Summary
Este trabalho predefine um protocolo avançado para avaliar com precisão o carregamento de tumores por meio da detecção de sinais de proteína fluorescente verde e bioluminescência, bem como a integração da técnica de detecção molecular quantitativa.
Abstract
O câncer de mama triplo negativo (TNBC) é um subtipo agressivo de câncer de mama com opções terapêuticas limitadas. Quando comparado com pacientes com tumores de mama menos agressivos, a taxa de sobrevivência de 5 anos de pacientes com TNBC é de 77% devido ao seu fenótipo resistente a medicamentos característico e carga metastática. Para isso, foram estabelecidos modelos de murina com o objetivo de identificar novas estratégias terapêuticas que limitam o crescimento do tumor tnbc e a disseminação metastática. Este trabalho descreve um guia prático para o modelo ortotópico da TNBC onde as células cancerígenas mda-MB-231 suspensas em uma matriz de membrana de porão são implantadas na quarta almofada de gordura mamária, que imita de perto o comportamento das células cancerosas em humanos. Mensuração de tumores por caliper, avaliação de metástase pulmonar via imagem in vivo e ex vivo, e detecção molecular são discutidas. Este modelo fornece uma excelente plataforma para estudar a eficácia terapêutica e é especialmente adequado para o estudo da interação entre o tumor primário e os sítios metastáticos distais.
Introduction
Aproximadamente uma em cada oito mulheres nos Estados Unidos desenvolverá câncer de mama invasivo durante sua vida, e 10%-20% dessas mulheres serão diagnosticadas com o subtipo agressivo de câncer de mama triplo negativo (TNBC). Enquanto lesões primárias podem ser removidas cirurgicamente na maioria dos casos, a micrometástase subclínica e a quimioresistência fazem dela uma doença intratável. É importante ressaltar que a maioria dos pacientes com TNBC metastática eventualmente tem recaída, mesmo que tenham sido submetidos ao tratamento no estágioinicial 1. Assim, heterogeneidade do câncer, micrometástase e resistência terapêutica são três grandes desafios que limitam o resultado clínico bem sucedido dos pacientes da TNBC. Portanto, há uma necessidade urgente de entender melhor o fundo molecular polimórfico da TNBC e desenvolver agentes terapêuticos eficazes que limitam a doença metastática.
A metástase tumoral é um processo multipasso onde a célula tumoral controla e usurpa seu microambiente para promover sua própria disseminação através da degradação da membrana e fuga celular tumoral da lesão primária, através da entrada (ou seja, intravasação) e saída (ou seja, extravasação) da vasculatura, e, finalmente, adaptação e colonização dentro de leitos de tecido distal2. Modelos animais foram desenvolvidos para estudar a metástase do câncer de mama, onde duas metodologias são comumente implementadas: injeção direta de circulação sanguínea e implantação ortotópica. Métodos comumente utilizados para injeção direta de circulação sanguínea incluem injeção de veia sino, enquanto outras abordagens, incluindo injeção cardíaca direta3, injeção cerebral direta4, e injeção direta de fígado5 também foram empregadas. A injeção direta de circulação sanguínea é frequentemente referida como um modelo de metástase artificial, que é rápido e fácil, mas menos fisiologicamente preciso, pois contorna a fuga do tumor da lesão primária e a intravasação6,7,8. Quando comparado a modelos de injeção direta, o modelo de câncer de mama ortotópico leva mais tempo para a ocorrência de lesões metastáticas detectáveis em órgãos remotos como o pulmão, mas é mais fisiologicamente relevante porque imita de perto o processo metastático multipasso como ocorre em humanos. É importante ressaltar que um estudo de 2013comparou a injeção de veias traseiras e modelos ortotópicos e descobriu que as células cancerígenas de mama injetadas na veia traseira e aquelas isoladas de lesões metastáticas pulmonares após injeção de veia sinuosa apresentaram perfis de expressão genética globais semelhantes. Em contraste, o perfil de expressão genética global das células cancerígenas de mama injetadas ortotópicamente era dramaticamente diferente do das lesões metastáticas pulmonares decorrentes de células ortotópicas injetadas9. Essas observações sugerem que o modelo ortotópico é mais fisiologicamente relevante, pois as lesões metastáticas passam por um processo de seleção semelhante ao processo multipasso de metástase como ocorre em humanos.
Este trabalho descreve um modelo de câncer de mama ortotópico (MDA-MB-231-Luc/GFP) em camundongos nus que foi otimizado em nosso laboratório para técnicas de detecção de imagens, bem como a identificação de novos biomarcadores e desenvolvimento de agentes quimioterápicos direcionados.
Protocol
A análise do crescimento tumoral foi realizada por meio de protocolos aprovados pelo Comitê de Ética dos Experimentos Animais do Instituto Nacional de Câncer e aderiu às recomendações do "Guia para o Cuidado e Uso de Animais do Conselho Nacional de Pesquisa dos Estados Unidos" Animais de Laboratório", "Guia para o Cuidado e Uso de Animais de Laboratório" do Serviço Público de Saúde dos Estados Unidos e "Política de Cuidado Humano e Uso de Animais de Laboratório".
