Summary
Questo lavoro preconfigura un protocollo avanzato per valutare con precisione il carico del tumore rilevando segnali di proteina fluorescente e bioluminescenza verdi, nonché l'integrazione della tecnica di rilevamento molecolare quantitativo.
Abstract
Il carcinoma mammario triplo negativo (TNBC) è un sottotipo di cancro al seno aggressivo con opzioni terapeutiche limitate. Rispetto ai pazienti con tumori al seno meno aggressivi, il tasso di sopravvivenza a 5 anni dei pazienti TNBC è del 77% a causa del loro caratteristico fenotipo farmacoresistente e del carico metastatico. A tal fine, sono stati stabiliti modelli murini volti a identificare nuove strategie terapeutiche che limitano la crescita del tumore TNBC e la diffusione metastatica. Questo lavoro descrive una guida pratica per il modello ortotopico TNBC in cui le cellule del cancro al seno MDA-MB-231 sospese in una matrice di membrana seminterrato sono impiantate nel quarto cuscinetto di grasso mammario, che imita da vicino il comportamento delle cellule tumorali negli esseri umani. Vengono discusse la misurazione dei tumori per calibro, la valutazione della metastasi polmonare tramite imaging in vivo ed ex vivo e il rilevamento molecolare. Questo modello fornisce un'eccellente piattaforma per studiare l'efficacia terapeutica ed è particolarmente adatto per lo studio dell'interazione tra il tumore primario e siti metastatici distali.
Introduction
Circa una donna su otto negli Stati Uniti svilupperà un cancro al seno invasivo durante la sua vita, e il 10%-20% di queste donne sarà diagnosticato con il sottotipo aggressivo di cancro al seno triplo negativo (TNBC). Mentre le lesioni primarie possono essere rimosse chirurgicamente nella maggior parte dei casi, la micrometastasi subclinica e la chemoresistance lo rendono una malattia intrattabile. È importante sottolineare che la maggior parte dei pazienti con TNBC metastatico alla fine ricaduta, anche se hanno subito un trattamento nella fase iniziale1. Pertanto, l'eterogeneità del cancro, la micrometastasi e la resistenza terapeutica sono tre sfide principali che limitano l'esito clinico di successo dei pazienti Affetti da TNBC. Pertanto, vi è un urgente bisogno di comprendere meglio lo sfondo molecolare polimorfico della TNBC e sviluppare efficaci agenti terapeutici che limitano la malattia metastatica.
La metastasi tumorale è un processo multifase in cui la cellula tumorale controlla e usurpa il suo microambiente per promuovere la propria diffusione attraverso la degradazione della membrana e la fuga delle cellule tumorali dalla lesione primaria, tramite l'ingresso (cioè, l'intravasazione) e l'uscita dalla (cioè, stravasazione) la vascolatura, e infine l'adattamento e la colonizzazione all'interno dei letti di tessuto distal2. Sono stati sviluppati modelli animali per studiare la metastasi del cancro al seno, dove sono comunemente implementate due metodologie: iniezione diretta di circolazione sanguigna e impianto ortotopico. I metodi comunemente impiegati per l'iniezione diretta di circolazione sanguigna includono l'iniezione di vene della coda, mentre sono stati impiegati anche altri approcci tra cui l'iniezione cardiaca diretta3, l'iniezione diretta del cervello4e l'iniezione diretta del fegato5. L'iniezione diretta di circolazione sanguigna è spesso indicata come un modello di metastasi artificiale, che è veloce e facile ma meno fisiologicamente preciso perché elude la fuga tumorale dalla lesione primaria e dall'intravasation6,7,8. Rispetto ai modelli a iniezione diretta, il modello di cancro al seno ortotopico richiede più tempo per l'insorgenza di lesioni metastatiche rilevabili in organi remoti come il polmone, ma è più fisiologicamente rilevante perché imita da vicino il processo metastatico multifase come si verifica negli esseri umani. È importante sottolineare che uno studio del 20139 ha confrontato l'iniezione di vene della coda e i modelli ortotopici e ha scoperto che le cellule del cancro al seno iniettate nella vena della coda e quelle isolate dalle lesioni metastatiche polmonari dopo l'iniezione di vena della coda hanno mostrato profili di espressione genica globale simili. Al contrario, il profilo di espressione genica globale delle cellule del cancro al seno iniettate ortotopicamente era drammaticamente diverso da quello delle lesioni metastatiche polmonari derivanti da cellule iniettate ortotopicamente9. Queste osservazioni suggeriscono che il modello ortotopico è più fisiologicamente rilevante, perché le lesioni metastatiche subiscono un processo di selezione simile al processo multifase della metastasi come si verifica negli esseri umani.
