Summary
עבודה זו מוגדרות מראש פרוטוקול מתקדם כדי להעריך במדויק את טעינת הגידול על ידי זיהוי של חלבון פלורסנט ירוק אותות biלומינסנציה, כמו גם שילוב של טכניקת גילוי מולקולרי כמותי.
Abstract
שלוש שליליות סרטן השד (TNBC) הוא סוג של סרטן השד אגרסיבי תת-שם עם אפשרויות טיפוליות מוגבלות. בהשוואה לחולים עם גידולים בשד פחות אגרסיבי, שיעור ההישרדות של 5 שנים של החולים TNBC הוא 77% בשל המאפיינים האופייניים שלהם התרופה עמידים בפני ובעול גרורתי. לקראת סוף זה, מודלים murine הוקמו במטרה לזהות אסטרטגיות טיפוליות הרומן הגבלת צמיחת הגידול TNBC וכפולה גרורתית. עבודה זו מתארת מדריך מעשי עבור מודל TNBC אורתוד2 שם מד א-MB-231 התאים סרטן השד מושעה מטריקס קרום המרתף מושתלים בתוך משטח שומן החלב הרביעי, אשר מחקה היטב את התנהגות התא סרטן בבני אדם. מדידה של גידולים על ידי caliper, גרורות ריאות הערכה דרך vivo ו ex הדמיה vivo, וזיהוי מולקולרי נדונים. מודל זה מספק פלטפורמה מעולה ללמוד יעילות טיפולית והוא מתאים במיוחד לחקר האינטראקציה בין הגידול העיקרי האתרים גרורתית.
Introduction
כאחד בשמונה נשים בארצות הברית יפתחו סרטן שד פולשני במהלך חייה, ו 10% על 20% של נשים אלה ייאובחנו עם סרטן השד השלילי משולשת שלילית (TNBC) סוג משנה. בעוד נגעים ראשוניים ניתן להסיר בניתוח ברוב המקרים, subetaהמיקרוסטאוסטזיס ו cheof העמדה להפוך אותו מחלה סורר. וחשוב מכך, רוב המטופלים בעלי TNBC גרורתית מתדרדרות בסופו של דבר, גם אם הם עברו טיפול בשלב מוקדם1. כך, סרטן טרוגניות, micrometaאוסטזיס, והתנגדות טיפולית הם שלושה אתגרים עיקריים להגביל את התוצאה הקלינית המוצלחת של חולים TNBC. מכאן, יש צורך דחוף להבין טוב יותר את הרקע המולקולרי פולימריות של TNBC ולפתח סוכנים טיפוליים יעילים המגבילים מחלה גרורתית.
גרורות הגידול הוא תהליך רב שלבים שבו שולט תא הגידול ולחקרת מיקרוסביבה שלה כדי לקדם הפצת משלה באמצעות השפלה קרום העור להימלט מהנגע העיקרי, דרך כניסה לתוך (כלומר, in, הסתגלות) ו לצאת (כלומר, האקסוטרציה) את vasculature ובסופו של דבר ה2 מודלים בעלי חיים פותחו כדי ללמוד גרורות סרטן השד, שבו שתי מתודולוגיות מיושמות בדרך כלל: הזרקה ישירה של זרימת הדם והשרשה אורתוטופית. בדרך כלל שיטות להזרקה ישירה של זרימת הדם כוללים הזרקת וריד הזנב, בעוד גישות אחרות כולל הזרקת לב ישירה3, הזרקת המוח ישירה4, ו הזרקת כבד ישיר5 יש גם מועסק. הזרקת זרימת הדם ישירה מכונה לעתים קרובות מודל גרורות מלאכותי, אשר הוא מהיר וקל אך פחות מבחינה פיזיולוגית מדויק משום שהוא חוסם את הגידול בריחה מן הנגע העיקרי הפגיעה6,7,8. כאשר לעומת מודלים הזרקה ישירה, המודל של סרטן השד אורתוטופית לוקח זמן רב יותר עבור התרחשות של נגעים גרורתית לזיהוי באיברים מרוחקים כגון הריאה, אבל זה רלוונטי יותר מבחינה פיזיולוגית כי זה הדוק באופן מקרוב את תהליך גרורתית רב כפי שהוא מתרחש בבני אדם. חשוב מאוד, מחקר 20139 לעומת הזרקת וריד הזנב מודלים אורתודופית ומצא כי התאים לסרטן השד מוזרק לתוך הווריד הזנב ואת אלה מבודדים נגעים גרורתית ריאה לאחר הזרקת הזנב הציג הדמויות הכללית גנים ביטוי גנטי. לעומת זאת, הפרופיל הגלובלי של ביטוי הגן של תאים אורתולמריחה על סרטן השד היה שונה באופן דרמטי מזו של נגעים גרורתי ריאתי הנובעים תאים אורתולמריחה על הפנים9. תצפיות אלה מרמזות על כך שמודל הנושא מבחינה פיזיולוגית יותר רלוונטי, משום שהנגעים הגרורתית עוברים תהליך בחירה דומה לתהליך רב-השלבים של גרורות כפי שהוא מתרחש בבני אדם.
עבודה זו מתארת סרטן השד אורתוטופית (מד א-מנ-231-לוק/GFP) מודל בעכברים ערומים כי היה אופטימיזציה במעבדה שלנו עבור טכניקות זיהוי הדמיה, כמו גם זיהוי של בדיקות הרומן ופיתוח של סוכני כימותרפיות ייעודיים.
Protocol
ניתוח של גידול הגידול בוצע באמצעות פרוטוקולים שאושרו על ידי הוועדה לאתיקה של ניסויים בבעלי חיים של המכון לסרטן הלאומי ודבק להמלצות של מועצת המחקר הלאומית של ארצות הברית "מדריך לטיפול ושימוש של בעלי חיים מעבדתיים, "המדריך לבריאות הציבור של ארצות הברית" מדריך לטיפול ולשימוש בחיות מעבדה ובמדיניות הטיפול הומאני והשימוש בחיות מעבדה.