1. Preparação de células para implantação
NOTA: As células de adenocarcinoma mamórmico humano MDA-MB-231 (adquiridas comercialmente) foram infectadas com o gene da luciferase III e marcador de proteína fluorescente verde (GFP) por lentivírus e cultivadas na presença do antibiótico de seleção (puromicina) .
- Inicie a cultura celular com células 1 x 106 MDA-MB-231-Luc/GFP e adicione 15 mL de pré-aquecido (37 °C) meio RPMI 1640 com 10% de soro bovino fetal (FBS) em um frasco de cultura T75. Mantenha as células crescendo em uma incubadora de cultura celular controlada pela temperatura a 37 °C com 5% de CO2. Substitua o meio completo pelo menos 2x por semana.
NOTA: Não perturbe o crescimento celular e continue verificando diariamente as condições de crescimento celular. As células precisam ser subcultivadas quando atingem 85%-90% de confluência para manter a fase de proliferação. - Uma semana antes da etapa de implantação celular, remova a puromicina do frasco de cultura celular, primeiro removendo todo o meio no frasco de cultura, depois enxaguando 2x com 10 mL de 1x de solução salina tamponada de fosfato (PBS) e, finalmente, substituindo o meio por meio completo sem a puramicina. Durante as etapas de adição média e lavagem, não perturbe as células. Lembre-se de não usar o meio completo com os antibióticos de seleção a partir de agora para todas as etapas de reposição média.
- No dia da preparação das células para implantação, remova todo o meio completo antes da trippsinização para evitar a desativação da tripsina. Adicione 5 mL de tripsina ao frasco para tentar testar as células. Monitore as células e verifique se elas se desprendem do frasco de cultura.
- Uma vez que a maioria das células se desprendem, adicione 10 mL de meio completo para neutralizar a atividade de tripsina. Em seguida, transfira a suspensão celular para um tubo de centrífuga de 50 mL e centrífuga a ~150 x g para pellet as células. Remova o sobrenadante após a centrifugação e adicione 10 mL de 1x PBS para resuspender as células e preparar para a contagem de células.
- Conte as células com um contador celular e ajuste a concentração celular para 20 x 106 células/mL em PBS frio 1x contendo 25% de matriz de membrana de porão. Injete 2 x 106 células em 0,1 mL 1x PBS com 25% de matriz de membrana de porão na quarta almofada de gordura mamária de cada rato. Traga agulhas e seringas extras para a implantação celular e mantenha a mistura célula-porão-membrana-matriz no gelo antes da implantação.
NOTA: Há espaço morto na seringa e agulha. Dependendo da escolha do comprimento, tipo e tamanho da agulha e da seringa, uma seringa de tuberculina com uma agulha de 0,5 em 26 G pode ter até 70 μL de espaço morto10. Prepare 40%-50% mais mistura de implantação celular para compensar o espaço morto e qualquer outra perda acidental.
2. Modelo de câncer de mama ortotópico e medição do tamanho do tumor
- Permita que ratos nus athymic femininos de 6 semanas se acostumem com a instalação de habitação por pelo menos 1 semana antes da implantação celular.
NOTA: O uso de ratos da mesma idade reduzirá a variação de dados. - Para cada rodada, anestesia cinco camundongos com isoflurano a 4% com ar filtrado (0,2 μm) a uma taxa de fluxo de 1 L/min por 3-4 min. Preste atenção à taxa respiratória do rato e à mudança de padrão, e use uma pitada de dedo do dedo para garantir que os ratos estejam sob anestesia adequada. Uma vez que eles não estejam mais se movendo, remova um rato e coloque um cone de nariz sobre seu nariz e boca com a mesma anestesia.
- Limpe ath glândula mamária esquerda com álcool. Usando fórceps de denteth de rato fino, levante ligeiramente a glândula mamária 4 para inserir a agulha de 25 G. Certifique-se de que a agulha está para cima e, em seguida, puxe ligeiramente o êmbolo para garantir que a agulha não atinja nenhum vaso sanguíneo. Se nenhum sangue entrar na seringa, continue a injetar lentamente 100 μL da mistura célula-porão-membrana-matriz na almofada de gordura mamária.
NOTA: Uma área redonda e elevada aparecerá a pele. - Espere 10-15 s para que a matriz da membrana do porão endureça e, em seguida, remova a agulha. Repita o processo com os ratos restantes na câmara de indução. Coloque todas as agulhas e seringas usadas em uma caixa afiada.
- Use o mesmo local de injeção de glândula mamária para todos os ratos. Fique de olho no local da injeção e observe qualquer mistura de implantação de célula vazando do local da injeção.
NOTA: Em poucos minutos, o mouse começará a recuperar a consciência. - Permita que o xenoenxerto cresça livremente sem qualquer interrupção por 7-10 dias antes de qualquer medição do tamanho do tumor.