Questo lavoro descrive un modello di cancro al seno ortotopico (MDA-MB-231-Luc/GFP) in topi nudi che è stato ottimizzato nel nostro laboratorio per le tecniche di rilevamento dell'imaging, nonché l'identificazione di nuovi biomarcatori e lo sviluppo di agenti chemioterapici mirati.
Protocol
L'analisi della crescita del tumore è stata effettuata utilizzando protocolli approvati dal Comitato per l'Etica degli Esperimenti Animali del National Cancer Institute e ha aderito alle raccomandazioni della "Guida per la cura e l'uso del National Cancer Council" "Animali di laboratorio", "Guida per la cura e l'uso degli animali da laboratorio" del Servizio Sanitario Pubblico degli Stati Uniti, e la "Politica sulla cura umana e l'uso degli animali da laboratorio".
1. Preparazione delle cellule per l'impianto
NOTA: le cellule di adenocarcinoma al seno umano MDA-MB-231 (acquisite commercialmente) sono state sincronizzate stabilmente con il gene luciferasi III e il marcatore GFP (Proteina fluorescente verde) potenziata da lentivirus e coltivate in presenza dell'antibiotico di selezione (colonnamicamica) .
- Iniziare la coltura cellulare con 1 x 106 cellule MDA-MB-231-Luc/GFP e aggiungere 15 mL di preriscaldato (37 C) RPMI 1640 medio con 10% siero bovino fetale (FBS) in una fiaschetta di coltura T75. Mantenere le cellule in crescita in un incubatore di colture cellulari a temperatura controllata a 37 gradi centigradi con il 5% di CO2. Sostituire il supporto completo almeno 2 volte a settimana.
NOTA: Non disturbare la crescita delle cellule e continuare a controllare le condizioni di crescita delle cellule ogni giorno. Le cellule devono essere sottocolte quando raggiungono l'85%-90% di confluenza per mantenere la fase di proliferazione. - Una settimana prima della fase di impianto cellulare, rimuovere la puromicina dal pallone di coltura cellulare rimuovendo prima tutto il mezzo nel flacone di coltura, quindi risciacquando 2x con 10 mL di 1x fosfato tamponato salina (PBS), e infine sostituendo il mezzo con mezzo completo senza la puromicina. Durante i passaggi di aggiunta e risciacquo medi, non disturbare le cellule. Ricordati di non usare il supporto completo con gli antibiotici di selezione d'ora in erogazione per tutte le misure di rifornimento medio.
- Il giorno della preparazione delle cellule per l'impianto, rimuovere tutto il mezzo completo prima della prova per evitare di disattivare la trypsin. Aggiungere 5 mL di prova al flacone per provare le cellule. Monitorare le cellule e verificare che si staccano dal pallone di coltura.
- Una volta che la maggior parte delle cellule staccate, aggiungere 10 mL di mezzo completo per neutralizzare l'attività trypsin. Successivamente, trasferire la sospensione cellulare in un tubo di centrifuga di 50 mL e centrifugare a 150 x g a pellet le cellule. Rimuovere il supernatante dopo la centrifugazione e quindi aggiungere 10 mL di 1x PBS per risospendere nuovamente le cellule e prepararsi per il conteggio cellulare.
- Contare le cellule con un contatore cellulare e regolare la concentrazione cellulare a 20 x 106 cellule / mL a freddo 1x PBS contenente 25% matrice di membrana seminterrato. Iniettare 2 x 106 cellule in 0,1 mL 1x PBS con 25% matrice di membrana seminterrato nel quarto cuscinetto di grasso mammario di ogni topo. Portare aghi e siringhe extra per l'impianto cellulare e mantenere il mix cella-basement-membrane-matrice sul ghiaccio prima dell'impianto.
NOTA: C'è spazio morto nella siringa e nell'ago. A seconda della scelta della lunghezza, del tipo e della dimensione dell'ago e della siringa, una siringa di tubercolina con un ago da 0,5 in 26 G può avere fino a 70 spazio morto10. Prepara il 40% in più del 50% di miscela di impianto cellulare in più per compensare lo spazio morto e qualsiasi altra perdita accidentale.
2. Modello di cancro al seno ortotopico e misurazione delle dimensioni del tumore
- Lasciare che i topi nudi atimici femminili di 6 settimane si acclimati all'impianto abitativo per almeno 1 settimana prima dell'impianto cellulare.