1. הכנת תאים להשתלה
הערה: מד א-MB-231 האדם השד אדנוקרצינומה תאים (נרכש מסחרית) היו באופן מאוד מנוכר עם גן ללוציפראז III וחלבון פלורסנט ירוק משופר (gfp) סמן על ידי וירוס וגדל בנוכחות אנטיביוטיקה בחירה (puromycin) .
- התחל את תרבות התא עם 1 x 106 מד א-MB-231-לוק/gfp תאים ולהוסיף 15 מ ל של prewarmed (37 ° c) RPMI 1640 בינוני עם 10% העובר סרום (fbs) בבקבוקון תרבות T75. שמרו על התאים הגדלים בחממה לתרבית תאים בטמפרטורה מבוקרת ב-37 ° c עם 5% CO2. החלף את המדיום השלם לפחות 2x בשבוע.
הערה: אל תפריע לצמיחת התאים והמשך לבדוק את התנאים הגדלים של התא מדי יום. התאים צריכים להיות תת-תרבותי כאשר הם מגיעים ל-85% הנחה של 90% לשמור על שלב ההתפשטות. - שבוע לפני השתלת התא צעד, להסיר את הpuromycin מן התרבות התא בקבוקון ידי תחילה הסרת כל המדיום בבקבוקון התרבות, ולאחר מכן שטיפה 2x עם 10 מ ל של מלוחים 1x פוספט מאגור (PBS), ולבסוף להחליף את המדיום עם בינוני מלא בלי הpuromycin במהלך שלבי הוספה ושטיפה בינונית, אל תפריע לתאים. זכור לא להשתמש במדיום המלא עם האנטיביוטיקה לבחירה מעתה והלאה עבור כל שלבי חידוש המידע הבינוני.
- ביום הכנת התאים להשתלה, הסר את כל המדיום המלא לפני טריסיזציה כדי למנוע הפסקת הטריפסין. להוסיף 5 מ ל טריפסין לבקבוקון כדי טריזיציזציה של התאים. עקוב אחר התאים ובדוק שהם מתנתק מבקבוקון התרבות.
- ברגע שרוב התאים מתנתק, יש להוסיף 10 מ ל מדיום שלם כדי לנטרל את הפעילות הטריפסין. הבא, להעביר את ההשעיה התא לצינור צנטריפוגה 50 mL ו צנטריפוגה ב ~ 150 x g כדי לנקז את התאים. הסר את supernatant לאחר הצנטריפוגה ולאחר מכן להוסיף 10 מ ל של 1x PBS להשעות את התאים מחדש ולהתכונן ספירת תאים.
- לספור את התאים עם מונה התא ולהתאים את הריכוז של התא ל 20 x 106 תאים/mL ב הקרה 1X PBS המכיל 25% קרום המרתף מטריצה. הכנס 2 x 106 תאים ב 0.1 מ"ל 1X PBS עם 25% קרום המרתף מטריצה לתוך משטח השומן הרביעי של החלב של כל עכבר. הביאו מחטים ומזרקים נוספים עבור השתלת התא ולשמור את התא-מרתף ממברנה-מטריצה מיקס על הקרח לפני השרשה.
הערה: יש מקום מת במזרק ובמחט. בהתאם לבחירת המחט ואת אורך המזרק, סוג, וגודל, מזרק טוברקולב עם 0.5 במחט של 26 גרם יכול להיות עד 70 μL שטח מת10. הכינו 40% 50% שילוב של השתלת תאים כדי לפצות על השטח המת וכל אובדן מקרי אחר.
2. אורתובנושא השד סרטן המודל ואת גודל הגידול מדידה
- אפשר לבני 6 שבועות עכברים עירומים athymic לתקן את המפעל לבית לפחות 1 שבוע לפני השתלת התא.
הערה: שימוש בעכברים באותו גיל יקטין את וריאציית הנתונים. - עבור כל סיבוב, מורדם חמישה עכברים עם isof, ב 4% עם מסוננים (0.2 μm) אוויר בקצב הזרימה של 1 L/min עבור 3-4 דקות. שים לב לקצב הנשימה של העכבר ושינוי התבנית, והשתמש בצביטה בבוהן כדי לוודא שהעכבר נמצא תחת הרדמה נכונה. ברגע שהם כבר לא זזים, להסיר עכבר אחד ומניחים חרוט האף על האף והפה עם הרדמה זהה.
- לנגב את בלוטתהחלב השמאלית 4 עם אלכוהול. שימוש במלקחיים שיניים משובחות, הרם את בלוטתהחלב הרביעית במקצת כדי להכניס את המחט ל -25 גרם. ודא המחט הוא משופע מעלה ולאחר מכן מעט למשוך את הבוכנה כדי לוודא את המחט לא פגע כלי דם. אם שום דם לא נכנס המזרק, להמשיך לאט להזריק 100 μL של תא מרתף-מטריקס-מטריצה מיקס לתוך משטח שומן החלב.
הערה: אזור עגול ומוגבה יופיע מתחת לעור. - לחכות 10-15 לאחד עבור מטריקס קרום המרתף להרדן, ולאחר מכן להסיר את המחט. חזור על התהליך עם העכברים הנותרים בתא אינדוקציה. מניחים את כל מחטים משומשים מזרקים בתיבה חדה.
- השתמש באותו אתר הזרקת בלוטת החלב עבור כל העכברים. שימו עין מקרוב על האתר ההזרקה ולשים לב כל מיקס השתלת תא דולף החוצה מהאתר ההזרקה.
