Summary
Bu çalışma, yeşil floresan protein ve biyolüminesans sinyallerinin yanı sıra kantitatif moleküler algılama tekniğinin entegrasyonu ile tümör yüklemesini doğru bir şekilde değerlendirmek için gelişmiş bir protokol hazırlaştır.
Abstract
Üçlü negatif meme kanseri (TNBC) sınırlı tedavi seçenekleri ile agresif bir meme kanseri alt türüdür. Daha az agresif meme tümörü olan hastalarla karşılaştırıldığında, TNBC hastalarının 5 yıllık sağkalım oranı karakteristik ilaca dirençli fenotip ve metastatik yükü nedeniyle %77'dir. Bu doğrultuda, TNBC tümör büyümesini ve metastatik yayılımı sınırlayan yeni tedavi stratejilerini belirlemeyi amaçlayan minin modelleri oluşturulmuştur. Bu çalışma, bir bodrum zarı matris asılı MDA-MB-231 meme kanseri hücreleri yakından insanlarda kanser hücresi davranışını taklit dördüncü meme yağ yastığı implante edildiği TNBC ortotopik modeli için pratik bir kılavuz açıklar. Tümörlerin kaliper ile ölçümü, in vivo ve ex vivo görüntüleme ile akciğer metastazı değerlendirmesi ve moleküler saptama tartışılmıştır. Bu model terapötik etkinliğini incelemek için mükemmel bir platform sağlar ve özellikle primer tümör ve distal metastatik siteler arasındaki etkileşimin incelenmesi için uygundur.
Introduction
Amerika Birleşik Devletleri'nde yaklaşık bir sekiz kadın ömrü boyunca invaziv meme kanseri gelişecektir, ve 10% −20% agresif üçlü negatif meme kanseri tanısı olacak (TNBC) alt tipi. Primer lezyonlar çoğu durumda cerrahi olarak çıkarılabilirken, subklinik mikrometastaz ve kemodirenç onu inatçı bir hastalık haline getirse de. Daha da önemlisi, metastatik TNBC olan hastaların çoğu sonunda nüks, onlar erken aşamada tedavi uygulandı bile1. Bu nedenle, kanser heterojenitesi, mikrometastaz ve terapötik direnç TNBC hastalarının başarılı klinik sonuçlarını sınırlayan üç önemli sorundur. Bu nedenle, Daha iyi TNBC polimorfik moleküler arka plan anlamak ve metastatik hastalığı sınırlayan etkili terapötik ajanlar geliştirmek için acil bir ihtiyaç vardır.
Tümör metastazı, tümör hücresinin mikroçevresini kontrol ettiği ve mikroçevresini kontrol ettiği ve mikroçevresini gasp ettiği, membran bozulması ve tümör hücresinin primer lezyondan kaçışı yoluyla, vazodan giriş (yani, ekstravazasyon) yoluyla ve sonuçta adaptasyon ve kolonizasyon yoluyla kendi mikroçevresini gasp ettiği çok aşamalı bir süreçtir2. Hayvan modelleri meme kanseri metastazı çalışmak için geliştirilmiştir, burada iki metodoloji yaygın olarak uygulanmaktadır: direkt kan dolaşımı enjeksiyonu ve ortotopik implantasyon. Doğrudan kan dolaşımı enjeksiyonu için yaygın olarak kullanılan yöntemler kuyruk damar enjeksiyonu dahil, doğrudan kardiyak enjeksiyon dahil olmak üzere diğer yaklaşımlar3, direkt beyin enjeksiyonu4, ve doğrudan karaciğer enjeksiyonu5 de istihdam edilmiştir. Doğrudan kan dolaşımı enjeksiyonu genellikle bir yapay metastaz modeli olarak adlandırılır, hangi hızlı ve kolay ama daha az fizyolojik olarak doğru çünkü primer lezyon ve intravazasyon tümör kaçış atlatır6,7,8. Doğrudan enjeksiyon modelleri ile karşılaştırıldığında, ortotopik meme kanseri modeli akciğer gibi uzak organlarda saptanabilir metastatik lezyonların oluşumu için daha uzun sürer, ancak yakından insanlarda meydana geldiği gibi çok adımlı metastatik süreci taklit çünkü fizyolojik olarak daha alakalıdır. Daha da önemlisi, 2013 yılında yapılan bir çalışmadakuyruk damar enjeksiyonu ve ortotopik modeller karşılaştırılmış ve kuyruk damarına enjekte edilen meme kanseri hücrelerinin ve kuyruk damar enjeksiyonundan sonra akciğer metastatik lezyonlarından izole edilenlerin benzer küresel gen ekspresyonu profilleri sergilendiği bulunmuştur. Buna karşılık, ortokjenik enjekte meme kanseri hücrelerinin küresel gen ekspresyonu profili ortotonik enjekte hücrelerden kaynaklanan akciğer metastatik lezyonların önemli ölçüde farklıydı9. Bu gözlemler ortotopik modelin fizyolojik olarak daha alakalı olduğunu göstermektedir, çünkü metastatik lezyonlar insanlarda meydana geldiği gibi çok aşamalı metastaz sürecine benzer bir seçim sürecinden geçmektedir.
Bu çalışmada, laboratuarımızda görüntüleme algılama teknikleri için optimize edilmiş çıplak farelerde ortotopik meme kanseri (MDA-MB-231-Luc/GFP) modelinin yanı sıra yeni biyobelirteçlerin belirlenmesi ve hedefe yönelik kemoterapötik ajanların geliştirilmesi anlatılmaktadır.