NOTA: l'utilizzo della stessa età dei mouse ridurrà la variazione dei dati. - Per ogni round, anestesizzare cinque topi con isoflurane al 4% con aria filtrata (0,2 m) ad una portata di 1 L/min per 3-4 m. Prestare attenzione alla frequenza respiratoria del topo e al cambio di pattern, e utilizzare un pizzico di punta per garantire che i topi siano sotto anestesia adeguata. Una volta che non sono più in movimento, rimuovere un mouse e posizionare un cono naso sul naso e la bocca con la stessa anestesia.
- Swab la ghiandola mammaria sinistra 4th con alcool. Utilizzando pinze sottili per i denti di ratto, sollevare leggermente la ghiandola mammaria 4th per inserire l'ago da 25 G. Assicurarsi che l'ago sia smussato e quindi tirare leggermente lo stantuffo per assicurarsi che l'ago non colpisca i vasi sanguigni. Se nessun sangue entra nella siringa, continuare a iniettare lentamente 100 -L del mix cellula-basement-membrana-matrice nel cuscinetto di grasso mammario.
NOTA: Sotto la pelle apparirà un'area rotonda e sollevata. - Attendere 10-15 s per la matrice della membrana seminterrato per indurire, quindi rimuovere l'ago. Ripetere il processo con i topi rimanenti nella camera di induzione. Mettere tutti gli aghi e le siringhe usati in una scatola affilata.
- Utilizzare lo stesso sito di iniezione della ghiandola mammaria per tutti i topi. Tenere d'occhio il sito di iniezione e notare qualsiasi miscela di impianto cellulare che fuoriesce dal sito di iniezione.
NOTA: Nel giro di pochi minuti, il mouse inizierà a riprendere conoscenza. - Lasciare che lo xenotrapianto cresca liberamente senza interruzioni per 7/10 giorni prima di qualsiasi misurazione delle dimensioni del tumore.
- Esaminare tutti i topi per la dimensione dello xenotrapianto. Misurare la dimensione del tumore con una pinza. Determinare il volume del tumore (mm3) con la seguente equazione:
dove L è la dimensione più lunga e W è la dimensione più breve perpendicolare a L. - Identificare e rimuovere gli outlier che superano una deviazione standard della media. Utilizzare solo topi con dimensioni tumorali comparabili per gli esperimenti. Dividere casualmente i topi in diversi gruppi di trattamento e iniziare i trattamenti.
- Misurare la dimensione del tumore di calibro 2x a settimana. Tenere presente tutti i cambiamenti fisici degli xenografi (ad esempio, necrosi, lacerazione).
3. Bioluminescenza in vivo e imaging a fluorescenza ex vivo
NOTA: In questo studio, sia la bioluminescenza bidimensionale che l'imaging a fluorescenza sono condotte all'endpoint dell'esperimento. L'imaging a bioluminescenza (BLI) è stato eseguito utilizzando uno scanner ottico preclinico commerciale dotato di una telecamera CCD raffreddata a 16 bit e di uno stadio di imaging riscaldato.
- Prima dell'imaging, anestesizzare fino a cinque topi portatori di tumore nella camera di induzione impostando l'isoflurane al 3% con l'aria filtrata (0,2 m) ad una portata di 1 L/min per 3-4 min. Determinare l'anestesia da un pizzico di topo. Assicurarsi che la camera di induzione sia mantenuta all'interno di una cappa oclatata per ridurre al minimo l'esposizione del personale all'isoflurane.
- Somministrare D-lucidferina (150 mg/kg) ai topi anestesi con un percorso intraperitunole utilizzando un ago da 27 G e trasferire un mouse acuito alla camera di imaging. Nella camera di imaging dello scanner, mantenere l'isoflurane al 2%-2,5% con O2 come supporto con una portata di 1 L/min.
NOTA: Mantenere la temperatura corporea del topo a 37 gradi centigradi durante la procedura mantenendo un cuscinetto riscaldato sotto la camera di induzione dell'anestesia, la tabella di imaging (se lo stadio non è riscaldato) e la gabbia di recupero post-procedura. - Prima di immaginare i topi studiati, ottenere la cinetica lucidferina immaginando tre topi con cuscinetto tumorale in più (animali non assegnati ad alcun gruppo di studio) a intervalli di 2 minuti per un totale di 40 min utilizzando i seguenti parametri: filtro di eccitazione bloccato, filtro di emissione-aperto, f/stop 1, FOV-D, binning medio (8 x 8), e esposizione automatica. Utilizzare il segnale di bioluminescenza di picco misurato per definire l'intervallo ottimale del tempo di acquisizione dell'immagine per tutti i punti temporali successivi.
- Durante l'esecuzione dell'imaging metastasi, proteggere l'elevato segnale BLI dal tumore primario coprendolo con una manica tagliata da un guanto nero. Acquisire l'immagine utilizzando gli stessi parametri descritti nel passaggio 3.3 con il lato ventrale del mouse rivolto verso la fotocamera per l'imaging di metastasi polmonare e il lato dorsale del mouse rivolto verso la fotocamera per l'imaging di metastasi cerebrale.