הערה: בתוך כמה דקות, העכבר יתחיל לחזור להכרה. - אפשר השתלת מבע צמוח בחופשיות ללא כל הפרעה עבור 7-10 ימים לפני כל מדידת גודל הגידול.
- בדוק את כל העכברים עבור גודל השתל של מבע למדוד את גודל הגידול עם caliper. לקבוע את עוצמת הגידול (mm3) עם המשוואה הבאה:
כאשר L הוא המימד הארוך ביותר ו-W הוא הממד הקצר ביותר בניצב ל-L. - זיהוי והסרה של מיירס חורג מסטיית תקן אחת של הממוצע. להשתמש רק עכברים עם גדלים הגידול המקבילה עבור ניסויים. באופן אקראי לחלק את העכברים לקבוצות טיפול שונות ולהתחיל טיפולים.
- למדוד את גודל הגידול על ידי קליבר 2x בשבוע. שימו לב לכל השינויים הפיזיים של השיתלי השיתלים (כלומר, נמק, חתך).
3. בvivo יולומינציה והדמיה לשעבר vivo פלואורסצנטית
הערה: במחקר זה, שני מימדים ביולומינציה והדמיה פלואורסצנטית מתנהלים בנקודת הקצה של הניסוי. הדמיה biלומינסנציה (בלי) בוצעה באמצעות סורק אופטי פרה מסחרי מצויד מצלמה מקורר של 16 סיביות ומחממים שלב הדמיה.
- לפני הדמיה, מורדם עד חמישה עכברים נושאת הגידול בחדר אינדוקציה על ידי הגדרת isofלאנה ב 3% עם מסוננים (0.2 μm) אוויר בקצב הזרימה של 1 L/min עבור 3-4 דקות. לקבוע הרדמה על ידי צביטה בבוהן. ודא כי התא אינדוקציה מוחזק בתוך מכסה פרקו כדי למזער את חשיפת הצוות isofלוריאן.
- מנהל D-לluciferin (150 מ"ג/ק"ג) לעכברים המסערים על ידי תוואי הצפק תוך שימוש במחט של 27 גר', ולהעביר עכבר מורדם לחדר ההדמיה. בחדר ההדמיה של הסורק, יש לשמור על האיזוof, ב-2%-2.5% עם O2 כמוביל עם קצב זרימה של 1 L/min.
הערה: לשמור על טמפרטורת הגוף של העכבר ב ~ 37 ° c במהלך ההליך על ידי שמירה על משטח מחומם תחת החדר אינדוקציה הרדמה, שולחן הדמיה (אם השלב אינו מחומם), ו postprocedure שחזור כלוב. - לפני הדמיה של עכברי המחקר, להשיג קינטיקה לוציפראב על ידי הדמיה שלושה מרווחי גידול נוסף עכברים (בעלי חיים לא הוקצו כל קבוצות לימוד) ב 2 דקות במרווחים עבור סך של 40 מינימום באמצעות הפרמטרים הבאים: הריגוש מסנן-חסום, פליטה מסנן-פתוח, f/stop 1, FOV-D, השתמש באות הביולומינסנציה שנמדד כדי להגדיר את חלון הזמן האופטימלי לרכישת תמונה עבור כל נקודות הזמן העוקבות.
- בעוד ביצוע הדמיה גרורות, מגן את האות הגבוה בלי להפסיק מן הגידול העיקרי על ידי כיסוי זה עם שרוול לחתוך מתוך כפפה שחורה. לרכוש את התמונה באמצעות אותם הפרמטרים המתוארים בשלב 3.3 עם הצד הגחוני של העכבר מול המצלמה עבור הדמיה גרורות ריאה ואת הצד השני של העכבר מול המצלמה עבור הדמיה המוח גרורות.
הערה: חיוני לבדוק כמה מותגים שונים של כפפות שחורות כדי לבחור את זה עם הומינסנציה אוטומטית מינימלית. - באמצעות סורק ותוכנת ניתוח נתונים, לצייר אזור הצורה הסטנדרטית של עניין (ROI) על חלל בית החזה או את המוח להבטיח כי האיבר כולו מכוסה להעריך את הנטל גרורתי. לכמת את ביולומינסנציה (BL) פלט כמו שטף סה כ (פוטונים/שנייה).
- מיד לאחר בלי מעשה, המתת החסד העכבר באמצעות שיתוף2 חנק (כמו לפי הנחיות acuc ומוסד מאושר בעלי חיים פרוטוקולים) ולחלץ את הריאה ואת המוח עם מספריים מעכל ומלקחיים עבור לשעבר vivo הדמיה.
הערה: הריאה שחולצו עבור הדמיה vivo ex ולספירת גרורות בריאות לא ניתן לבצע על אותו עכבר בשל הליכים שאינם תואמים. - לשטוף במהירות את כל האיברים עם ה-PBS 1 x כדי להסיר כתמי דם שטחיים ומניחים איברים על נמוך, לוחית נמוכה, פלסטיק שחור. הובלה איברים לסורק פלואורסצנטית מרובה ספקטרלי מצויד ביכולת שאינו ניתן לערבוב (מוצק-state נוזלי גל כוונון גביש) עם מצלמת CCD 12-bit עבור זיהוי GFP.
- לרכוש תמונות GFP רב לגליקטרליות (מסנן עירור = 457 ± 23 ננומטר; פליטה מסנן = 490 ננומטר לעבור ארוך) של האיברים המחולצים ועכברים בקרת הנושאת לא הגידול על ידי סריקת דרך 500 למעלה 720 ננומטר בגודל שלב של 10 ננומטר. להשתמש באיברים מחוץ לגידול עכברים בקרת הנושא לתקן פלואורסצנטית אוטומטי.