- Examine todos os ratos para o tamanho do xenoenxerto. Meça o tamanho do tumor com uma pinça. Determine o volume do tumor (mm3) com a seguinte equação:
onde L é a dimensão mais longa e W é a menor dimensão perpendicular a L. - Identificar e remover outliers superiores a um desvio padrão da média. Use apenas camundongos com tamanhos de tumorcomparáveis para experimentos. Divida aleatoriamente os camundongos em diferentes grupos de tratamento e comece os tratamentos.
- Meça o tamanho do tumor por pinça 2x por semana. Observe todas as alterações físicas dos xenoenxertos (ou seja, necrose, laceração).
3. Bioluminescência in vivo e imagem de fluorescência ex-vivo
NOTA: Neste estudo, tanto a bioluminescência bidimensional quanto a imagem de fluorescência são conduzidas no ponto final do experimento. A imagem de bioluminescência (BLI) foi realizada utilizando-se um scanner óptico pré-clínico comercial equipado com uma câmera CCD refrigerada de 16 bits e estágio de imagem aquecido.
- Antes da imagem, anestesiar até cinco camundongos portadores de tumor na câmara de indução, fixando isoflurano a 3% com ar filtrado (0,2 μm) a uma taxa de fluxo de 1 L/min por 3-4 minutos. Determine anestesia por uma pitada de dedo do dedo. Certifique-se de que a câmara de indução é mantida dentro de uma capa ventilada para minimizar a exposição da equipe ao isoflurano.
- Administrar a luciferina D (150 mg/kg) aos camundongos anestesiados por uma rota intraperitoneal usando uma agulha de 27 G e transferir um rato anestesiado para a câmara de imagem. Na câmara de imagem do scanner, mantenha o isoflurano em 2%-2,5% com O2 como portador com uma vazão de 1 L/min.
NOTA: Mantenha a temperatura corporal do mouse em ~37 °C durante o procedimento mantendo uma almofada aquecida a câmara de indução da anestesia, a mesa de imagem (se o estágio não estiver aquecido) e a gaiola de recuperação pós-procedimento. - Antes da imagem dos camundongos do estudo, obtenha a luciferina cinética por imagem de três camundongos com tumor suplementar (animais não atribuídos a nenhum grupo de estudo) em intervalos de 2 minutos para um total de 40 minutos usando os seguintes parâmetros: filtro de excitação bloqueado, filtro de emissão aberto, f/stop 1, FOV-D, binning médio (8 x 8) e exposição automática. Use o sinal de bioluminescência de pico medido para definir a janela de tempo ideal de aquisição de imagem para todos os pontos de tempo subsequentes.
- Durante a realização de imagens de metástase, proteja o alto sinal BLI do tumor primário cobrindo-o com uma manga cortada de uma luva preta. Adquira a imagem usando os mesmos parâmetros descritos na etapa 3.3 com o lado ventral do mouse voltado para a câmera para imagens de metástase pulmonar e o lado dorsal do mouse voltado para a câmera para a imagem de metástase cerebral.
NOTA: É essencial testar algumas marcas diferentes de luvas pretas para escolher aquela com lubrificação automática mínima. - Usando um scanner e um software de análise de dados, desenhe uma região de interesse padrão (ROI) sobre a cavidade torácica ou o cérebro garantindo que todo o órgão de interesse seja coberto para avaliar a carga metastática. Quantifique a saída de bioluminescência (BL) como fluxo total (fótons/segundo).
- Imediatamente após a BLI, eutanie o camundongo por asfixia por CO2 (conforme as diretrizes da ACUC e protocolos animais aprovados pela instituição) e extraia o pulmão e o cérebro com tesouras dissecadas e fórceps para imagens ex-vivo.
NOTA: O pulmão extraído para a imagem ex vivo e para a contagem de nódulos de metástase pulmonar não pode ser realizado no mesmo camundongo devido a procedimentos incompatíveis. - Enxágüe rapidamente todos os órgãos com 1x PBS para remover quaisquer manchas de sangue superficiais e coloque órgãos em uma placa de plástico preto de baixa autofluorescência. Transportar órgãos para um scanner de fluorescência multiespectral equipado com capacidade de desmistura espectral (ajuste de comprimento de onda de cristal líquido de estado sólido) com uma câmera CCD de 12 bits para detecção de GFP.
- Adquirir imagens multiespectrais de GFP (filtro de excitação = 457 ± 23 nm; filtro de emissão = 490 nm de passagem de comprimento) dos órgãos extraídos e camundongos de controle de rolamento não tumorais através da varredura através de 500-720 nm a um tamanho de passo de 10 nm. Use órgãos excised de camundongos de controle de rolamento não tumorais para corrigir a autofluorescência.
- Após a imagem gfp multiespectral, determine as configurações ideais de imagem. Realizar a aquisição de imagens de todos os órgãos-alvo e realizar análise de imagem (ou seja, gerar uma biblioteca espectral para autofluorescência e GFP para procedimento de desmistura espectral) de acordo com o protocolo do fabricante.