NOTA: È essenziale testare alcune marche diverse di guanti neri per scegliere quello con una luminescenza minima. - Utilizzando uno scanner e un software di analisi dei dati, disegnare una regione di interesse (ROI) di forma standard sulla cavità toracica o sul cervello assicurando che l'intero organo di interesse sia coperto per valutare l'onere metastatico. Quantificare la produzione di bioluminescenza (BL) come flusso totale (fotoni/secondo).
- Subito dopo BLI, eutanasia il topo tramite asfissia di CO2 (secondo le linee guida ACUC e i protocolli animali approvati dall'istituzione) ed estrae il polmone e il cervello con forbici e pinze sezionate per l'imaging ex vivo.
NOTA: Il polmone estratto per l'imaging ex vivo e per il conteggio del nodulo di metastasi polmonare non può essere eseguito sullo stesso mouse a causa di procedure incompatibili. - Risciacquare rapidamente tutti gli organi con 1x PBS per rimuovere eventuali macchie superficiali di sangue e posizionare gli organi su una piastra di plastica nera a bassa autofluorescenza. Trasportare gli organi a uno scanner multispettrale a fluorescenza dotato di capacità di smista (ottimizzazione della lunghezza d'onda del cristallo liquido allo stato solido) con una telecamera CCD a 12 bit per il rilevamento GFP.
- Acquisire immagini GFP multispectrali (filtro di eccitazione - 457 x 23 nm; filtro di emissione - 490 nm long pass) degli organi estratti e dei mouse di controllo dei cuscinetti non tumorali analizzando fino a 500-720 nm con una dimensione di passaggio di 10 nm. Utilizzare organi eccitati da topi di controllo del cuscinetto non tumorali per correggere l'autofluorescenza.
- Dopo l'imaging GFP multispettrale, determinare le impostazioni ottimali di imaging. Eseguire l'acquisizione di immagini di tutti gli organi bersaglio e condurre l'analisi delle immagini (cioè generare una libreria spettrale per l'autofluorescenza e GFP per la procedura di dismissione spettrale) secondo il protocollo del produttore.
4. Rilevamento molecolare di cellule metastatiche del cancro al seno
- Dopo l'imaging ex vivo, lo snap congela l'intero cervello in azoto liquido e conserva a -80 gradi centigradi in un congelatore fino a quando non è pronto per l'estrazione del DNA.
- Per l'estrazione del DNA, mettere l'intero cervello in un tubo omogeneizzato da 5 mL con 2 mL di tampone di lisi di DNA. Utilizzare un omogeneizzatore con l'impostazione di potenza a 50 per omogeneizzare l'intero tessuto cerebrale congelato a scatto. Una volta che il tessuto cerebrale è totalmente omogeneizzato, trasferire la sospensione da 1 mL (lysate) in un tubo di microcentrifuga da 2 mL privo di DNase e Senza RNase e continuare a isolare il DNA secondo il protocollo del produttore.
NOTA: Per ridurre al minimo la contaminazione del DNA di carryover, pulire accuratamente l'omogeneizzatore dopo ogni campione risciacquandolo con il 75% di etanolo in acqua priva di DNase e senza RNase, quindi risciacquare con una soluzione NaOH da 1 M, seguito da una risciacquo con 75% di etanolo in RNase-free acqua per ridurre e distruggere efficacemente qualsiasi residuo di DNA. - Aggiungere al lisata 0,5 mL di 100% di etanolo di DNA. Mescolare il campione per inversione e conservare a temperatura ambiente per 3 min.
NOTA: Non invertire troppe volte o troppo vigorosamente. Il DNA sarà visibile come un precipitato simile alla lana. - Utilizzare una punta di pipetta per trasferire il DNA in un nuovo tubo di microcentrismo da 2 mL privo di DNase e RNase. Lasciare asciugare l'aria del campione per 1 min. Scartare l'etanolo dopo ogni lavaggio con la pipatura. Ripetere il passaggio 2x del lavaggio.
- Asciugare ad aria il campione di DNA per 10 s. Quindi aggiungere 52 ll di 8 mM NaOH per sciogliere il campione di DNA. Pipet 2 - L del campione di DNA per la quantificazione del DNA, e utilizzare il restante 50 -L per un assaggio PCR in tempo reale dopo la regolazione della concentrazione.