- לאחר הדמיה של GFP רב-ספקטרלית, קבע את הגדרות ההדמיה האופטימליות. לבצע רכישת תמונה של כל אברי היעד ולבצע ניתוח תמונה (כלומר, ליצור ספרייה ספקטרלית לקבלת היפוך אוטומטי ו-GFP עבור הליך ספקטרלי הסרת ערבוב) על פי פרוטוקול של היצרן.
4. זיהוי מולקולרי של תאי סרטן שד גרורתי
- לאחר הדמיה vivo ex, הצמד להקפיא את כל המוח בחנקן נוזלי ולאחסן ב-80 ° c במקפיא עד מוכן לחילוץ ה-DNA.
- עבור חילוץ ה-DNA, לשים את כל המוח בצינור הומוגניזציה 5 מ ל עם 2 מ ל של מאגר לפירוק DNA. השתמש הומוגניזה עם הגדרת הכוח ב 50 כדי המגון לסדר את כל רקמת המוח הקפוא. לאחר רקמת המוח הוא הומוגניים לחלוטין, להעביר את ההשעיה 1 mL (lysate) כדי DNase-free ו RNase-חינם 2 mL מיקרוצנטריפוגה שפופרת ולהמשיך לבודד את ה-DNA על פי פרוטוקול של היצרן.
הערה: כדי למזער את ההידבקות בזיהום DNA, נקה ביסודיות את ההומוגניצר לאחר כל מדגם על ידי שטיפה ראשונה עם 75% אתנול ב-DNase-חינם RNase-מים ללא תשלום, ואז שטיפה עם פתרון 1 M NaOH, ואחריו שטיפה עם 75% אתנול ב DNase-free ו RNase-מים ללא ביעילות להפחית ולהשמיד כל שאריות DNA. - הוסף 0.5 mL של 100% אתנול של מאגר לליזה DNA לליפוסט. לערבב לדוגמה על ידי היפוך ולאחסן בטמפרטורת החדר עבור 3 דקות.
הערה: אל יפוך פעמים רבות מדי או במרץ רב מדי. הדי. אנ. איי יהיה נראה. כמו מזרז צמר - השתמש בעצת פיפטה כדי להעביר את ה-DNA ל-DNase טרי-free ו-RNase-ללא שפופרת מיקרוצנטריפוגה של 2 מ"ל. תנו לדגימה להתייבש במשך 1 דקות. הוסיפו 1 מ"ל 75% אתנול והיפוך צינורית המיקרוצנטריפוגה 3-6x כדי לשטוף את דגימת ה-DNA. להיפטר אתנול אחרי כל כביסה על ידי ליטוף. חזור על שלב 2x של השטיפה.
- . האוויר מתייבש את דגימת הדי. אנ. איי בעשר ואז להוסיף 52 μL של 8 מ"מ NaOH לפזר את דגימת ה-DNA. Pipet 2 μL של דגימת ה-DNA עבור כימות ה-DNA, ולהשתמש הנותרים 50 μL עבור שיטת PCR בזמן אמת לאחר התאמת הריכוז.
הערה: NaOH מסייע לפתרון מלא את דגימת ה-DNA. - קוונטייט 2 μL של כל דגימת דנ א עם ספקטרוסקופיה ולהשתמש ביחס ספיגה בין A260/280 כהפניה בדיקת איכות. לחשב את הריכוז DNA עם נוסחה זו:
- כוונן את ריכוז ה-DNA כדי 50 ng/μL. עבור כל דגימת DNA, השתמש 50 ng של ה-DNA כתבנית ההתחלתית עבור שיטת PCR בזמן אמת. השתמש ב 8 מילימטר NaOH פתרון או DNase-חינם RNase-מים חינם כדי לדלל את דגימת ה-DNA.
- עיצוב זוג פריימר ספציפי חלבון האקסוגני ירוק פלואורסצנטית (GFP) רצף ב-הבית באמצעות מקור פתוח לעיצוב הפורטל האינטרנט לזיהוי PCR בזמן אמת של תג GFP בתאים גרורתי שפלשו והכובש אתרים.
הערה: מחקר זה נעשה בשימוש F: 5 '-AGAACGGCATCAAGAC-3 ', R: 5 '-TGCTGTTGTF-3. - השתמש בגיב מהיר של PCR בזמן אמת ובמכונת PCR בזמן אמת התומכת בפרוטוקול PCR בזמן אמת מהיר. בנוסף על שלבי הגברה רגילים של 30 מחזור, הוסף צעד עקומת הדיסוציאציה לסוף ההפעלה לאיתור הגברה לא ספציפית.
הערה: התנאים הבאים שימשו לגילוי מולקולרי: 95 ° c התחלה חמה 2 דקות, 40 מחזורים של 95 ° צ' 5 s, 60 ° צלזיוס 15, ולבסוף ניתוח עקומת ההיתוך. האמפר GFP הוא 135 bp בגודל. - השתמש ב-DNA המוח העכבר התמים (לא השתלת תא מד א-MB-231) כשליטה שלילית. השתמש ב-DNA מופק מד א-MB-231-GFP/לוק תאים כפקד חיובי. הוסף את כל הריאגנטים של ה-PCR ללא כל תבנית DNA כאין בקרת תבנית (NTC).
הערה: יש צורך בבקרת PCR עבור כל שיטת ה-PCR.
5. סרטן שד גרורות זיהוי התא בריאות
- עבור תת הקבוצה עכברים שנבחרו לספירה גולה גרורתית הריאה, להרדים עכברים עם isofלאנה (כמו בשלב 2.2) מיד לאחר הדמיה ex vivo, לבצע ניקוב לב עבור איסוף דם, ולאחר מכן המתת חסד על ידי פריקה צוואר הרחם.
