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Cancer Research

ऑर्थोटोपिक स्तन कैंसर मॉडल का उपयोग कर ट्रिपल नकारात्मक स्तन कैंसर का अध्ययन

Published: March 20, 2020 doi: 10.3791/60316
Automatic Translation
1, 2, 1, 1, 1, 2, 1, 1
1Molecular Mechanism Section, Cancer and Inflammation Program, Center for Cancer Research, National Cancer Institute at Frederick, 2Small Animal Imaging Program, Frederick National Laboratory for Cancer Research, Leidos Biomedical Research, Inc.

Summary

यह काम हरे फ्लोरोसेंट प्रोटीन और बायोल्यूमिनेसेंस संकेतों के साथ-साथ मात्रात्मक आणविक पहचान तकनीक के एकीकरण का पता लगाकर ट्यूमर लोडिंग का सही आकलन करने के लिए एक उन्नत प्रोटोकॉल को पूर्वनिर्धारित करता है।

Abstract

ट्रिपल-निगेटिव ब्रेस्ट कैंसर (टीएनबीसी) सीमित चिकित्सीय विकल्पों के साथ एक आक्रामक स्तन कैंसर उपप्रकार है। जब कम आक्रामक स्तन ट्यूमर के साथ रोगियों की तुलना में, टीएनबीसी रोगियों के 5 साल के जीवित रहने की दर ७७% उनकी विशेषता दवा प्रतिरोधी फेनोटाइप और मेटास्टैटिक बोझ के कारण है । इस छोर की ओर, murine मॉडल TNBC ट्यूमर विकास और मेटास्टैटिक प्रसार सीमित उपन्यास चिकित्सीय रणनीतियों की पहचान करने के उद्देश्य से स्थापित किया गया है । यह काम टीएनबीसी ऑर्थोटोपिक मॉडल के लिए एक व्यावहारिक गाइड का वर्णन करता है जहां एमडीए-एमबी-231 स्तन कैंसर कोशिकाओं को एक तहखाने झिल्ली मैट्रिक्स में निलंबित चौथे स्तन वसा पैड में प्रत्यारोपित किया जाता है, जो मनुष्यों में कैंसर सेल व्यवहार की बारीकी से नकल करता है। कैलिपर द्वारा ट्यूमर की माप, वीवो और पूर्व वीवो इमेजिंग के माध्यम से फेफड़ों के मेटास्टेसिस मूल्यांकन, और आणविक पता लगाने पर चर्चा की जाती है। यह मॉडल चिकित्सीय प्रभावकारिता का अध्ययन करने के लिए एक उत्कृष्ट मंच प्रदान करता है और प्राथमिक ट्यूमर और डिस्टल मेटास्टैटिक साइटों के बीच बातचीत के अध्ययन के लिए विशेष रूप से उपयुक्त है।

Introduction

संयुक्त राज्य अमेरिका में आठ महिलाओं में से लगभग एक अपने जीवनकाल के दौरान आक्रामक स्तन कैंसर का विकास होगा, और इन महिलाओं के 10%−20% आक्रामक ट्रिपल नकारात्मक स्तन कैंसर (TNBC) उपप्रकार के साथ का निदान किया जाएगा । जबकि प्राथमिक घावों को शल्य चिकित्सा से ज्यादातर मामलों में हटाया जा सकता है, उपनैदानिक माइक्रोमेटास्तासिस और कीमोरेजिस्टेंस इसे एक असभ्य बीमारी बनाते हैं। महत्वपूर्ण बात, मेटास्टैटिक टीएनबीसी के साथ ज्यादातर रोगियों को अंततः पतन, भले ही वे प्रारंभिक चरण1में इलाज से गुजरना पड़ा । इस प्रकार, कैंसर विषमता, माइक्रोमेटास्टेसिस, और चिकित्सीय प्रतिरोध तीन प्रमुख टीएनबीसी रोगियों के सफल नैदानिक परिणाम को सीमित चुनौतियां हैं । इसलिए, टीएनबीसी की बहुरूपी आणविक पृष्ठभूमि को बेहतर ढंग से समझने और मेटास्टैटिक रोग को सीमित करने वाले प्रभावी चिकित्सीय एजेंटों को विकसित करने की तत्काल आवश्यकता है।