NOTA: NaOH aiuta a solubilizzare completamente il campione di DNA. - Quantitate 2 - L di ogni campione di DNA con uno spettrometro e utilizzare un rapporto di assorbimento tra A260/280 come riferimento di controllo di qualità. Calcolare la concentrazione di DNA con questa formula:
- Regolare la concentrazione del DNA a 50 ng/L. Per ogni campione di DNA, utilizzare 50 ng di DNA come modello di partenza per un saggio PCR in tempo reale. Utilizzare la soluzione NaOH da 8 mM o l'acqua priva di DNase e RNase per diluire il campione di DNA.
- Progettare la coppia di primer specifica per la sequenza di proteine di fluorescenza verde esogena (GFP) in-house utilizzando un portale web di progettazione primer open source per il rilevamento PCR in tempo reale del tag GFP nelle celle metastatiche che hanno invaso e colonizzato i siti dislocanti.
NOTA: Questo studio ha utilizzato F: 5'-AGAACGGCATCAAGGTGAAC-3', R: 5'-TGCTCAGGTAGTGGTTGTGTTGTCG-3'. - Utilizza un rapido reagente PCR in tempo reale e una macchina PCR in tempo reale che supporti un protocollo PCR veloce in tempo reale. Oltre ai normali passaggi di amplificazione del ciclo 30, aggiungere una fase di curva di dissociazione alla fine della corsa per il rilevamento di qualsiasi amplificazione non specifica.
NOTA: Per il rilevamento molecolare sono state utilizzate le seguenti condizioni: 95 c 2 min di avvio a caldo, 40 cicli di 95 s 5 s, 60 C 15 s, e infine un'analisi della curva di fusione. L'amplificatore GFP ha una dimensione di 135 bp. - Utilizzare un DNA cerebrale di topo ingenuo (non un impianto cellulare MDA-MB-231) come controllo negativo. Utilizzare il DNA estratto dalle cellule MDA-MB-231-GFP/Luc come controllo positivo. Aggiungere tutti i reagenti PCR senza alcun modello di DNA come controllo senza modello (NTC).
NOTA: è necessario un controllo PCR per ogni saggio PCR.
5. Rilevamento delle cellule del cancro al seno metastatico nei polmoni
- Per il sottogruppo di topi scelto per il conteggio metastatico dei noduli polmonari, anesizzare i topi con isoflurane (come nel passaggio 2.2) immediatamente dopo l'imaging ex vivo, eseguire una puntura cardiaca per la raccolta del sangue e quindi eutanasia per lussazione cervicale.
- Aprire la cavità toracica con forbici dissettive e tagliare oltre il cuore e il timo per esporre la trachea.
- Inserire nella trachea una siringa da 10 mL con un ago da 22 G contenente la soluzione di Bouin. Spingere lo stantuffo della siringa fino a quando i polmoni collassati sono gonfi con 2 mL di soluzione del Bouin. Rimuovere la siringa e l'ago una volta che i polmoni sono stati gonfiati.
- Mettere l'intero polmone in un tubo da 15 mL contenente la soluzione di Bouin, invertire delicatamente il tubo un paio di volte e lasciare in ammollo per 24 h a temperatura ambiente.
- Dopo 24 h, rimuovere la soluzione del Bouin dal tubo, sciacquare il polmone con acqua, quindi rimetterlo nel tubo con il 70% di etanolo. Contare la metastasi (macchie bianche o noduli) sulle superfici dei polmoni utilizzando un microscopio sezionato.
6. Raccolta e analisi dei dati
- Registra i dati sul volume del tumore, nonché i dati di imaging in vivo ed ex vivo, su un foglio elettronico elettronico per facilitare l'immissione, la raccolta e la gestione dei dati.
- Al termine dell'esperimento, trasferire tutti i dati al foglio elettronico e al software statistico per la tracciatura dei dati e le analisi statistiche.
Representative Results
La misurazione del volume del tumore per pinza è un metodo consolidato per valutare l'efficacia del trattamento (Figura 1). Il numero di cellule impiantate, l'uso di matrice della membrana seminterrato, microbioma, pulizia dell'impianto e sito di iniezione sono i fattori chiave che influenzano il tasso di crescita del tumore.
A differenza dell'imaging GFP, BLI ha richiesto la somministrazione del substrato luciferasi almeno 15-20 minuti prima dell'imaging BLI. Inoltre, il ceppo murino, la linea cellulare, i trattamenti e il reporter luciferasi influenzano tutti i livelli del segnale di bioluminescenza. Pertanto, per ottenere segnali comparabili tra i gruppi di studio, è necessario condurre uno studio cinetico BLI pre-imaging per determinare il miglior lasso di tempo di imaging (Figura 2).