- פתח את חלל החזה בעזרת מספריים מבתר וחתך את הלב והתימוס כדי לחשוף את קנה הנשימה.
- הכנס מזרק 10 מ ל עם מחט של 22 גרם המכיל את הפתרון של Bouin לתוך קנה הנשימה. דחפו את המזרק עד שהריאות המכווצות נפוחים ב-~ 2 מ ל של הפתרון של Bouin. להסיר את המזרק ואת המחט פעם הריאות כבר התנפח.
- מניחים את הריאה כולה לתוך 15 מ ל שפופרת המכילה את הפתרון של Bouin, בעדינות להפוך את הצינור כמה פעמים, ולאפשר לטבול עבור 24 h בטמפרטורת החדר.
- לאחר 24 שעות, להסיר את הפתרון של Bouin מהצינור, לשטוף את הריאה עם מים, ולאחר מכן למקם אותו בחזרה בצינור עם 70% אתנול. גרורות הרוזן (כתמים לבנים או גושים) על משטחי הריאות באמצעות מיקרוסקופ מבתר.
6. איסוף וניתוח נתונים
- הקלטת נתוני נפח הגידול, כמו גם בנתונים vivo ו לשעבר הדמיה vivo, על גיליון אלקטרוני אלקטרוני להזנת נתונים קלים, איסוף, וניהול.
- בסוף הניסוי, העבר את כל הנתונים לגיליון האלקטרוני האלקטרוני ולתוכנה הסטטיסטית לצורך התוויית נתונים וניתוחים סטטיסטיים.
Representative Results
מדידת נפח הגידול על ידי קליבר היא שיטה מבוססת היטב כדי להעריך את יעילות הטיפול (איור 1). מספר התאים שהושתל, השימוש של מטריצת קרום המרתף, microbiome, נקיון מתקן, הזרקה האתר הם גורמים מרכזיים להשפיע על קצב צמיחת הגידול.
שלא כמו הדמיה GFP, הצורך בלי להיות מנהל המצע לוציפראז לפחות 15 עד 20 דקות לפני הדמיה בלי. יתר על כן, מאמץ העכבר, קו התא, טיפולים, ו כתבת ללוציפראז כולם משפיעים על רמות האות ביולומינסנציה. כך, כדי לקבל אותות דומים בין קבוצות המחקר, מחקר טרום דימות לפני הדמיה חייב להתבצע כדי לקבוע את מסגרת זמן הדמיה הטובה ביותר (איור 2).
בשל היחס אות לרקע מעולה26,27, הגוף כולו ב vivo biלומינסנציה הדמיה היה רגיש למדי בזיהוי אות גרורות ברמה נמוכה לעומת הגישה gfp (איור 3). יתרה מזאת, אות הביולומינסנציה סיפק חדירה עמוקה יותר מ-GFP על-ידי כמה מילימטרים. עם זאת, ייצור אותות ביולומינסנציה דורש ATP, שהוא גורם מגביל בהערכת דגימות רקמה vivo ex. אם בעלי החיים מעובדים במהירות, אז בלי היכולת להיות גישה קיימא כדי להשיג תוצאות כמותי על גרורות. דרך אחת להשיג זאת היא על ידי עיבוד חיה אחת בכל פעם. עם זאת, גישה זו לא היתה אפשרית עבור מחקר זה, כי קבוצה גדולה של עכברים שימש. אות בלי הבחנה לא זוהתה כאשר האיברים היו מוזרקות סביב 45 מינימום הזרקת לוספרין. השימוש בשורה תא כתבת כפולה שימושי במצב זה. בשל טבעו היציב של המולקולה GFP, החוקרים יהיה מספיק זמן כדי לעבד את הגווייה לפני לכידת אותות GFP מאברי היעד (איור 4).
איור 5 מספק דוגמה החיים האמיתיים של איך קליבר מדידות גודל הגידול יכול לעוות את פרשנות הנתונים, כי השתל מבע פסידו רוב התוכן תא גידול קיימא, אך עדיין שמרה על מסה גדולה וצורתו. הבדיקה histopathological של אלה שתלי xenografts צביעו נמק בתוך המסה (איור 5ב).
עבור חוקרים אשר לאתגר את תוצאות ההדמיה לגבי גרורות במוח במודל סרטן השד אורתוטופית, זיהוי מולקולרי על ידי PCR בזמן אמת יכול לספק ראיות משכנעות (איור 6). במקרה זה, ברצף ה-DNA האקסוגני GFP היה הדרך הטובה ביותר לטפל בבעיה זו, כי רצף ה-DNA GFP מזוהמים לא קיים באופן טבעי בבני אדם או מכרסמים.
איור 1: מדידת נפח הגידול. גידול נפח/טעינת מדידה עם קליבר התחיל ביום 10 לאחר השתלת מבע ולאחר מכן נמדד 2x בשבוע עד סוף הניסוי. קווי שגיאה מחושבים לפי ערך SEM. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.
איור 2: קביעת החלון האופטימלי לרכישת תמונות. שמאל: עכבר אחד עם השתל מבע ועכבר אחד עם מבע קטן נבחרו עבור ההגדרה האופטימלית לוציב קינטי טווח. מימין: לluciferin עקום קינטי מושגת על ידי רכישת תמונות כל 2 דקות עבור 40 דקות. הרמה נצפתה בין 15 ל -22 דקות, ששימש כזמן רכישת תמונה אופטימלי לכל ההדמיה הבאה. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.
איור 3: הגוף כולו בלי הדמיה. L: גוף שלם בלי הדמיה. M: מבט גחוני עם הגוף התחתון מכוסה בשרוול של כפפה שחורה. ר: מבט מראש עם הגוף התחתון מכוסה בשרוול של כפפה שחורה. הצומת גרורות הלימפה בתוך השחי מזוהה בנוף הגחוני על ידי הדמיה בלי. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.