4. Detecção molecular de células metastáticas de câncer de mama
- Após a imagem ex vivo, estale o cérebro inteiro em nitrogênio líquido e armazene a -80 °C em um congelador até que esteja pronto para a extração do DNA.
- Para extração de DNA, coloque todo o cérebro em um tubo homogeneizador de 5 mL com 2 mL de tampão de lse de DNA. Use um homogeneizador com o ajuste de potência em 50 para homogeneizar o tecido cerebral inteiro congelado. Uma vez que o tecido cerebral esteja totalmente homogeneizado, transfira a suspensão de 1 mL (lysate) para um tubo de microcentrifugação de 2 mL livre de DNase e RNase e continue a isolar o DNA de acordo com o protocolo do fabricante.
NOTA: Para minimizar a contaminação do DNA de transporte, limpe completamente o homogeneizador após cada amostra, primeiro enxaguando-o com 75% de etanol em água livre de DNase e sem RNase, depois enxaguando com 1 M Solução NaOH, seguido de uma lavagem com 75% de etanol em dnase-free e Água livre de rnase para reduzir e destruir efetivamente qualquer resíduo de DNA. - Adicione 0,5 mL de 100% de etanol de tampão de lse de DNA ao lysate. Misture a amostra por inversão e armazene em temperatura ambiente por 3 min.
NOTA: Não inverta muitas vezes ou vigorosamente. O DNA será visível como um precipitado de lã. - Use uma ponta de pipeta para transferir o DNA para um tubo de microcentrífuga de 2 mL fresco sem DNase e sem RNase. Deixe a amostra secar o ar por 1 min. Adicione 1 mL de etanol e inverta o tubo de microcentrífuge 3−6x para lavar a amostra de DNA. Descarte o etanol após cada lavagem por pipetting. Repita o passo de lavagem 2x.
- Seque a amostra de DNA para 10 s. Em seguida, adicione 52 μL de 8 mM NaOH para dissolver a amostra de DNA. Pipet 2 μL da amostra de DNA para quantificar DNA, e usar os 50 μL restantes para um ensaio pcr em tempo real após o ajuste de concentração.
NOTA: NaOH ajuda a soibilizar totalmente a amostra de DNA. - Quantificar 2 μL de cada amostra de DNA com um espectrofotômetro e usar uma razão de absorvência entre A260/280 como referência de verificação de qualidade. Calcule a concentração de DNA com esta fórmula:
- Ajuste a concentração de DNA para 50 ng/μL. Para cada amostra de DNA, use 50 ng de DNA como modelo inicial para um ensaio pcr em tempo real. Use a solução NaOH de 8 mM ou água livre de DNase e RNase para diluir a amostra de DNA.
- Projete o par de primer específico para a seqüência de proteína de fluorescência verde exógena (GFP) internamente usando um portal web de design de primer de código aberto para detecção em tempo real da tag GFP nas células metastáticas que invadiram e colonizaram locais distais.
NOTA: Este estudo utilizou F: 5'-AGAACGGCATCAAGGTGAAC-3', R: 5'-TGCTCAGGTAGTGGTTGTCG-3'. - Use um reagente PCR rápido em tempo real e uma máquina PCR em tempo real que suporta um protocolo PCR rápido em tempo real. Além das etapas regulares de amplificação de 30 ciclos, adicione um passo de curva de dissociação ao final da execução para a detecção de qualquer amplificação não específica.
NOTA: Foram utilizadas as seguintes condições para detecção molecular: 95 °C 2 min de partida quente, 40 ciclos de 95 °C 5 s, 60 °C 15 s e, por último, uma análise da curva de fusão. O amplicon GFP tem 135 bp de tamanho. - Use um DNA cerebral de rato ingênuo (não um implante celular MDA-MB-231) como um controle negativo. Use DNA extraído das células MDA-MB-231-GFP/Luc como um controle positivo. Adicione todos os reagentes de PCR sem qualquer modelo de DNA como um controle sem modelo (NTC).
NOTA: É necessário um controle PCR para cada ensaio PCR.
5. Detecção de células de câncer de mama metastáticas no pulmão
- Para o subgrupo de camundongos escolhido para a contagem do nódulo pulmonar metastático, anestesiar camundongos com isoflurano (como na etapa 2.2) imediatamente após a imagem ex vivo, realizar uma punção cardíaca para coleta de sangue e, em seguida, eutanásia por luxação cervical.
- Abra a cavidade torácica com uma tesoura dissecante e corte o coração e o timo para expor a traqueia.
- Insira uma seringa de 10 mL com uma agulha de 22 G contendo a solução de Bouin na traqueia. Empurre o êmbolo da seringa até que os pulmões colapsados estejam inchados com ~2 mL da solução do Bouin. Remova a seringa e a agulha assim que os pulmões forem inflados.
- Coloque todo o pulmão em um tubo de 15 mL contendo a solução de Bouin, inverta suavemente o tubo algumas vezes e deixe absorver por 24 h em temperatura ambiente.
- Depois de 24 h, retire a solução do Bouin do tubo, enxágue o pulmão com água e, em seguida, coloque-o de volta no tubo com 70% de etanol. Contagem de metástase (manchas brancas ou nódulos) nas superfícies dos pulmões usando um microscópio dissecando.