Protocol
Tümör büyümesinin analizi, Ulusal Kanser Enstitüsü Hayvan Deneyleri Etik Komitesi tarafından onaylanan protokoller kullanılarak gerçekleştirildi ve Amerika Birleşik Devletleri Ulusal Araştırma Konseyi'nin "Bakım ve Kullanım Kılavuzu" önerilerine uyularak Laboratuvar Hayvanları", Amerika Birleşik Devletleri Halk Sağlığı Servisi'nin "Laboratuvar Hayvanlarının Bakımı ve Kullanımı Rehberi", "Laboratuvar Hayvanlarının İnsani Bakımı ve Kullanımı Politikası".
1. İmplantasyon için hücrelerin hazırlanması
NOT: MDA-MB-231 insan meme adenokarsinom hücreleri (ticari olarak elde edilen) luciferase gen III ve geliştirilmiş yeşil floresan protein (GFP) belirteci ile lentivirus tarafından transfeced ve seçim antibiyotik varlığında yetiştirilen (puromisin) .
- Hücre kültürüne 1 x 106 MDA-MB-231-Luc/GFP hücreleri ile başlayın ve T75 kültür şişesine %10 fetal sığır serumu (FBS) ile 15 mL önceden ısıtılmış (37 °C) RPMI 1640 orta ekleyin. Hücreleri sıcaklık kontrollü hücre kültürü kuluçka makinesinde %5 CO2ile 37 °C'de tutun. Tam ortamı haftada en az 2x değiştirin.
NOT: Hücre büyümesini bozmayın ve hücre büyüme koşullarını günlük olarak kontrol etmeye devam edin. Hücrelerin çoğalma evresini korumak için %85−%90 birleşmesine ulaştıklarında alt kültüre alınması gerekir. - Hücre implantasyon adımından bir hafta önce, önce kültür şişesindeki tüm ortamı çıkararak, daha sonra 1x fosfat tamponlu salinin (PBS) 10 mL ile 2x durulama ve son olarak tam orta ile orta değiştirerek hücre kültür şişesinden puromisini çıkarın puromisin olmadan. Orta ekleme ve durulama adımları sırasında hücreleri rahatsız etmeyin. Tüm orta ikmal adımları için bundan sonra seçim antibiyotikler ile tam orta kullanmayıunutmayın.
- Hücreleri implantasyona hazırladığı gün, tripsininin devre dışı bırakmaması için tripsinizasyondan önce tüm ortamları çıkarın. Hücreleri denemek için şişeye 5 mL tripsin ekleyin. Hücreleri izleyin ve kültür şişesinden ayırıp ayırmadıklarını kontrol edin.
- Hücrelerin çoğunluğu detach sonra, tripsin aktivitesini nötralize etmek için tam orta 10 mL ekleyin. Daha sonra hücre süspansiyonuna 50 mL'lik bir santrifüj tüpüne ve ~150 x g'de hücreyi peletlemek için santrifüje aktarın. Santrifüjden sonra süpernatant'ı çıkarın ve hücreleri yeniden askıya almak ve hücre sayımı için hazırlanmak için 10 mL 1x PBS ekleyin.
- Hücreleri bir hücre sayacı ile sayın ve hücre konsantrasyonu 20 x 106 hücre/mL soğuk 1x PBS% 25 bazal membran matris içeren ayarlayın. Her farenin dördüncü meme yağ yastığına %25 bazal membran matrisi ile 0,1 mL 1x PBS'de 2 x 106 hücre enjekte edin. Hücre implantasyonu için ekstra iğneler ve şırıngalar getirin ve implantasyondan önce hücre-bodrum-membran-matris karışımını buzüzerinde tutun.
NOT: Şırınga ve iğnede ölü boşluk vardır. İğne ve şırınga uzunluğu, tipi ve boyutu seçimine bağlı olarak, 0,5 26 G iğne ile bir tüberkülin şırınga kadar 70 μL ölü alan10olabilir. Ölü alanı ve diğer kazasonucu kayıpları telafi etmek için %40−%50 daha fazla hücre implantasyonu karışımı hazırlayın.
2. Ortotopik meme kanseri modeli ve tümör boyutu ölçümü
- Hücre implantasyonundan önce en az 1 hafta boyunca 6 haftalık dişi atimik çıplak farelerin barınma tesisine alışmasını bekleyin.
NOT: Aynı yaştaki fareleri kullanmak veri değişimini azaltır. - Her tur için, izofluran ile beş fareyi % 4 oranında süzülen (0,2 μm) hava ile 3−4 dk. Bir kez artık hareket ediyor, bir fare çıkarın ve aynı anestezi ile burun ve ağız üzerine bir burun konisi yerleştirin.
- Sol4'üncü meme bezini alkolle temizleyin. İnce sıçan diş forsepsleri kullanarak, 25 G iğneeklemek için4 meme bezini hafifçe kaldırın. İğne nin yukarı yas olduğundan emin olun ve daha sonra iğnenin kan damarlarına çarpmadığından emin olmak için pistonu hafifçe çekin. Şırıngaya kan girmezse, hücre-bodrum-membran-matris karışımının 100 μL'sini meme yağ yastığına yavaşça enjekte etmeye devam edin.
NOT: Derinin altında yuvarlak, yükseltilmiş bir alan görünür. - 10−15 s bekleyin bodrum membran matris sertleşmek için, sonra iğne kaldırın. İndüksiyon odasında kalan fareler ile işlemi tekrarlayın. Kullanılan tüm iğneleri ve şırıngaları keskin bir kutuya yerleştirin.
- Tüm fareler için aynı meme bezi enjeksiyon sitesi kullanın. Enjeksiyon bölgesini yakından takip edin ve enjeksiyon bölgesinden sızan herhangi bir hücre implantasyon karışımına dikkat edin.