ट्यूमर मेटास्टेसिस एक मल्टीस्टेप प्रक्रिया है जहां ट्यूमर सेल अपने सूक्ष्म वातावरण को नियंत्रित करता है और प्राथमिक घाव से झिल्ली क्षरण और ट्यूमर सेल भागने के माध्यम से अपने स्वयं के प्रसार को बढ़ावा देने के लिए, में प्रवेश के माध्यम से (यानी, इंट्रावेशन) और से बाहर निकलें (यानी, विलोम) vasculature, और अंततः अनुकूलन और डिस्टल ऊतक बेड के भीतरउपनिवेशीकरण 2। स्तन कैंसर मेटास्टेसिस का अध्ययन करने के लिए पशु मॉडल विकसित किए गए हैं, जहां दो पद्धतियों को आमतौर पर लागू किया जाता है: प्रत्यक्ष रक्त परिसंचरण इंजेक्शन और ऑर्थोटोपिक प्रत्यारोपण। प्रत्यक्ष रक्त परिसंचरण इंजेक्शन के लिए आमतौर पर नियोजित तरीकों में पूंछ नस इंजेक्शन शामिल है, जबकि प्रत्यक्ष हृदय इंजेक्शन3,प्रत्यक्ष मस्तिष्क इंजेक्शन4और प्रत्यक्ष जिगर इंजेक्शन5 सहित अन्य दृष्टिकोणों को भी नियोजित किया गया है। प्रत्यक्ष रक्त परिसंचरण इंजेक्शन को अक्सर कृत्रिम मेटाटैसिस मॉडल के रूप में जाना जाता है, जो त्वरित और आसान लेकिन कम शारीरिक रूप से सटीक होता है क्योंकि यह प्राथमिक घाव और इंट्रावेशन6,7,7,8से ट्यूमर से बचने को दरकिनार करता है। जब प्रत्यक्ष इंजेक्शन मॉडल की तुलना में, ऑर्थोटोपिक स्तन कैंसर मॉडल फेफड़ों जैसे दूरदराज के अंगों में पता लगाने योग्य मेटास्टैटिक घावों की घटना के लिए अधिक समय लेता है, लेकिन यह अधिक शारीरिक रूप से प्रासंगिक है क्योंकि यह मनुष्यों में होने वाली मल्टीस्टेप मेटास्टैटिक प्रक्रिया की बारीकी से नकल करता है। महत्वपूर्ण बात, एक २०१३ अध्ययन9 पूंछ नस इंजेक्शन और ऑर्थोटॉपिक मॉडल की तुलना में और पाया कि स्तन कैंसर की कोशिकाओं पूंछ नस में इंजेक्शन और फेफड़ों मेटास्टैटिक घावों से अलग उन पूंछ नस इंजेक्शन के बाद इसी तरह के वैश्विक जीन अभिव्यक्ति प्रोफाइल का प्रदर्शन किया । इसके विपरीत, ऑर्थोटोपरिक रूप से इंजेक्ट किए गए स्तन कैंसर कोशिकाओं की वैश्विक जीन अभिव्यक्ति प्रोफ़ाइल ऑर्थोटोटोपरी इंजेक्शन कोशिकाओं9से उत्पन्न होने वाले फेफड़ों के मेटास्टैटिक घावों की तुलना में नाटकीय रूप से अलग थी। इन टिप्पणियों से पता चलता है कि ऑर्थोटोपिक मॉडल अधिक शारीरिक रूप से प्रासंगिक है, क्योंकि मेटास्टैटिक घाव मेटास्टेसिस की मल्टीस्टेप प्रक्रिया के समान चयन प्रक्रिया से गुजरते हैं जैसा कि मनुष्यों में होता है।

यह काम नग्न चूहों में एक ऑर्थोटोपिक स्तन कैंसर (एमडीए-एमबी-231-ल्यूक/जीएफपी) मॉडल का वर्णन करता है जिसे इमेजिंग डिटेक्शन तकनीकों के लिए हमारी प्रयोगशाला में अनुकूलित किया गया था और साथ ही उपन्यास बायोमार्कर की पहचान और लक्षित कीमोथेरेपी एजेंटों के विकास का वर्णन किया गया था।

Protocol

राष्ट्रीय कैंसर संस्थान के पशु प्रयोगों की नैतिकता के लिए समिति द्वारा अनुमोदित प्रोटोकॉल का उपयोग करके ट्यूमर विकास का विश्लेषण किया गया था और संयुक्त राज्य अमेरिका राष्ट्रीय अनुसंधान परिषद की "देखभाल और उपयोग के लिए गाइड" की सिफारिशों का पालन किया गया था प्रयोगशाला पशु", संयुक्त राज्य अमेरिका सार्वजनिक स्वास्थ्य सेवा की "प्रयोगशाला जानवरों की देखभाल और उपयोग के लिए गाइड", और "मानवीय देखभाल और प्रयोगशाला जानवरों के उपयोग पर नीति"।

1. प्रत्यारोपण के लिए कोशिकाओं की तैयारी

नोट: एमडीए-एमबी-231 मानव स्तन एडेनोकार्सिनोमा कोशिकाओं (व्यावसायिक रूप से अधिग्रहीत) को लूसिफ़ेरेज जीन III और लेंटिवायरस द्वारा उन्नत हरे फ्लोरोसेंट प्रोटीन (जीएफपी) मार्कर से स्थिर रूप से ट्रांसकिया गया था और चयन एंटीबायोटिक (प्यूरोमाइसिन) की उपस्थिति में उगाया गया था .