6. Coleta e análise de dados
- Registre os dados de volume de tumores, bem como os dados de imagem in vivo e ex vivo, em uma planilha eletrônica para fácil entrada, coleta e gerenciamento de dados.
- Ao final do experimento, transfira todos os dados para a planilha eletrônica e software estatístico para plotagem de dados e análises estatísticas.
Representative Results
A medição do volume tumoral por pinça é um método bem estabelecido para avaliar a eficácia do tratamento (Figura 1). O número de células implantadas, o uso da matriz da membrana do porão, o microbioma, a limpeza das instalações e o local da injeção são os principais fatores que impactam a taxa de crescimento do tumor.
Ao contrário da imagem GFP, bli exigiu a administração do substrato de luciferase pelo menos 15-20 min antes da imagem BLI. Além disso, a cepa do camundongo, a linha celular, os tratamentos e o repórter da luciferase afetam os níveis de sinal de bioluminescência. Assim, para obter sinais comparáveis entre os grupos de estudo, deve-se realizar um estudo cinético de pré-imagem da BLI para determinar o melhor período de tempo de imagem(Figura 2).
Devido à relação sinal-fundo superior26,27, todo o corpo em imagens de bioluminescência vivo foi bastante sensível na detecção de sinal de metástase de baixo nível em comparação com a abordagem GFP (Figura 3). Além disso, o sinal de bioluminescência proporcionou penetração mais profunda do que o GFP por alguns milímetros. No entanto, a produção de sinal de bioluminescência requer ATP, que é um fator limitante na avaliação de amostras de tecido ex vivo. Se os animais forem processados rapidamente, então a BLI pode ser uma abordagem viável para obter resultados quantitativos sobre metástase. Uma maneira de conseguir isso é processando um animal de cada vez. No entanto, essa abordagem não foi viável para este estudo porque foi utilizada uma grande coorte de camundongos. O sinal BLI não foi detectado quando os órgãos foram imagemem cerca de 45 min após injeção de luciferina. O uso de uma linha de celular de repórter duplo é útil nesta situação. Devido à natureza estável da molécula de GFP, os pesquisadores teriam tempo suficiente para processar a carcaça antes de capturar os sinais GFP dos órgãos-alvo (Figura 4).
A Figura 5 fornece um exemplo da vida real de como as medidas do tamanho do tumor de pinça poderiam distorcer a interpretação dos dados, porque o xenoenxerto perdeu a maior parte do conteúdo celular tumoral viável, mas ainda manteve sua grande massa e forma. O exame histopatológico desses xenoenxertos indicou necrose dentro da massa (Figura 5B).
Para pesquisadores que contestam os resultados de imagem referentes à metástase cerebral no modelo de câncer de mama ortotópico, a detecção molecular por PCR em tempo real pode fornecer evidênciasconvincentes (Figura 6). Neste caso, a sequência exógena de DNA GFP foi a melhor maneira de resolver esse problema, pois a seqüência de DNA GFP transfeccionada não existe naturalmente em humanos ou roedores.
Figura 1: Medição do volume do tumor. A medição do volume/carregamento do tumor com uma pinça começou no dia 10 após a implantação do xenoenxerto e depois foi medida 2x por semana até o final do experimento. As barras de erro são calculadas pelo valor de SEM. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 2: Determinação da janela ideal de aquisição de imagem. Esquerda: Um rato com um grande xenoenxerto e um rato com um pequeno xenoenxerto foram selecionados para a determinação ideal de alcance cinético da luciferina. Certo: Curva cinética de luciferina obtida pela aquisição das imagens a cada 2 min por 40 min. Observou-se um platô entre 15-22 min, que foi utilizado como um tempo ideal de aquisição de imagem para todas as imagens subseqüentes. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 3: Imagem de corpo inteiro BLI. L: Imagem de corpo inteiro BLI. M: Vista ventral com o corpo inferior coberto com uma manga de uma luva preta. R: Vista dorsal com o corpo inferior coberto com uma manga de uma luva preta. Uma metástase do linfonodo axilar é detectada na visão ventral por imagem BLI. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 4: Detecção de sinal EX Vivo BLI/GFP. Sinais gfp foram detectados no cérebro e pulmão do mesmo rato 20 min depois que o rato foi sacrificado. O sinal BLI não foi detectado 45 min após a injeção de luciferina. Nenhum sinal gfp foi detectado no cérebro e pulmão ingênuos do rato. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 5: Vantagens das técnicas ópticas de imagem sobre as medidas de pinça. (A) Imagem representativa mostrando a detecção de sinal gfp vivo em um tumor primário. Apenas uma pequena porção do xenoenxerto mostrou sinal de GFP, sugerindo que uma parte significativa da massa era estroma. Isso não pode ser determinado pelas medidas tradicionais de pinça e pode levar a uma conclusão imprecisa. Este exemplo destaca a importância da imagem óptica para o estudo do modelo animal. (B) Seção histopatológica do mesmo camundongo mostrando que a região necrosada (ou seja, região interna) também contribuiu para o cálculo do tamanho do tumor. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 6: Análise da curva de fusão. A trama da curva de derretimento mostrando a especificidade dos amplicons GFP. O DNA do cérebro obtido a partir dos camundongos implantados mda-MB-231-Luc/GFP e o DNA isolado das células MDA-MB-231-Luc/GFP cultivadas em cultura (controle positivo) foram ensaios. O ensaio pcr em tempo real foi realizado para avaliar o conteúdo gfp no tecido cerebral. (A,B) As curvas de fusão do controle positivo e o DNA extraído do cérebro do rato, respectivamente. (C) As curvas sobrepostas dos painéis A e B, indicando os sinais de pico dos DNAs cerebrais do mouse são específicas para a seqüência exógena de GFP. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Discussion
Para o estudo da TNBC em animais, dois modelos de murina foram desenvolvidos: o MDA-MB-231 células de adenocarcinoma de mama humana em camundongos imunocomprometidos (ou seja, camundongos nus athymic, camundongos NSG), e o 4T1 em ratos BALB/c imunes competentes. Ambos os modelos têm suas vantagens. A escolha do modelo animal para um estudo depende das metas da pesquisa. Por exemplo, o modelo MDA-MB-231 é uma linha celular humana da TNBC cultivada em camundongos imunocomprometidos que imita pacientes com câncer de mama humano imunossupressor. Por outro lado, o fenótipo invasivo de células de câncer de mama murina tríplice-negativa 4T1 4T1 em camundongos BALB/C imita de perto o processo metastático como ocorre em pacientes com câncer de mama humano estágio IV. Ao contrário da abordagem de injeção de células intravenosas, as células de câncer de mama MDA-MB-231 humanas foram similarmente injetadas na almofada de gordura mamária11,12 no modelo de câncer de mama ortotópico11,13. O crescimento tumoral mais longo e a capacidade metastática adquirida são mais relevantes fisiologicamente, não sendo um câncer metastático artificial modelo4,14. Tal modelo de metástase espontânea imita de perto o desenvolvimento do câncer de mama humano, exceto para o estágio de iniciação. Este é um modelo crucial para o rastreamento de medicamentos in vivo e avaliação da eficácia terapêutica no câncer de mama metastático.
O local de implantação do tumor no camundongo desempenha um papel crucial no fornecimento de um microambiente que sustenta o crescimento tumoral e a seleção de fenótipo metastático semelhante ao que ocorre em humanos. O linfonodo proximal e a presença de tecido adiposo são os principais fatores que afetam a progressão da doença do câncer de mama15,16. Em paciente humano, o linfonodo e o tecido adiposo são fatores de interação que afetam a malignidade e a incidência do câncer de mama17,18,19. Assim, a seleção do local anatômico correto para o local de injeção pode impactar muito a relevância do modelo tumoral em comparação com a doença humana. Este estudo utilizou a quarta glândula mamária como local de implantação principalmente devido aos requisitos acima mencionados e que é anatomicamente mais acessível e mais fácil de manipular.
Diferentes métodos de cálculo do volume do tumor estão disponíveis, e um pesquisador pode escolher os que achar melhor. O algoritmo selecionado para este estudo baseia-se nos achados de Faustino-Rocha et al., que compararam diferentes fórmulas de cálculo do volume do tumor e concluíram que a fórmula abaixo é a mais precisa20.
A matriz de membrana do porão é uma importante matriz extracelular utilizada em vários ensaios in vitro21 e in vivo22,23. Há relatos contraditórios22,,24,25 sobre a influência da matriz de membrana do porão na malignidade do xenoenxerto. Parece afetar apenas o estabelecimento inicial do xenoenxerto e não ter mais efeito no crescimento do xenoenxerto25. Para a implantação de xenoenxerto descrita, a matriz da membrana do porão foi misturada com as células cancerosas para aumentar a viscosidade da solução de mistura celular/gel antes da implantação. A presença da matriz da membrana do porão reduz a perda da solução de mistura do local da injeção e mantém a solução de mistura no local de implantação, aumentando assim a uniformidade do volume de xenoenxerto implantado.