NOT: Birkaç dakika içinde fare bilincini yeniden kazanmaya başlayacaktır. - Herhangi bir tümör boyutu ölçümünden önce 7−10 gün boyunca ksenogreftin kesintisiz olarak serbestçe büyümesine izin verin.
- Ksenogreft boyutu için tüm fareleri inceleyin. Tümör boyutunu kaliper ile ölçün. Aşağıdaki denklemle tümör hacmini (mm3)belirleyin:
L'nin en uzun boyut olduğu ve W'nin L'ye dik en kısa boyut olduğu yer. - Ortalamanın bir standart sapması aşan aykırıları belirleyin ve kaldırın. Sadece deneyler için benzer tümör boyutlarına sahip fareler kullanın. Rastgele farklı tedavi gruplarına fareler bölmek ve tedavilere başlar.
- Tümör boyutunu haftada 2 x kaliper ile ölçün. Ksenogreftlerin (yani, nekroz, yırtılma) tüm fiziksel değişikliklerine dikkat edin.
3. In vivo biyolüminesans ve eksvivo floresan görüntüleme
NOT: Bu çalışmada deney sonunda hem iki boyutlu biyolüminesans hem de floresan görüntüleme yapılmıştır. Biyolüminesans görüntüleme (BLI), 16 bit soğutulmuş CCD kamera ve ısıtmalı görüntüleme aşaması ile donatılmış ticari bir klinik öncesi optik tarayıcı kullanılarak gerçekleştirildi.
- Görüntülemeden önce, indüksiyon odasında beş tümör taşıyan fareyi, 3−4 dk.'da 1 L/dk akış hızında filtrelenmiş (0,2 m) hava ile %3 oranında ayarlayarak anesteziyi indüksiyon odasında anestezi edin. İndüksiyon odasının, personelin isoflurana maruz ilerledilmesini en aza indirmek için havalandırmalı bir başlık içinde tutulduğundan emin olun.
- 27 G iğne kullanarak anestezili farelere 27 G iğne kullanarak D-luciferin (150 mg/kg) uygulayın ve anestezili bir fareyi görüntüleme odasına aktarın. Tarayıcı görüntüleme odasında, isofluran'ı %2−2,5 oranında, O2'yi 1 L/dk akış hızına sahip bir taşıyıcı olarak saklar.
NOT: İşlem sırasında anestezi indüksiyon odasının altında ısıtılmış bir ped, görüntüleme tablosu (evre ısıtmalı değilse) ve ameliyat sonrası geri kazanım kafesi tutarak farenin vücut Sıcaklığını ~37 °C'de koruyun. - Çalışma farelerini görüntülemeden önce, aşağıdaki parametreleri kullanarak toplam 40 dk aralıklarla 2 dakika aralıklarla üç ekstra tümör taşıyan fareyi (herhangi bir çalışma grubuna atanmamış hayvanlar) görüntüleyerek luciferin kinetik elde edin: uyarma filtresi bloke, emisyon filtresi açık, f/stop 1, FOV-D, orta binning (8 x 8) ve otomatik maruziyet. Sonraki tüm zaman noktaları için en uygun görüntü edinme süresi penceresini tanımlamak için ölçülen en yüksek biyolüminesans sinyalini kullanın.
- Metastaz görüntüleme yaparken, yüksek BLI sinyalini primer tümörden siyah bir eldivenden kesilmiş bir kolla kaplayarak koruyun. Farenin ventral tarafı akciğer metastazı görüntüleme için kameraya bakan ve farenin beyin metastazı görüntüleme için kameraya bakan dorsal tarafı ile adım 3.3 açıklanan aynı parametreleri kullanarak görüntü elde edin.
NOT: Bu en az otomatik parlaklık ile birini seçmek için siyah eldiven birkaç farklı marka test etmek esastır. - Bir tarayıcı ve veri analizi yazılımı kullanarak, torasik kavite veya beyin üzerinde metastatik yükü değerlendirmek için ilgi tüm organ kaplı dır sağlayan ilgi standart bir şekil bölge (ROI) çizin. Biyolüminesans (BL) çıktısını toplam akı (foton/saniye) olarak ölçün.
- BLI'dan hemen sonra, co2 boğulma yoluyla fareyi ötenazi yapın (ACUC yönergeleri ve kurum onaylı hayvan protokollerine göre) ve ekstrem itme için akciğer ivedive beyni kesişen makas ve forsepslerle ayıklayın.
NOT: Ex vivo görüntüleme ve akciğer metastaz nodül sayımı için çıkarılan akciğer uyumsuz işlemler nedeniyle aynı fare üzerinde yapılamaz. - Herhangi bir yüzeysel kan lekesini gidermek ve organları düşük otofloresan siyah plastik plakaüzerine yerleştirmek için tüm organları 1x PBS ile hızlı bir şekilde durulayın. GFP algılaması için 12 bit CCD kamera ile spektral karıştırma yeteneği (katı hal sıvı kristal dalga boyu ayarı) ile donatılmış bir multispektral floresan tarayıcı organları taşıma.
- 10 nm adım boyutunda 500−720 nm tarama yaparak çıkarılan organların ve tümör olmayan rulman kontrol farelerinin multispektral GFP görüntülerini (uyarma filtresi = 457 ± 23 nm; emisyon filtresi = 490 nm uzun geçiş) elde edin. Otofloresan için düzeltmek için tümör olmayan taşıyıcı kontrol farelerden excised organları kullanın.
