Injection Model to Study Liver Metastasis of Breast Cancer. Journal of Visualized Experiments. (118), e54903 (2016).
- Lim, E., et al. Monitoring tumor metastases and osteolytic lesions with bioluminescence and micro CT imaging. Journal of Visualized Experiments. (50), e2775 (2011).
- Bauerle, T., Komljenovic, D., Berger, M. R., Semmler, W. Multi-modal imaging of angiogenesis in a nude rat model of breast cancer bone metastasis using magnetic resonance imaging, volumetric computed tomography and ultrasound. Journal of Visualized Experiments. (66), e4178 (2012).
- Katsuta, E., Oshi, M., Rashid, O. M., Takabe, K. Generating a Murine Orthotopic Metastatic Breast Cancer Model and Performing Murine Radical Mastectomy. Journal of Visualized Experiments. (141), e57849 (2018).
- Rashid, O. M., et al. Is tail vein injection a relevant breast cancer lung metastasis model? Journal of Thoracic Disease. 5, 385-392 (2013).
- Bhambhani, V., Beri, R. S., Puliyel, J. M. Inadvertent overdosing of neonates as a result of the dead space of the syringe hub and needle. Archives of Disease in Childhood: Fetal and Neonatal Edition. 90, F444-F445 (2005).
- Zhang, G. L., Zhang, Y., Cao, K. X., Wang, X. M. Orthotopic Injection of Breast Cancer Cells into the Mice Mammary Fat Pad. Journal of Visualized Experiments. (143), e58604 (2019).
- Tavera-Mendoza, L. E., Brown, M. A less invasive method for orthotopic injection of breast cancer cells into the mouse mammary gland. Laboratory Animals. 51, 85-88 (2017).
- Paschall, A. V., Liu, K. An Orthotopic Mouse Model of Spontaneous Breast Cancer Metastasis. Journal of Visualized Experiments. (114), e54040 (2016).
- Kocaturk, B., Versteeg, H. H. Orthotopic injection of breast cancer cells into the mammary fat pad of mice to study tumor growth. Journal of Visualized Experiments. (96), e51967 (2015).
- Fletcher, S. J., et al. Human breast adipose tissue: characterization of factors that change during tumor progression in human breast cancer. Journal of Experimental and Clinical Cancer Research. 36, 26 (2017).
- Giuliano, A. E., et al. Axillary dissection vs no axillary dissection in women with invasive breast cancer and sentinel node metastasis: a randomized clinical trial. Journal of the American Medical Association. 305, 569-575 (2011).
- Rummel, S., Hueman, M. T., Costantino, N., Shriver, C. D., Ellsworth, R. E. Tumour location within the breast: Does tumour site have prognostic ability? Ecancermedicalscience. 9, 552 (2015).
- Kroman, N., Wohlfahrt, J., Mouridsen, H. T., Melbye, M. Influence of tumor location on breast cancer prognosis. International Journal of Cancer. 105, 542-545 (2003).
- Bao, J., Yu, K. D., Jiang, Y. Z., Shao, Z. M., Di, G. H. The effect of laterality and primary tumor site on cancer-specific mortality in breast cancer: a SEER population-based study. PLoS One. 9, e94815 (2014).
- Faustino-Rocha, A., et al. Estimation of rat mammary tumor volume using caliper and ultrasonography measurements. Lab Animal. 42, 217-224 (2013).
- Mullen, P. The use of Matrigel to facilitate the establishment of human cancer cell lines as xenografts. Methods in Molecular Medicine. 88, 287-292 (2004).
- Jensen, R. L., Leppla, D., Rokosz, N., Wurster, R. D. Matrigel augments xenograft transplantation of meningioma cells into athymic mice. Neurosurgery. 42, 130-136 (1998).
- Mullen, P., Langdon, S. P. The use of matrigel in the establishment of ovarian carcinoma cell lines as xenografts. Methods in Molecular Medicine. 39, 199-203 (2001).
- Fliedner, F. P., Hansen, A. E., Jorgensen, J. T., Kjaer, A. The use of matrigel has no influence on tumor development or PET imaging in FaDu human head and neck cancer xenografts. BMC Medical Imaging. 16, 5 (2016).
- Mullen, P., Ritchie, A., Langdon, S. P., Miller, W. R. Effect of Matrigel on the tumorigenicity of human breast and ovarian carcinoma cell lines. International Journal of Cancer. 67, 816-820 (1996).
- Zinn, K. R., et al. Noninvasive bioluminescence imaging in small animals. Journal of the Institute for Laboratory Animal Research. 49, 103-115 (2008).
- Troy, T., Jekic-Mullen, D., Sambucetti, L., Rice, B. Quantitative Comparison of the Sensitivity of Detection of Fluorescent and Bioluminescent Reproters in Animal Models. Molecular Imaging. 3 (1), 9-23 (2004).