A linha celular MDA-MB-231 é uma linha celular de adenocarcinoma de mama humana imortalizada maligna e é uma ferramenta popular na pesquisa do câncer de mama por causa de seu status triplo-negativo. O uso de dupla linha celular repórteres (luciferase e GFP) permite mais flexibilidade no manuseio da imagem in vivo e ex vivo. Está bem estabelecido que o sinal de bioluminescência possui maior sensibilidade, detectabilidade de profundidade e contraste superior (relação sinal-ruído) do que os sinais GFP. Por causa disso, é uma modalidade de imagem amplamente utilizada para imagens de todo o corpo. Infelizmente, a detecção de bioluminescência é limitada por uma janela de tempo estreita (~15-20 min após injeção de luciferina) durante a qual a detecção de sinal é linear. O sinal bli diminui rapidamente quando os animais são eutanásiados. Isso se torna uma questão de design experimental se muitos camundongos precisam ser eutanizados e a colheita de múltiplos tecidos ou órgãos é necessária. Nestes estudos, o sangue foi colhido por punção cardíaca direta, o cérebro, tumor primário, pulmão e linfonodo afetado foram examinados em 40 camundongos. Quando os órgãos foram colhidos e prontos para imagens ex-vivo, o sinal de bioluminescência era indetectável. Portanto, a detecção de GFP é mais adequada nessas situações. A emissão do sinal GFP está na faixa visível, e nesses comprimentos de onda, a absorção de sinal devido ao sangue (ou seja, hemoglobina) é significativamente maior. Além disso, a autofluorescência na faixa visível devido ao NADH, lipo-pigmentos e flavins resulta em um fundo significativo que dificulta a distinção entre um sinal GFP de baixo nível e fundo de autofluorescência. Empregar uma abordagem de imagem de fluorescência multiespectral em vez de imagens tradicionais de par de filtros e usar algoritmos de desmistura espectrais ajuda a identificar o verdadeiro sinal gfp no órgão de interesse. Assim, combinando os pontos fortes da imagem de bioluminescência em todo o corpo in vivo detecção e imagem de GFP multiespectral nas avaliações de órgãos/tecidos ex vivo, os dados quantificáveis podem ser maximizados em uma grande coorte de camundongos.
Não importa qual abordagem seja selecionada para um estudo animal, extrair todo o sangue antes da recuperação de órgãos/tecidos é altamente recomendado, especialmente para estudos direcionados à carga metastática. Este protocolo detecta sinais gfp de toda a amostra de sangue obtida a partir dos camundongos (dados não mostrados) no modelo de câncer de mama ortotópico por ensaios de PCR em tempo real. Minimizar o volume sanguíneo em órgãos/tecidos reduzirá o sinal falso positivo nos órgãos-alvo.
Em conclusão, o modelo de câncer de mama ortotópico utilizando as células MDA-MB-231-Luc/GFP é um modelo animal altamente relevante que imita de perto a condição humana do paciente da TNBC. Esse modelo é essencial para estudar, monitorar e avaliar a eficácia terapêutica em um microambiente tumoral semelhante ao do ser humano. O uso de linhas celulares duplas de repórteres aumenta ainda mais a praticidade deste modelo de câncer de mama ortotópico.
Disclosures
Os autores não têm nada para revelar.
Acknowledgments
Os autores gostariam de reconhecer o apoio do Programa de Pesquisa Intramural dos Institutos Nacionais de Saúde, Instituto Nacional de Câncer, Bethesda MD, Programa de Câncer e Inflamação, e do Laboratório Nacional Frederick - Programa de Imagem de Pequenos Animais, Leidos Biomedical Research, Inc, Frederick Maryland, EUA.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Bouins Solution | Sigma | HT10132-1L | Lung metastatic nodule staining |
| D-Luciferin, Potassium Salt | GoldBio | LUCK-1G | Luciferase substrate |
| DNAzol | ThermoFisher | 10503027 | DNA extraction Kit |
| Excel | Microsoft | Spreadsheet software | |
| homogenizer | Virtis | Cyclone Virtishear | For tissue homogenization |
| IVIS SPECTRUM scanner | Perkin Elmer | fluorescence and BLI imaging system | |
| Maestro GNIR-FLEX fluorescence scanner | Perkin Elmer | fluorescence imaging system | |
| MatriGel Matrix | Corning | 356234 | Store at -20C and keep old (4 C) when in use. |
| MDA-MB-231 / Luciferase-2A-GFP Stable Cell Line | GenTarget | SC044 | Dual Reporter human breast cancer cell line |
| Microscope | ThermoFisher | EVOS | histology image capture |
| Phosphate-Buffered Saline | ThermoFisher | 10010049 | rinse buffer |
| Primer3 | MIT | Primer Design | |
| Prism | GraphPad | Statistical Analysis Software | |
| Puromycin | ThermoFisher | A1113803 | Antibiotics |
| RPMI 1640 media | ThermoFisher | 61870127 | Culture media |
| SeniFAST SYBR Lo-ROX kit | Bioline | BIO-94020 | Fast Real-Time PCR Reagent |
| StepOne Plus Real-Time PCR system | ThermoFisher | Real-Time PCR machine |
References
- Abramson, V. G., Lehmann, B. D., Ballinger, T. J., Pietenpol, J. A. Subtyping of triple-negative breast cancer: implications for therapy. Cancer. 121, 8-16 (2015).
- Zhuang, X., Zhang, H., Hu, G. Cancer and Microenvironment Plasticity: Double-Edged Swords in Metastasis. Trends in Pharmacological Sciences. 40 (6), 419-429 (2019).
- Campbell, J. P., Merkel, A. R., Masood-Campbell, S. K., Elefteriou, F., Sterling, J. A. Models of bone metastasis. Journal of Visualized Experiments. (67), e4260 (2012).