איור 4: Ex VIVO בלי/GFP זיהוי אותות. אותות GFP זוהו במוח ובריאות מאותו עכבר 20 דקות לאחר שהעכבר הוקרב. אות בלי הבחנה לא זוהתה 45 מינימום פוסט לוספרין הזרקה. לא זוהה אות GFP במוח העכבר הנאיבי והריאות. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.
איור 5: היתרונות של טכניקות דימות אופטי על פני מדידות קליבר. (א) דמות ייצוגית המציגה בזיהוי אותות vivo gfp בגידול ראשוני. רק חלק קטין של שהשתיל מבע ראה אות gfp, מציע כי חלק משמעותי של המסה היה משתית. זה לא יכול להיקבע על ידי מדידות מסורתיות והוא יכול להוביל למסקנה לא מדויקת. דוגמה זו מדגישה את חשיבות הדימות האופטי עבור מחקר המודל החי. (ב) סעיף histopathology של אותו עכבר מראה כי האזור נקרוטיק (כלומר, האזור הפנימי) תרם גם לחישוב גודל הגידול. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.
איור 6: ניתוח עקומת ההיתוך. העלילה עקומת להמיס מראה ספציפיות של הגברה GFP. ה-DNA מהמוח שהתקבל מן מד א-MB-231-לוק/GFP-מושתל עכברים ו-DNA מבודד מד א-MB-231-לוק/GFP התאים הגדלים בתרבות (שליטה חיובית) היו ה,. שיטת ה-PCR בזמן אמת בוצעה כדי להעריך את תוכן ה-GFP ברקמת המוח. (א, ב) את עקומות ההיתוך של שליטה חיובית DNA שחולצו ממוח העכבר, בהתאמה. (ג) עיקולים חופפים של פאנלים A ו-B, המציין את אותות השיא של המוח העכבר dnas הם ספציפיים עבור רצף gfp האקסוסוגני. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.
Discussion
למחקר של TNBC בבעלי חיים, שני מודלים murine פותחו: מד א-MB-231 שד האדם אדנוקרצינומה תאים בעכברים פרוצים החיסונית (כלומר עכברים העירום athymic, העכברים NSG), ואת 4T1 ב החיסונית מוסמך BALB/c עכברים. לשני הדגמים יש את היתרונות שלהם. הבחירה של המודל החי למחקר תלויה ביעדי המחקר. לדוגמה, מד א-MB-231 מודל הוא קו התאים האנושי TNBC גדל בעכברים שנפרצו החיסוני מחקה חיסוני סרטן השד האנושי חולים. מצד שני, הפנוטיפ פולשנית של אורתופפית 4T1 משולשת שלילית מורטין בתאי סרטן השד בעכברים BALB/c מקרוב מחקה את תהליך גרורתי כפי שהוא מתרחש בשלב IV סרטן השד האנושי חולים. בניגוד הגישה להזרקה הזרקת התא, האדם מד א-MB-231 סרטן השד התאים הוזרק באופן דומה לתוך pad שומן של החלב11,12 במודל סרטן השד אורתוטופית11,13. גידול ארוך יותר הגידול ואת היכולת גרורתית רכשה הוא רלוונטי יותר מבחינה פיזיולוגית, ולכן זה לא מלאכותי סרטן גרורתי4,14. כזה מודל גרורות ספונטנית מחקה באופן הדוק התפתחות סרטן השד האנושי למעט בשלב החניכה. זהו מודל חיוני עבור הקרנת תרופות vivo ויעילות טיפולית הערכת סרטן שד גרורתי.
אתר השתלת הגידול בעכבר משחק תפקיד מכריע במתן סביבת מיקרו המקיים צמיחת הגידול ואת הבחירה של פנוטיפ גרוטיפים דומה לזה אשר מתרחשת בבני אדם. הצומת לימפה האבודיים ואת הנוכחות של הרקמה אדיפוז הם גורמים מרכזיים המשפיעים על התקדמות המחלה של סרטן השד15,16. בחולה אנוש, את הלימפה ואת רקמת אדיפוז הם שני גורמים מרכזיים אינטראקציה המשפיעים על ממאירות ושכיחות של סרטן השד17,18,19. כך, הבחירה של המיקום האנטומי הנכון לאתר ההזרקה יכול להשפיע מאוד על הרלוונטיות של מודל הגידול לעומת המחלה האנושית. מחקר זה השתמש בבלוטת החלב הרביעית כאתר ההשתלה בעיקר בשל הדרישות הנ ל והוא נגיש יותר מבחינה אנטומית ויותר קל לתמרן.
שיטות חישוב שונות של נפח הגידול זמינים, וחוקר יכול לבחור כל מה שהם רואים להתאים. האלגוריתם שנבחר עבור מחקר זה מבוסס על הממצאים על ידי פאוסטינו-רושה ואח ', מי השווה את הגידול שונה החישוב הנוסחאות והסיק כי הנוסחה להלן היא המדויקת ביותר20.
מטריצת ממברנה מטריקס היא מטריצה מתוך מספר חשוב בשימוש שונים בתוך מבחנה21 ו vivo22,23 assays. ישנם דיווחים סותר22,24,25 לגבי ההשפעה של מטריקס קרום המרתף על ממאירות מבע. זה נראה רק משפיע על הקמתה הראשונית של מבע ואין לו השפעה נוספת על צמיחה מבע25. עבור ההשתלה מבע תיאר, מטריקס קרום המרתף היה מעורבב עם תאים סרטניים כדי להגדיל את התא/ג'ל ערבוב צמיגות פתרון לפני השרשה. הנוכחות של מטריקס קרום המרתף מפחית את אובדן הפתרון לערבב מהאתר ההזרקה ושומר את הפתרון ערבוב באתר ההשתלה, ובכך להגדיל את אחידות של נפח מבע מושתל.