- Multispektral GFP görüntülemeden sonra, en uygun görüntüleme ayarlarını belirleyin. Üreticinin protokolüne göre tüm hedef organların görüntü edinimi gerçekleştirin ve görüntü analizi yapın (örneğin, otofloresans için spektral bir kütüphane ve spektral karıştırma işlemi için GFP oluşturmak).
4. Metastatik meme kanseri hücrelerinin moleküler tespiti
- Ex vivo görüntülemeden sonra, snap sıvı nitrojen tüm beyin dondurun ve DNA çıkarma için hazır olana kadar bir dondurucuda -80 °C'de saklayın.
- DNA ekstraksiyonu için tüm beyni 2 mL DNA lisis tamponu ile 5 mL homojenize edici bir tüpe koyun. Snap-dondurulmuş tüm beyin dokusu homojenize etmek için 50 güç ayarı ile bir homogenizer kullanın. Beyin dokusu tamamen homojenleştirildikten sonra, 1 mL süspansiyonu (lysate) DNase içermeyen ve RNase içermeyen 2 mL mikrosantrifüj tüpe aktarın ve üreticinin protokolüne göre DNA'yı izole etmeye devam edin.
NOT: Taşıma DNA kontaminasyonunu en aza indirmek için, homogenizer'i her numuneden sonra, dnase içermeyen ve RNase içermeyen suda %75 etanol ile durulayarak iyice temizleyin, ardından 1 M NaOH çözeltisi ile durulayın, ardından DNase içermeyen %75 etanol ile durulayın ve DNA kalıntısını etkili bir şekilde azaltmak ve yok etmek için rNase içermeyen su. - 0.5 mL%100 dna lysis tampon unun %100 etanolünü lysate ekleyin. Örnek inversiyon alabilirsiniz ve oda sıcaklığında 3 dakika saklayın.
NOT: Çok fazla veya çok güçlü bir şekilde ters çevirmeyin. DNA yün benzeri bir çökelti olarak görünür olacak. - DNA'yı yeni bir DNase içermeyen ve RNase içermeyen 2 mL mikrosantrifüj tüpe aktarmak için pipet ucu kullanın. Numunenin havasının 1 dk. 1 mL %75 etanol ilave edinve DNA örneğini yıkamak için mikrosantrifüj tüpünü 3−6x ters çevirin. Borulama ile her yıkamadan sonra etanol atın. Yıkama adımını 2x tekrarlayın.
- DNA örneğini 10 s'ye hava kurutun. Daha sonra DNA örneğini eritmek için 8 mM NaOH 52 μL ekleyin. DNA testi için DNA örneğinin 2 μL'si pipet ve konsantrasyon ayarlaması sonrasında kalan 50 μL'yi gerçek zamanlı PCR testi için kullanın.
NOT: NaOH DNA örneğini tamamen çözünmeye yardımcı olur. - Her DNA örneğinin 2 μL'ini spektrofotometre ile ölçün ve kalite kontrol referansı olarak A260/280 arasında bir emme oranı kullanın. Bu formülle DNA konsantrasyonu hesaplayın:
- DNA konsantrasyonu 50 ng/μL'ye ayarlayın. Her DNA örneği için, gerçek zamanlı PCR testi için başlangıç şablonu olarak 50 ng DNA kullanın. DNA örneğini seyreltmek için 8 mM NaOH çözeltisi veya DNase içermeyen ve RNase içermeyen su kullanın.
- Dışa dönük yeşil floresan protein (GFP) dizisine özgü astar çiftini, işgal eden ve kolonize edilen distal bölgelerdeki gfp etiketinin gerçek zamanlı PCR tespiti için açık kaynak primer tasarım web portalını kullanarak şirket içinde tasarla.
NOT: Bu çalışmada F: 5'-AGAACGGCATCAAGGTGAAC-3', R: 5'-TGCTCAGGTAGTGGTGTCG-3'. - Hızlı gerçek zamanlı PCR reaktifi ve hızlı gerçek zamanlı PCR protokolünü destekleyen gerçek zamanlı bir PCR makinesi kullanın. Normal 30 döngülü amplifikasyon adımlarına ek olarak, herhangi bir spesifik olmayan amplifikasyon tespiti için koşunun sonuna bir dissociasyon eğrisi adımı ekleyin.
NOT: Moleküler algılama için aşağıdaki koşullar kullanılmıştır: 95 °C 2 dk sıcak başlangıç, 95 °C 5 s, 60 °C 15 s 40 döngü ve son olarak bir erime eğrisi analizi. GFP amplicon boyutu 135 bp. - Negatif kontrol olarak naif bir fare beyin DNA'sı (MDA-MB-231 hücre implantı değil) kullanın. Pozitif kontrol olarak MDA-MB-231-GFP/Luc hücrelerinden çıkarılan DNA'yı kullanın. Hiçbir şablon denetimi (NTC) olarak herhangi bir DNA şablonu olmadan tüm PCR reaktifleri ekleyin.
NOT: Her PCR tonu için BIR PCR denetimi gereklidir.
5. Akciğerde metastatik meme kanseri hücre tespiti
- Metastatik akciğer nodül sayımı için seçilen fareler alt grubu için, esvetin invivo görüntülemehemen sonra isofluran (adım 2.2) ile fareler anestezi, kan toplama için bir kardiyak delinme yapmak, ve daha sonra servikal dislokasyon ile ötenazi.
- Göğüs boşluğunu kesişen makaslarla açın ve nefes borusunu ortaya çıkarmak için kalp ve timusu kesin.