- Saha, D., et al. In vivo bioluminescence imaging of tumor hypoxia dynamics of breast cancer brain metastasis in a mouse model. Journal of Visualized Experiments. (56), e3175 (2011).
- Goddard, E. T., Fischer, J., Schedin, P. A Portal Vein Injection Model to Study Liver Metastasis of Breast Cancer. Journal of Visualized Experiments. (118), e54903 (2016).
- Lim, E., et al. Monitoring tumor metastases and osteolytic lesions with bioluminescence and micro CT imaging. Journal of Visualized Experiments. (50), e2775 (2011).
- Bauerle, T., Komljenovic, D., Berger, M. R., Semmler, W. Multi-modal imaging of angiogenesis in a nude rat model of breast cancer bone metastasis using magnetic resonance imaging, volumetric computed tomography and ultrasound. Journal of Visualized Experiments. (66), e4178 (2012).
- Katsuta, E., Oshi, M., Rashid, O. M., Takabe, K. Generating a Murine Orthotopic Metastatic Breast Cancer Model and Performing Murine Radical Mastectomy. Journal of Visualized Experiments. (141), e57849 (2018).
- Rashid, O. M., et al. Is tail vein injection a relevant breast cancer lung metastasis model? Journal of Thoracic Disease. 5, 385-392 (2013).
- Bhambhani, V., Beri, R. S., Puliyel, J. M. Inadvertent overdosing of neonates as a result of the dead space of the syringe hub and needle. Archives of Disease in Childhood: Fetal and Neonatal Edition. 90, F444-F445 (2005).
- Zhang, G. L., Zhang, Y., Cao, K. X., Wang, X. M. Orthotopic Injection of Breast Cancer Cells into the Mice Mammary Fat Pad. Journal of Visualized Experiments. (143), e58604 (2019).
- Tavera-Mendoza, L. E., Brown, M. A less invasive method for orthotopic injection of breast cancer cells into the mouse mammary gland. Laboratory Animals. 51, 85-88 (2017).
- Paschall, A. V., Liu, K. An Orthotopic Mouse Model of Spontaneous Breast Cancer Metastasis. Journal of Visualized Experiments. (114), e54040 (2016).
- Kocaturk, B., Versteeg, H. H. Orthotopic injection of breast cancer cells into the mammary fat pad of mice to study tumor growth. Journal of Visualized Experiments. (96), e51967 (2015).
- Fletcher, S. J., et al. Human breast adipose tissue: characterization of factors that change during tumor progression in human breast cancer. Journal of Experimental and Clinical Cancer Research. 36, 26 (2017).
- Giuliano, A. E., et al. Axillary dissection vs no axillary dissection in women with invasive breast cancer and sentinel node metastasis: a randomized clinical trial. Journal of the American Medical Association. 305, 569-575 (2011).
- Rummel, S., Hueman, M. T., Costantino, N., Shriver, C. D., Ellsworth, R. E. Tumour location within the breast: Does tumour site have prognostic ability? Ecancermedicalscience. 9, 552 (2015).
- Kroman, N., Wohlfahrt, J., Mouridsen, H. T., Melbye, M. Influence of tumor location on breast cancer prognosis. International Journal of Cancer. 105, 542-545 (2003).
- Bao, J., Yu, K. D., Jiang, Y. Z., Shao, Z. M., Di, G. H. The effect of laterality and primary tumor site on cancer-specific mortality in breast cancer: a SEER population-based study. PLoS One. 9, e94815 (2014).
- Faustino-Rocha, A., et al. Estimation of rat mammary tumor volume using caliper and ultrasonography measurements. Lab Animal. 42, 217-224 (2013).
- Mullen, P. The use of Matrigel to facilitate the establishment of human cancer cell lines as xenografts. Methods in Molecular Medicine. 88, 287-292 (2004).
- Jensen, R. L., Leppla, D., Rokosz, N., Wurster, R. D. Matrigel augments xenograft transplantation of meningioma cells into athymic mice. Neurosurgery. 42, 130-136 (1998).
- Mullen, P., Langdon, S. P. The use of matrigel in the establishment of ovarian carcinoma cell lines as xenografts. Methods in Molecular Medicine. 39, 199-203 (2001).
- Fliedner, F. P., Hansen, A. E., Jorgensen, J. T., Kjaer, A. The use of matrigel has no influence on tumor development or PET imaging in FaDu human head and neck cancer xenografts. BMC Medical Imaging. 16, 5 (2016).
- Mullen, P., Ritchie, A., Langdon, S. P., Miller, W. R. Effect of Matrigel on the tumorigenicity of human breast and ovarian carcinoma cell lines. International Journal of Cancer. 67, 816-820 (1996).
- Zinn, K. R., et al. Noninvasive bioluminescence imaging in small animals. Journal of the Institute for Laboratory Animal Research. 49, 103-115 (2008).
- Troy, T., Jekic-Mullen, D., Sambucetti, L., Rice, B. Quantitative Comparison of the Sensitivity of Detection of Fluorescent and Bioluminescent Reproters in Animal Models. Molecular Imaging. 3 (1), 9-23 (2004).