קו מד א-MB-231 התאים הוא שד ממאיר המונצח האדם קו התאים אדנוקרצינומה והוא כלי פופולרי בחקר סרטן השד בגלל מעמד משולשת שלילי שלה. השימוש כתבים כפולים (לוציפראז ו-GFP) קו התא מאפשר גמישות רבה יותר בטיפול ב vivo ולשעבר הדמיה vivo. הוא מבוסס היטב כי האות biלומינסנציה בעלת רגישות גבוהה יותר, הפחתת עומק, וניגודיות מעולה (יחס אות לרעש) מאשר אותות GFP. בגלל זה, זה הדמיה בשימוש נרחב מודאליות עבור דימות גוף שלם. למרבה הצער, גילוי ביולומינסנציה מוגבל על ידי חלון זמן צר (~ 15-20 דקות לאחר הזרקת לוצין) שבמהלכו זיהוי האותות הוא ליניארי. האות בלי הקשר פוחתת במהירות. כאשר החיות מורדמים זה הופך בעיה בעיצוב ניסיוני אם עכברים רבים צריכים להיות מורדמים לקצור מספר רקמות או איברים נדרש. במחקרים אלה, הדם נקצרו על ידי ניקוב לב ישיר, המוח, הגידול העיקרי, הריאות, וצומת לימפה מושפע נבדקו ב 40 עכברים. בזמן שהאיברים נקצרו ומוכנים לדימות vivo ex, האות הביולומינסאלי היה בלתי ניתן לאיתור. לכן, זיהוי GFP מתאים יותר במצבים אלה. פליטת האות GFP היא בטווח הנראה, ובאורכי גל אלה, קליטת אותות עקב דם (כלומר, המוגלובין) הוא גבוה באופן משמעותי. כמו כן, פלואורסצנטית אוטומטי בטווח הגלוי בשל NADH, שאיבת שומן, ו פלזינים תוצאות ברקע משמעותי שמקשה על ההבחנה בין אות GFP ברמה נמוכה ורקע בלתי מבוקר. שימוש בגישה להדמיה רב ספקטראלית במקום הדמיה מסורתית של זוג מסננים ושימוש באלגוריתמים שאינם מתערבבים, מסייעים בזיהוי אות GFP אמיתי באיבר העניין. מכאן, על ידי שילוב העוצמות של הדמיה biלומינסנציה בגוף כולו בזיהוי vivo והדמיה GFP רב לשעבר בvivo איברים/רקמה הערכות, הנתונים הניתנים לכימות ניתן להגדיל בתוך קבוצה גדולה של עכברים.
לא משנה איזו גישה נבחרה עבור מחקר בעלי חיים, חילוץ כל הדם לפני אחזור איברים/רקמות מומלץ מאוד, במיוחד עבור מחקרים המכוונים את הנטל הגרורתי. פרוטוקול זה מזהה אותות GFP מדגימות הדם כולו שהתקבלו מן העכברים (נתונים לא מוצגים) במודל סרטן השד אורתובנושא על ידי PCR בזמן אמת assays. מזעור נפח הדם באיברים/רקמות תפחית את האות חיובי שווא באברי היעד.
לסיכום, המודל של סרטן השד אורתוטופית באמצעות התאים מד א-בנפח-230-לוק/GFP הוא דגם בעל החיים הרלוונטי ביותר המחקה את מצב החולה של האדם TNBC. מודל זה חיוני ללמידה, ניטור, והערכת יעילות טיפולית בסביבה מיקרוסביבתית של הגידול הדומה לבני האדם. השימוש של שורות תא כפול הכתב עוד מגביר את המעשיות של מודל זה הסרטן השד אורתובנושא.
Disclosures
. למחברים אין מה לגלות
Acknowledgments
המחברים רוצים להכיר בתמיכה על ידי תוכנית המחקר הפנים של המכון הלאומי לבריאות, המכון הלאומי לסרטן, בת MD, סרטן התוכנית דלקת, והמעבדה פרדריק הלאומי-תוכנית קטנה בעלי חיים הדמיה, המחקר הביו-רפואי של ליידוס, פרדריק מרילנד, ארה ב.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Bouins Solution | Sigma | HT10132-1L | Lung metastatic nodule staining |
| D-Luciferin, Potassium Salt | GoldBio | LUCK-1G | Luciferase substrate |
| DNAzol | ThermoFisher | 10503027 | DNA extraction Kit |
| Excel | Microsoft | Spreadsheet software | |
| homogenizer | Virtis | Cyclone Virtishear | For tissue homogenization |
| IVIS SPECTRUM scanner | Perkin Elmer | fluorescence and BLI imaging system | |
| Maestro GNIR-FLEX fluorescence scanner | Perkin Elmer | fluorescence imaging system | |
| MatriGel Matrix | Corning | 356234 | Store at -20C and keep old (4 C) when in use. |
| MDA-MB-231 / Luciferase-2A-GFP Stable Cell Line | GenTarget | SC044 | Dual Reporter human breast cancer cell line |
| Microscope | ThermoFisher | EVOS | histology image capture |
| Phosphate-Buffered Saline | ThermoFisher | 10010049 | rinse buffer |
| Primer3 | MIT | Primer Design | |
| Prism | GraphPad | Statistical Analysis Software | |
| Puromycin | ThermoFisher | A1113803 | Antibiotics |
| RPMI 1640 media | ThermoFisher | 61870127 | Culture media |
| SeniFAST SYBR Lo-ROX kit | Bioline | BIO-94020 | Fast Real-Time PCR Reagent |
| StepOne Plus Real-Time PCR system | ThermoFisher | Real-Time PCR machine |
References
- Abramson, V. G., Lehmann, B. D., Ballinger, T. J., Pietenpol, J. A. Subtyping of triple-negative breast cancer: implications for therapy. Cancer. 121, 8-16 (2015).