A causa del rapporto segnale-sfondo superiore26,27, l'imaging di bioluminescenza in vivo del corpo era abbastanza sensibile nel rilevare il segnale di metastasi di basso livello rispetto all'approccio GFP (Figura 3). Inoltre, il segnale di bioluminescenza ha fornito una penetrazione più profonda della GFP di pochi millimetri. Tuttavia, la produzione del segnale di bioluminescenza richiede ATP, che è un fattore limitante nella valutazione dei campioni di tessuto ex vivo. Se gli animali vengono elaborati rapidamente, blI potrebbe essere un approccio praticabile per ottenere risultati quantitativi sulla metastasi. Un modo per raggiungere questo obiettivo è la lavorazione di un animale alla volta. Tuttavia, questo approccio non era fattibile per questo studio perché è stata utilizzata una grande coorte di topi. Il segnale BLI non è stato rilevato quando gli organi sono stati immagine circa 45 min di iniezione post luciferina. L'uso di una linea cellulare dual reporter è utile in questa situazione. A causa della natura stabile della molecola GFP, i ricercatori avrebbero abbastanza tempo per elaborare la carcassa prima di catturare i segnali GFP dagli organi bersaglio (Figura 4).
Figura 5 fornisce un esempio reale di come le misurazioni del formato del tumore pinza potrebbe distorcere l'interpretazione dei dati, perché lo xenotrapianto ha perso la maggior parte del contenuto delle cellule tumorali vitali, ma ha mantenuto la sua grande massa e forma. L'esame istopatologico di tali xenotrapiato indicava necrosi all'interno della massa (Figura 5B).
Per i ricercatori che contestano i risultati dell'imaging per quanto riguarda la metastasi cerebrale nel modello di cancro al seno ortotopico, il rilevamento molecolare da PCR in tempo reale può fornire prove convincenti (Figura 6). In questo caso, la sequenza di DNA GFP esogena era il modo migliore per risolvere questo problema, perché la sequenza di DNA GFP trasinfezione non esiste naturalmente negli esseri umani o nei roditori.
Figura 1: Misurazione del volume del tumore. La misurazione del volume/caricamento del tumore con una pinza è iniziata il giorno 10 dopo l'impianto dello xenotrapianto e poi è stata misurata 2 volte a settimana fino alla fine dell'esperimento. Le barre di errore vengono calcolate in base al valore SEM. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 2: Determinazione della finestra ottimale di acquisizione dell'immagine. A sinistra: un topo con un grande xenotrapianto e un topo con un piccolo xenotrapianto sono stati selezionati per la determinazione ottimale della gamma cinetica luciferina. A destra: Luciferin curva cinetica ottenuta acquisendo le immagini ogni 2 min per 40 min. È stato osservato un altopiano tra i 15 e i 22 min, che è stato utilizzato come tempo ottimale di acquisizione dell'immagine per tutte le immagini successive. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 3: Imaging BLI dell'intero corpo. L: Imaging BLI dell'intero corpo. M: Vista ventrale con il corpo inferiore coperto da una manica di un guanto nero. R: Vista dorsale con il corpo inferiore coperto da una manica di un guanto nero. Una metastasi del linfonodo ascellare viene rilevata nella vista ventrale mediante imaging BLI. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 4: Rilevamento del segnale BLI/GFP ex vivo. I segnali GFP sono stati rilevati nel cervello e nel polmone dallo stesso topo 20 min dopo che il topo è stato sacrificato. Segnale BLI non è stato rilevato 45 min post luciferina. Nessun segnale GFP è stato rilevato nel cervello e nel polmone del topo ingenuo. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 5: Vantaggi delle tecniche di imaging ottico rispetto alle misurazioni di caliper. (A) Immagine rappresentativa che mostra il rilevamento del segnale GFP in vivo in un tumore primario. Solo una parte minore dello xenotrapianto ha mostrato il segnale GFP, suggerendo che una parte significativa della massa era stroma. Questo non può essere determinato da misurazioni di pinza tradizionali e può portare a una conclusione imprecisa. Questo esempio evidenzia l'importanza dell'imaging ottico per lo studio del modello animale. (B) Sezione istopatologia dello stesso topo che mostra che la regione necrotica (cioè regione interna) ha contribuito anche al calcolo della dimensione del tumore. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 6: Analisi della curva di fusione. Il grafico della curva di fusione che mostra la specificità degli amplificatori GFP. Il DNA proveniente dal cervello ottenuto dai topi impiantati da MDA-MB-231-Luc/GFP e il DNA isolato dalle cellule MDA-MB-231-Luc/GFP coltivate in coltura (controllo positivo) sono state analisi. Il saggio PCR in tempo reale è stato eseguito per valutare il contenuto di GFP nel tessuto cerebrale. (A,B) Le curve di fusione del controllo positivo e del DNA estratto dal cervello del topo, rispettivamente. (C) Le curve sovrapposte dei pannelli A e B, che indicano i segnali di picco provenienti dal cervello del mouse, i DNA sono specifici per la sequenza GFP esogena. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Discussion
Per lo studio della TNBC negli animali, sono stati sviluppati due modelli murini: le cellule adenocarcinoma mammario umano MDA-MB-231 in topi immunocompromessi (ad es. topi nudi atimici, topi NSG) e il 4T1 in topi BALB/c immuno-competenti. Entrambi i modelli hanno i loro vantaggi. La scelta del modello animale per uno studio dipende dagli obiettivi di ricerca. Ad esempio, il modello MDA-MB-231 è una linea cellulare TNBC umana coltivata in topi immunocompromessi che imita pazienti affetti da cancro al seno umano immunosoppressi. D'altra parte, il fenotipo invasivo delle cellule di cancro al seno del murino ortotopico 4T1 triplo negativo nei topi BALB/c imita da vicino il processo metastatico in quanto si verifica nei pazienti affetti da cancro al seno umano in fase IV. A differenza dell'approccio di iniezione cellulare per via endovenosa, le cellule di cancro al seno MDA-MB-231 sono state iniettate allo stesso modo nel cuscinetto di grasso mammario11,12 nel modello di cancro al seno ortotopico11,13. La crescita del tumore più lunga e la capacità metastatica acquisita è più fisiologicamente rilevante, quindi non è un modello di cancro metastatico artificiale4,14. Tale modello spontaneo di metastasi imita da vicino lo sviluppo del cancro al seno umano ad eccezione della fase di avvio. Si tratta di un modello cruciale per lo screening farmacologico in vivo e la valutazione dell'efficacia terapeutica nel cancro al seno metastatico.
Il sito di impianto del tumore nel topo svolge un ruolo cruciale nel fornire un microambiente che sostiene la crescita del tumore e la selezione del fenotipo metastatico simile a quello che si verifica negli esseri umani. Il linfonodo prossimale e la presenza di tessuto adiposo sono i fattori chiave che influenzano la progressione della malattia del cancro al seno15,16. In un paziente umano, il linfonodo e il tessuto adiposo sono entrambi fattori interagenti chiave che influenzano la malignità e l'incidenza del cancro al seno17,18,19. Così, la selezione della corretta posizione anatomica per il sito di iniezione può influenzare fortemente la rilevanza del modello tumorale rispetto alla malattia umana. Questo studio ha usato la quarta ghiandola mammaria come sito di impianto principalmente a causa dei suddetti requisiti e che è anatomicamente più accessibile e più facile da manipolare.
Diversi metodi di calcolo del volume del tumore sono disponibili, e un ricercatore può scegliere quello che ritengono opportuno. L'algoritmo scelto per questo studio si basa sui risultati di Faustino-Rocha et al., che ha confrontato diverse formule di calcolo del volume tumorale e ha concluso che la formula qui sotto è la più accurata20.
La matrice della membrana del seminterrato è un'importante matrice extracellulare utilizzata in vari in vitro21 e in vivo22,,23 saggi. Ci sono rapporti contraddittori22,24,25 per quanto riguarda l'influenza della matrice di membrana seminterrato sulla malignità xenotrapianto. Sembra influenzare solo l'istituzione iniziale dello xenotrapianto e non ha ulteriori effetti sulla crescita dello xenotrapianto25. Per l'impianto di xenotrapianto descritto, la matrice della membrana del seminterrato è stata mescolata con le cellule tumorali per aumentare la viscosità del mix di cellule/gel prima dell'impianto. La presenza della matrice della membrana del seminterrato riduce la perdita di soluzione di miscelazione dal sito di iniezione e mantiene la soluzione di miscelazione presso il sito di impianto, aumentando così l'uniformità del volume di xenotrapianto impiantato.