- 10 mL'lik bir şırınga ile 22 G iğneiçeren Bouin'in solüsyonutuna trakea yerleştirin. Çökmüş akciğerler Bouin çözeltisi ~ 2 mL ile şişmiş kadar şırınga piston itin. Akciğerler şişirildikten sonra şırıngayı ve iğneyi çıkarın.
- Tüm akciğeri Bouin'in çözeltisini içeren 15 mL'lik bir tüpe yerleştirin, tüpü birkaç kez hafifçe ters çevirin ve oda sıcaklığında 24 saat bekletin.
- 24 saat sonra, bouin çözeltisini tüpten çıkarın, akciğeri suyla durulayın ve %70 etanolle tekrar tüpe yerleştirin. Bir diseksiyon mikroskop kullanarak akciğerlerin yüzeylerinde metastaz (beyaz lekeler veya nodüller) saymak.
6. Veri toplama ve analiz
- Kolay veri girişi, toplama ve yönetimi için elektronik elektronik tabloya tümör hacmi verilerinin yanı sıra in vivo ve ex vivo görüntüleme verilerini kaydedin.
- Denemenin sonunda, veri çizimi ve istatistiksel analizler için tüm verileri elektronik elektronik tabloya ve istatistiksel yazılıma aktarın.
Representative Results
Kaliper ile tümör hacim ölçümü tedavi etkinliğini değerlendirmek için kurulmuş bir yöntemdir(Şekil 1). İmplante edilen hücrelerin sayısı, bazal membran matriskullanımı, mikrobiyom, tesis temizliği ve enjeksiyon bölgesi tümör büyüme hızını etkileyen önemli faktörlerdir.
GFP görüntülemenin aksine, BLI görüntülemeden önce en az 15−20 dk luciferase substrat uygulanması nı gerektirmiş. Ayrıca, fare zorlanma, hücre hattı, tedaviler ve luciferase muhabiri tüm biyolüminesans sinyal düzeylerini etkiler. Bu nedenle, çalışma grupları arasında karşılaştırılabilir sinyaller elde etmek için, en iyi görüntüleme zaman dilimini belirlemek için bir ön görüntüleme BLI kinetik çalışma yapılmalıdır (Şekil 2).
Üstün sinyal-arka plan oranı26nedeniyle,27, vivo biyolüminesans görüntüleme tüm vücut GFP yaklaşımı ile karşılaştırıldığında düşük seviyeli metastaz sinyali tespit oldukça duyarlıydı (Şekil 3). Ayrıca, biyolüminesans sinyali birkaç milimetre gfp daha derin penetrasyon sağladı. Ancak, biyolüminesans sinyal üretimi ATP gerektirir, hangi ex vivo doku örneklerinin değerlendirilmesinde sınırlayıcı bir faktördür. Hayvanlar hızlı bir şekilde işlenirse, o zaman BLI metastaz üzerinde nicel sonuçlar elde etmek için uygun bir yaklaşım olabilir. Bunu başarabilmek için bir yolu bir seferde bir hayvan işleme gereğidir. Ancak bu yaklaşım bu çalışma için mümkün değildi çünkü büyük bir fare kohortu kullanılmıştır. 45 dk civarında luciferin enjeksiyonu sonrası organlar görüntülendiğinde BLI sinyali tespit edilmedi. Bir çift muhabir hücre hattı kullanımı bu durumda yararlıdır. GFP molekülünün kararlı doğası nedeniyle, araştırmacılar hedef organlardan GFP sinyallerini yakalamadan önce leşi işlemek için yeterli zamana sahip olacaklardı(Şekil 4).
Şekil 5 kaliper tümör boyutu ölçümlerinin veri yorumunu nasıl bozabileceğine dair gerçek hayattabir örnek sağlar, çünkü ksenogreft canlı tümör hücre içeriğinin çoğunu kaybetmiştir, ancak yine de büyük kütlesini ve şeklini korumuştur. Bu ksenogreftlerin histopatolojik incelemesi kitle içinde nekroz olduğunu göstermiştir(Şekil 5B).
Ortotopik meme kanseri modelinde beyin metastazı ile ilgili görüntüleme sonuçlarına meydan okuyan araştırmacılar için, gerçek zamanlı PCR ile moleküler algılama ikna edici kanıtlar sağlayabilir(Şekil 6). Bu durumda, transfected GFP DNA dizisi doğal olarak insanlarda veya kemirgenlerde bulunmadığından, eksojen GFP DNA dizisi bu sorunu çözmenin en iyi yoluydu.