- Zhuang, X., Zhang, H., Hu, G. Cancer and Microenvironment Plasticity: Double-Edged Swords in Metastasis. Trends in Pharmacological Sciences. 40 (6), 419-429 (2019).
- Campbell, J. P., Merkel, A. R., Masood-Campbell, S. K., Elefteriou, F., Sterling, J. A. Models of bone metastasis. Journal of Visualized Experiments. (67), e4260 (2012).
- Saha, D., et al. In vivo bioluminescence imaging of tumor hypoxia dynamics of breast cancer brain metastasis in a mouse model. Journal of Visualized Experiments. (56), e3175 (2011).
- Goddard, E. T., Fischer, J., Schedin, P. A Portal Vein Injection Model to Study Liver Metastasis of Breast Cancer. Journal of Visualized Experiments. (118), e54903 (2016).
- Lim, E., et al. Monitoring tumor metastases and osteolytic lesions with bioluminescence and micro CT imaging. Journal of Visualized Experiments. (50), e2775 (2011).
- Bauerle, T., Komljenovic, D., Berger, M. R., Semmler, W. Multi-modal imaging of angiogenesis in a nude rat model of breast cancer bone metastasis using magnetic resonance imaging, volumetric computed tomography and ultrasound. Journal of Visualized Experiments. (66), e4178 (2012).
- Katsuta, E., Oshi, M., Rashid, O. M., Takabe, K. Generating a Murine Orthotopic Metastatic Breast Cancer Model and Performing Murine Radical Mastectomy. Journal of Visualized Experiments. (141), e57849 (2018).
- Rashid, O. M., et al. Is tail vein injection a relevant breast cancer lung metastasis model? Journal of Thoracic Disease. 5, 385-392 (2013).
- Bhambhani, V., Beri, R. S., Puliyel, J. M. Inadvertent overdosing of neonates as a result of the dead space of the syringe hub and needle. Archives of Disease in Childhood: Fetal and Neonatal Edition. 90, F444-F445 (2005).
- Zhang, G. L., Zhang, Y., Cao, K. X., Wang, X. M. Orthotopic Injection of Breast Cancer Cells into the Mice Mammary Fat Pad. Journal of Visualized Experiments. (143), e58604 (2019).
- Tavera-Mendoza, L. E., Brown, M. A less invasive method for orthotopic injection of breast cancer cells into the mouse mammary gland. Laboratory Animals. 51, 85-88 (2017).
- Paschall, A. V., Liu, K. An Orthotopic Mouse Model of Spontaneous Breast Cancer Metastasis. Journal of Visualized Experiments. (114), e54040 (2016).
- Kocaturk, B., Versteeg, H. H. Orthotopic injection of breast cancer cells into the mammary fat pad of mice to study tumor growth. Journal of Visualized Experiments. (96), e51967 (2015).
- Fletcher, S. J., et al. Human breast adipose tissue: characterization of factors that change during tumor progression in human breast cancer. Journal of Experimental and Clinical Cancer Research. 36, 26 (2017).
- Giuliano, A. E., et al. Axillary dissection vs no axillary dissection in women with invasive breast cancer and sentinel node metastasis: a randomized clinical trial. Journal of the American Medical Association. 305, 569-575 (2011).
- Rummel, S., Hueman, M. T., Costantino, N., Shriver, C. D., Ellsworth, R. E. Tumour location within the breast: Does tumour site have prognostic ability? Ecancermedicalscience. 9, 552 (2015).
- Kroman, N., Wohlfahrt, J., Mouridsen, H. T., Melbye, M. Influence of tumor location on breast cancer prognosis. International Journal of Cancer. 105, 542-545 (2003).
- Bao, J., Yu, K. D., Jiang, Y. Z., Shao, Z. M., Di, G. H. The effect of laterality and primary tumor site on cancer-specific mortality in breast cancer: a SEER population-based study. PLoS One. 9, e94815 (2014).
- Faustino-Rocha, A., et al. Estimation of rat mammary tumor volume using caliper and ultrasonography measurements. Lab Animal. 42, 217-224 (2013).
- Mullen, P. The use of Matrigel to facilitate the establishment of human cancer cell lines as xenografts. Methods in Molecular Medicine. 88, 287-292 (2004).
- Jensen, R. L., Leppla, D., Rokosz, N., Wurster, R. D. Matrigel augments xenograft transplantation of meningioma cells into athymic mice. Neurosurgery. 42, 130-136 (1998).
- Mullen, P., Langdon, S. P. The use of matrigel in the establishment of ovarian carcinoma cell lines as xenografts. Methods in Molecular Medicine. 39, 199-203 (2001).
- Fliedner, F. P., Hansen, A. E., Jorgensen, J. T., Kjaer, A. The use of matrigel has no influence on tumor development or PET imaging in FaDu human head and neck cancer xenografts. BMC Medical Imaging. 16, 5 (2016).
- Mullen, P., Ritchie, A., Langdon, S. P., Miller, W. R. Effect of Matrigel on the tumorigenicity of human breast and ovarian carcinoma cell lines. International Journal of Cancer. 67, 816-820 (1996).
- Zinn, K. R., et al. Noninvasive bioluminescence imaging in small animals. Journal of the Institute for Laboratory Animal Research. 49, 103-115 (2008).
- Troy, T., Jekic-Mullen, D., Sambucetti, L., Rice, B. Quantitative Comparison of the Sensitivity of Detection of Fluorescent and Bioluminescent Reproters in Animal Models. Molecular Imaging. 3 (1), 9-23 (2004).