La linea cellulare MDA-MB-231 è una linea maligna immortalata di adenocarcinoma umano ed è uno strumento popolare nella ricerca sul cancro al seno a causa del suo stato triplo negativo. L'uso della linea cellulare dual reporter (luciferase e GFP) consente una maggiore flessibilità nella gestione dell'imaging in vivo ed ex vivo. È ben noto che il segnale di bioluminescenza possiede una maggiore sensibilità, rilevabilità della profondità e contrasto superiore (rapporto segnale-rumore) rispetto ai segnali GFP. Per questo motivo, è una modalità di imaging ampiamente utilizzata per l'imaging di tutto il corpo. Sfortunatamente, il rilevamento della bioluminescenza è limitato da una stretta finestra temporale (15-20 min dopo l'iniezione di luciferina) durante la quale il rilevamento del segnale è lineare. Il segnale BLI diminuisce rapidamente quando gli animali sono eutanasia. Questo diventa un problema di progettazione sperimentale se molti topi devono essere eutanasia e la raccolta di più tessuti o organi è necessaria. In questi studi, il sangue è stato raccolto da puntura cardiaca diretta, il cervello, tumore primario, polmone, e linfonodo interessato sono stati esaminati in 40 topi. Quando gli organi sono stati raccolti e pronti per l'imaging ex vivo, il segnale di bioluminescenza non era rilevabile. Pertanto, il rilevamento GFP è più adatto in queste situazioni. L'emissione del segnale GFP è nella portata visibile, e a queste lunghezze d'onda, l'assorbimento del segnale a causa del sangue (cioè l'emoglobina) è significativamente più alto. Inoltre, l'autofluorescenza nella gamma visibile a causa di NADH, lipo-pigmenti e flanella si traduce in uno sfondo significativo che rende difficile distinguere tra un segnale GFP di basso livello e uno sfondo autofluorescenza. L'utilizzo di un approccio di imaging a fluorescenza multispettrale invece dell'imaging tradizionale a coppie di filtri e l'utilizzo di algoritmi di disinsamento spettrale aiuta a identificare il vero segnale GFP nell'organo di interesse. Quindi, combinando i punti di forza dell'imaging a bioluminescenza nel rilevamento di tutto il corpo in vivo e l'imaging GFP multispettrale nelle valutazioni di organi/tessuti ex vivo, i dati quantificabili possono essere massimizzati in una grande coorte di topi.
Non importa quale approccio è selezionato per uno studio animale, l'estrazione di tutto il sangue prima del recupero di organi / tessuti è altamente raccomandato, soprattutto per gli studi mirati al carico metastatico. Questo protocollo rileva i segnali GFP provenienti dall'intero campione di sangue ottenuto dai topi (dati non mostrati) nel modello di cancro al seno ortotopico dai test PCR in tempo reale. Ridurre al minimo il volume sanguigno negli organi/tessuti ridurrà il segnale falso positivo negli organi bersaglio.
In conclusione, il modello di cancro al seno ortotopico che utilizza le cellule MDA-MB-231-Luc/GFP è un modello animale altamente rilevante che imita da vicino la condizione del paziente TNBC umano. Questo modello è essenziale per studiare, monitorare e valutare l'efficacia terapeutica in un microambiente tumorale simile agli esseri umani. L'uso di linee cellulari a doppio reporter migliora ulteriormente la praticità di questo modello di cancro al seno ortotopico.
Disclosures
Gli autori non hanno nulla da rivelare.
Acknowledgments
Gli autori desiderano riconoscere il sostegno del Programma di Ricerca Intramurale degli Istituti Nazionali di Salute, del National Cancer Institute, del Bethesda MD, del Programma Cancro e Infiammazione e del Frederick National Laboratory - Small Animal Imaging Program, Leidos Biomedical Research, Inc, Frederick Maryland, Stati Uniti.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Bouins Solution | Sigma | HT10132-1L | Lung metastatic nodule staining |
| D-Luciferin, Potassium Salt | GoldBio | LUCK-1G | Luciferase substrate |
| DNAzol | ThermoFisher | 10503027 | DNA extraction Kit |
| Excel | Microsoft | Spreadsheet software | |
| homogenizer | Virtis | Cyclone Virtishear | For tissue homogenization |
| IVIS SPECTRUM scanner | Perkin Elmer | fluorescence and BLI imaging system | |
| Maestro GNIR-FLEX fluorescence scanner | Perkin Elmer | fluorescence imaging system | |
| MatriGel Matrix | Corning | 356234 | Store at -20C and keep old (4 C) when in use. |
| MDA-MB-231 / Luciferase-2A-GFP Stable Cell Line | GenTarget | SC044 | Dual Reporter human breast cancer cell line |
| Microscope | ThermoFisher | EVOS | histology image capture |
| Phosphate-Buffered Saline | ThermoFisher | 10010049 | rinse buffer |
| Primer3 | MIT | Primer Design | |
| Prism | GraphPad | Statistical Analysis Software | |
| Puromycin | ThermoFisher | A1113803 | Antibiotics |
| RPMI 1640 media | ThermoFisher | 61870127 | Culture media |
| SeniFAST SYBR Lo-ROX kit | Bioline | BIO-94020 | Fast Real-Time PCR Reagent |
| StepOne Plus Real-Time PCR system | ThermoFisher | Real-Time PCR machine |
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