Şekil 1: Tümör hacmi ölçümü. Ksenogreft implantasyonundan sonra 10. Hata çubukları SEM değerine göre hesaplanır. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Şekil 2: En uygun görüntü edinme penceresinin belirlenmesi. Sol: Optimal luciferin kinetik aralık tayini için büyük ksenogreftli bir fare ve küçük ksenogreftli bir fare seçildi. Sağ: 40 dk için her 2 dakika görüntüleri elde ederek elde Luciferin kinetik eğrisi. Bir plato 15−22 dakika arasında gözlendi ve sonraki tüm görüntülemeler için en uygun görüntü edinme süresi olarak kullanıldı. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Şekil 3: Tüm vücut BLI görüntüleme. L: Tüm vücut BLI görüntüleme. M: Siyah bir eldiven bir kol ile kaplı alt vücut ile Ventral görünümü. R: Siyah bir eldiven kol ile kaplı alt gövde ile Dorsal görünümü. BLI görüntüleme ile ventral görünümde aksiller lenf nodfar metastazı saptanır. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Şekil 4: Ex vivo BLI/GFP sinyal algılama. Aynı fareden 20 dk sonra beyin ve akciğerde GFP sinyalleri tespit edildi. BLI sinyali 45 dk sonrası luciferin enjeksiyonu saptamadı. Naif fare beyin ve akciğerinde GFP sinyali saptanmadı. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Şekil 5: Optik görüntüleme tekniklerinin kaliper ölçümlerinin avantajları. (A) Primer tümörde in vivo GFP sinyal tespitini gösteren temsili görüntü. Ksenogreftin sadece küçük bir kısmı GFP sinyali göstererek kitlenin önemli bir kısmının stroma olduğunu düşündürdü. Bu, geleneksel kaliper ölçümleri ile belirlenemez ve yanlış bir sonuca yol açabilir. Bu örnek, hayvan modeli çalışması için optik görüntülemenin önemini vurgulamaktadır. (B) Aynı farenin histopatoloji bölümünde nekrotik bölgenin (yani iç bölge) tümör boyutu hesaplamasına da katkıda bulunduğu saptanmasıdır. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Şekil 6: Erime eğrisi analizi. GFP amperinin özgüllüğünü gösteren erime eğrisi çizimi. MDA-MB-231-Luc/GFP implante edilmiş farelerden elde edilen beyindna'sı ve mda-MB-231-Luc/GFP hücrelerinden izole edilen DNA (pozitif kontrol) olarak belirlendi. Gerçek zamanlı PCR tsömonbeyin dokusunda GFP içeriğini değerlendirmek için yapıldı. (A,B) Pozitif kontrolün erime eğrileri ve fare beyninden çıkarılan DNA sırasıyla. (C) Fare beyin DNA'larından gelen tepe sinyallerini gösteren A ve B panellerinin çakışan eğrileri eksojen GFP dizisine özgüdür. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Discussion
Hayvanlarda TNBC çalışması için, iki murine modelleri geliştirilmiştir: Bağışıklık tehlikeye farelerde MDA-MB-231 insan meme adenokarsinom hücreleri (yani atimik çıplak fareler, NSG fareler), ve 4T1 bağışıklık-yetkili BALB / c fareler. Her iki modelin de avantajları vardır. Bir çalışma için hayvan modelinin seçimi araştırma hedeflerine bağlıdır. Örneğin, MDA-MB-231 modeli immünosupresif insan meme kanseri hastaları taklit bağışıklık laşmış farelerde yetiştirilen bir insan TNBC hücre hattıdır. Öte yandan, BALB/c farelerinde ortotopik 4T1 üçlü negatif murin meme kanseri hücrelerinin invaziv fenotipleri, evre IV insan meme kanseri hastalarında meydana geldiği için metastatik süreci yakından taklit eder. Intravenöz hücre enjeksiyonu yaklaşımı aksine, insan MDA-MB-231 meme kanseri hücreleri benzer meme yağ pedi enjekte edildi11,12 ortotopik meme kanseri modeli11,13. Uzun tümör büyümesi ve edinsel metastatik yeteneği daha fizyolojik olarak ilgili, bu nedenle yapay bir metastatik kanser modeli değildir4,14. Böyle bir spontan metastaz modeli yakından inisiyasyon aşaması dışında insan meme kanseri gelişimini taklit eder. Bu metastatik meme kanserinde in vivo ilaç taraması ve terapötik etkinlik değerlendirmesi için önemli bir modeldir.
Faredeki tümör implantasyon bölgesi, tümör büyümesini ve insanlarda meydana gelene benzer metastatik fenotip seçimisağlayan bir mikroortamın sağlanmasında önemli bir rol oynar. Proksimal lenf düğümü ve yağ dokusunun varlığı meme kanserinin hastalık ilerlemesini etkileyen önemli faktörlerdir15,16. Bir insan hastada, lenf düğümü ve yağ dokusu hem malignite ve meme kanseri insidansını etkileyen önemli etkileşen faktörlerdir17,18,19. Böylece, enjeksiyon bölgesi için doğru anatomik yerseçimi insan hastalığına göre tümör modelinin alaka kuvvetini oldukça etkileyebilir. Bu çalışmada, dördüncü meme bezi implantasyon bölgesi olarak esas olarak yukarıda belirtilen gereksinimleri nedeniyle kullanılan ve anatomik olarak daha erişilebilir ve manipüle etmek daha kolay olduğunu.
Farklı tümör hacmi hesaplama yöntemleri mevcuttur, ve bir araştırmacı uygun gördükleri herhangi seçebilirsiniz. Bu çalışma için seçilen algoritma, farklı tümör hacmi hesaplama formüllerini karşılaştıran ve aşağıdaki formülün en doğru20olduğu sonucuna varan Faustino-Rocha ve ark.'nın bulgularına dayanmaktadır.
Bazal membran matriks çeşitli in vitro21 ve in vivo22,,23 tahlillerde kullanılan önemli bir hücre dışı matristir. 2222,24,25 ksenogreft malignitesi üzerinde bazal membran matris etkisi ile ilgili çelişkili raporlar vardır. Sadece ksenogreft in ilk kurulmasını etkiler ve ksenogreft büyüme üzerinde daha fazla etkisi var gibi görünüyor25. Açıklanan ksenogreft implantasyonu için, bazal membran matrisi implantasyon dan önce hücre/jel karışımı çözeltisi viskozitesini artırmak için kanser hücreleri ile karıştırıldı. İnatmembran matrisinin varlığı enjeksiyon bölgesinden karışım çözeltisi kaybını azaltır ve miksçözeltiyi implantasyon yerinde tutar, böylece implante edilen ksenogreft hacminin tekdüzeliğini artırır.
MDA-MB-231 hücre hattı kötü huylu ölümsüzleştirilmiş insan meme adenokarsinom hücre hattı ve üçlü negatif durumu nedeniyle meme kanseri araştırmalarında popüler bir araçtır. Çift muhabir (luciferase ve GFP) hücre hattı kullanımı in vivo ve ex vivo görüntüleme işleme daha fazla esneklik sağlar. Biyolüminesans sinyalinin GFP sinyallerinden daha fazla hassasiyet, derinlik algılanabilirliği ve üstün kontrasta (sinyal-gürültü oranı) sahip olduğu iyi bilinmektedir. Bu nedenle, tüm vücut görüntüleme için yaygın olarak kullanılan bir görüntüleme yöntemidir. Ne yazık ki, biyolüminesans algılama sinyal algılama doğrusal olduğu dar bir zaman penceresi (~ 15−20 dakika sonrası luciferin enjeksiyonu) ile sınırlıdır. BLI sinyali hayvanlar ötenazi yapıldığında hızla azalır. Birçok fare ötanazi ve birden fazla doku veya organ hasat gerekiyorsa bu deneysel bir tasarım sorunu haline gelir. Bu çalışmalarda doğrudan kalp delinmesi ile kan alındı, beyin, primer tümör, akciğer ve etkilenen lenf nodu 40 farede incelendi. Organlar hasat edilip ek vivo görüntülemeye hazır hale gelene kadar biyolüminesans sinyali tespit edilemiyordu. Bu nedenle, GFP algılama bu durumlarda daha uygundur. GFP sinyalinin salınımı görünür aralıktadır ve bu dalga boylarında kana bağlı sinyal emilimi (yani hemoglobin) önemli ölçüde daha yüksektir. Ayrıca, NADH, lipo-pigmentler ve flavins nedeniyle görünür aralıkta otofloresans, düşük seviyeli GFP sinyali ile otofloresan arka planı ayırt etmeyi zorlaştıran önemli bir arka planla sonuçlanır. Geleneksel filtre çifti görüntüleme yerine multispektral floresan görüntüleme yaklaşımı kullanmak ve spektral karıştırma algoritmaları kullanmak, ilgi alanında gerçek GFP sinyalini belirlemeye yardımcı olur. Bu nedenle, vivo algılama ve ex vivo organ / doku değerlendirmelerinde multispektral GFP görüntüleme tüm vücutta biyolüminesans görüntüleme güçlü birleştirerek, ölçülebilir veri farelerin büyük bir kohort en üst düzeye çıkarılabilir.
Bir hayvan çalışması için hangi yaklaşım seçilirse seçilsin, özellikle metastatik yükü hedefleyen çalışmalarda, organ/doku alımı öncesinde tüm kanın çıkarılması şiddetle tavsiye edilir. Bu protokol, ortotopik meme kanseri modelinde bulunan farelerden alınan tüm kan örneklerinden alınan GFP sinyallerini gerçek zamanlı PCR tahlilleri ile algılar. Organlarda/dokularda kan hacminin en aza indirilmesi hedef organlardaki yanlış pozitif sinyali azaltacaktır.
Sonuç olarak, MDA-MB-231-Luc/GFP hücrelerini kullanan ortotopik meme kanseri modeli, insan TNBC hasta durumunu yakından taklit eden son derece alakalı bir hayvan modelidir. Bu model, insana benzer bir tümör mikroortamında terapötik etkinliğin incelenmesi, izlenmesi ve değerlendirilmesi için gereklidir. Çift muhabir hücre hatlarının kullanımı daha bu ortotopik meme kanseri modelinin pratikliğini artırır.
Disclosures
Yazarların açıklayacak bir şeyi yok.
Acknowledgments
Yazarlar Ulusal Sağlık Enstitüleri, Ulusal Kanser Enstitüsü, Bethesda MD, Kanser ve İnflamasyon Programı intramural Araştırma Programı ve Frederick Ulusal Laboratuvarı - Küçük Hayvan Görüntüleme Programı tarafından destek kabul etmek istiyorum, Leidos Biyomedikal Araştırma, Inc, Frederick Maryland, ABD.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Bouins Solution | Sigma | HT10132-1L | Lung metastatic nodule staining |
| D-Luciferin, Potassium Salt | GoldBio | LUCK-1G | Luciferase substrate |
| DNAzol | ThermoFisher | 10503027 | DNA extraction Kit |
| Excel | Microsoft | Spreadsheet software | |
| homogenizer | Virtis | Cyclone Virtishear | For tissue homogenization |
| IVIS SPECTRUM scanner | Perkin Elmer | fluorescence and BLI imaging system | |
| Maestro GNIR-FLEX fluorescence scanner | Perkin Elmer | fluorescence imaging system | |
| MatriGel Matrix | Corning | 356234 | Store at -20C and keep old (4 C) when in use. |
| MDA-MB-231 / Luciferase-2A-GFP Stable Cell Line | GenTarget | SC044 | Dual Reporter human breast cancer cell line |
| Microscope | ThermoFisher | EVOS | histology image capture |
| Phosphate-Buffered Saline | ThermoFisher | 10010049 | rinse buffer |
| Primer3 | MIT | Primer Design | |
| Prism | GraphPad | Statistical Analysis Software | |
| Puromycin | ThermoFisher | A1113803 | Antibiotics |
| RPMI 1640 media | ThermoFisher | 61870127 | Culture media |
| SeniFAST SYBR Lo-ROX kit | Bioline | BIO-94020 | Fast Real-Time PCR Reagent |
| StepOne Plus Real-Time PCR system | ThermoFisher | Real-Time PCR machine |
References
- Abramson, V. G., Lehmann, B. D., Ballinger, T. J., Pietenpol, J. A. Subtyping of triple-negative breast cancer: implications for therapy. Cancer. 121, 8-16 (2015).
- Zhuang, X., Zhang, H., Hu, G. Cancer and Microenvironment Plasticity: Double-Edged Swords in Metastasis. Trends in Pharmacological Sciences. 40 (6), 419-429 (2019).
- Campbell, J. P., Merkel, A. R., Masood-Campbell, S. K., Elefteriou, F., Sterling, J. A. Models of bone metastasis. Journal of Visualized Experiments. (67), e4260 (2012).
- Saha, D., et al. In vivo bioluminescence imaging of tumor hypoxia dynamics of breast cancer brain metastasis in a mouse model. Journal of Visualized Experiments. (56), e3175 (2011).
- Goddard, E. T., Fischer, J., Schedin, P. A Portal Vein Injection Model to Study Liver Metastasis of Breast Cancer. Journal of Visualized Experiments. (118), e54903 (2016).
- Lim, E., et al. Monitoring tumor metastases and osteolytic lesions with bioluminescence and micro CT imaging. Journal of Visualized Experiments. (50), e2775 (2011).
- Bauerle, T., Komljenovic, D., Berger, M. R., Semmler, W. Multi-modal imaging of angiogenesis in a nude rat model of breast cancer bone metastasis using magnetic resonance imaging, volumetric computed tomography and ultrasound. Journal of Visualized Experiments. (66), e4178 (2012).
- Katsuta, E., Oshi, M., Rashid, O. M., Takabe, K. Generating a Murine Orthotopic Metastatic Breast Cancer Model and Performing Murine Radical Mastectomy. Journal of Visualized Experiments. (141), e57849 (2018).
- Rashid, O. M., et al. Is tail vein injection a relevant breast cancer lung metastasis model? Journal of Thoracic Disease. 5, 385-392 (2013).
- Bhambhani, V., Beri, R. S., Puliyel, J. M. Inadvertent overdosing of neonates as a result of the dead space of the syringe hub and needle. Archives of Disease in Childhood: Fetal and Neonatal Edition. 90, F444-F445 (2005).
- Zhang, G. L., Zhang, Y., Cao, K. X., Wang, X. M. Orthotopic Injection of Breast Cancer Cells into the Mice Mammary Fat Pad. Journal of Visualized Experiments. (143), e58604 (2019).
- Tavera-Mendoza, L. E., Brown, M. A less invasive method for orthotopic injection of breast cancer cells into the mouse mammary gland. Laboratory Animals. 51, 85-88 (2017).
- Paschall, A. V., Liu, K. An Orthotopic Mouse Model of Spontaneous Breast Cancer Metastasis. Journal of Visualized Experiments. (114), e54040 (2016).
- Kocaturk, B., Versteeg, H. H. Orthotopic injection of breast cancer cells into the mammary fat pad of mice to study tumor growth. Journal of Visualized Experiments. (96), e51967 (2015).
- Fletcher, S. J., et al. Human breast adipose tissue: characterization of factors that change during tumor progression in human breast cancer. Journal of Experimental and Clinical Cancer Research. 36, 26 (2017).
- Giuliano, A. E., et al. Axillary dissection vs no axillary dissection in women with invasive breast cancer and sentinel node metastasis: a randomized clinical trial. Journal of the American Medical Association. 305, 569-575 (2011).
- Rummel, S., Hueman, M. T., Costantino, N., Shriver, C. D., Ellsworth, R. E. Tumour location within the breast: Does tumour site have prognostic ability? Ecancermedicalscience. 9, 552 (2015).
- Kroman, N., Wohlfahrt, J., Mouridsen, H. T., Melbye, M. Influence of tumor location on breast cancer prognosis. International Journal of Cancer. 105, 542-545 (2003).
- Bao, J., Yu, K. D., Jiang, Y. Z., Shao, Z. M., Di, G. H. The effect of laterality and primary tumor site on cancer-specific mortality in breast cancer: a SEER population-based study. PLoS One. 9, e94815 (2014).
- Faustino-Rocha, A., et al. Estimation of rat mammary tumor volume using caliper and ultrasonography measurements. Lab Animal. 42, 217-224 (2013).
- Mullen, P. The use of Matrigel to facilitate the establishment of human cancer cell lines as xenografts. Methods in Molecular Medicine. 88, 287-292 (2004).
- Jensen, R. L., Leppla, D., Rokosz, N., Wurster, R. D. Matrigel augments xenograft transplantation of meningioma cells into athymic mice. Neurosurgery. 42, 130-136 (1998).
- Mullen, P., Langdon, S. P. The use of matrigel in the establishment of ovarian carcinoma cell lines as xenografts. Methods in Molecular Medicine. 39, 199-203 (2001).
- Fliedner, F. P., Hansen, A. E., Jorgensen, J. T., Kjaer, A. The use of matrigel has no influence on tumor development or PET imaging in FaDu human head and neck cancer xenografts. BMC Medical Imaging. 16, 5 (2016).
- Mullen, P., Ritchie, A., Langdon, S. P., Miller, W. R. Effect of Matrigel on the tumorigenicity of human breast and ovarian carcinoma cell lines. International Journal of Cancer. 67, 816-820 (1996).
- Zinn, K. R., et al. Noninvasive bioluminescence imaging in small animals. Journal of the Institute for Laboratory Animal Research. 49, 103-115 (2008).
- Troy, T., Jekic-Mullen, D., Sambucetti, L., Rice, B. Quantitative Comparison of the Sensitivity of Detection of Fluorescent and Bioluminescent Reproters in Animal Models. Molecular Imaging. 3 (1), 9-23 (2004).