  1. सेल कल्चर को 1 x 106 एमडीए-एमबी-231-ल्यूक/जीएफपी सेल के साथ शुरू करें और एक T75 कल्चर फ्लास्क में 10% भ्रूण गोजातीय सीरम (एफबीएस) के साथ 15 मिलील प्रीवार्म्ड (37 डिग्री सेल्सियस) आरपीएमआई 1640 मीडियम जोड़ें। 5% सीओ2के साथ तापमान नियंत्रित सेल कल्चर इनक्यूबेटर में बढ़ रही कोशिकाओं को 37 डिग्री सेल्सियस पर रखें। एक सप्ताह में कम से कम 2x पूरा माध्यम बदलें।
    नोट: सेल विकास को परेशान न करें और रोजाना सेल की बढ़ती स्थितियों की जांच करते रहें। प्रसार चरण को बनाए रखने के लिए 85%−90% की स्थिरता तक पहुंचने पर कोशिकाओं को उपसंस्कार करने की आवश्यकता होती है।
  2. सेल प्रत्यारोपण कदम से एक सप्ताह पहले, पहले संस्कृति फ्लास्क में सभी माध्यम को हटाने के द्वारा सेल संस्कृति फ्लास्क से puromycin हटा दें, तो 1x फॉस्फेट बफर्ड खारा (PBS) के 10 mL के साथ 2x rinsing, और अंत में पूरा माध्यम के साथ माध्यम की जगह प्यूरोमाइसिन के बिना। मीडियम-अडेंजिंग और रिलिंग स्टेप्स के दौरान सेल्स को डिस्टर्ब न करें। याद रखें कि सभी मध्यम पुनःपूर्ति चरणों के लिए अब से चयन एंटीबायोटिक दवाओं के साथ पूर्ण माध्यम का उपयोग न करें।
  3. प्रत्यारोपण के लिए कोशिकाओं को तैयार करने के दिन, ट्राइप्सिनाइजेशन से पहले सभी पूर्ण माध्यम को हटा दें ताकि ट्राइप्सिन को निष्क्रिय करने से बचा जा सके। कोशिकाओं को ट्राइप्सिन करने के लिए फ्लास्क में ट्राइप्सिन के 5 mL जोड़ें। कोशिकाओं की निगरानी करें और जांच करें कि वे संस्कृति फ्लास्क से अलग करते हैं।
  4. एक बार कोशिकाओं के बहुमत अलग, ट्रिप्सिन गतिविधि बेअसर करने के लिए पूरा माध्यम के 10 mL जोड़ें । इसके बाद, कोशिकाओं को गोली मारने के लिए ~ 150 x ग्राम पर 50 mL अपकेंद्री ट्यूब और अपकेंद्री में सेल निलंबन स्थानांतरित करें। केंद्रीकरण के बाद अधिनेत हटा दें और फिर कोशिकाओं को फिर से निलंबित करने और सेल गिनती के लिए तैयार करने के लिए 1x पीबीएस के 10 mL जोड़ें।
  5. कोशिकाओं को एक सेल काउंटर के साथ गिनें और सेल एकाग्रता को 20 x 106 कोशिकाओं/mL को ठंडे 1x पीबीएस में समायोजित करें जिसमें 25% बेसमेंट झिल्ली मैट्रिक्स होता है। प्रत्येक माउस के चौथे स्तन वसा पैड में 25% तहखाने झिल्ली मैट्रिक्स के साथ 0.1 mL 1x पीबीएस में 2 x 106 कोशिकाओं सुई। सेल प्रत्यारोपण के लिए अतिरिक्त सुई और सीरिंज लाओ और वृक्षारोपण से पहले बर्फ पर सेल-तहखाने-झिल्ली-मैट्रिक्स मिश्रण रखें।
    नोट: सिरिंज और सुई में मृत जगह है। सुई और सिरिंज लंबाई, प्रकार, और आकार की पसंद के आधार पर, 26 जी सुई में 0.5 के साथ एक कंद सिरिंज 70 μL मृत अंतरिक्ष10तक हो सकता है। मृत अंतरिक्ष और किसी अन्य आकस्मिक हानि की भरपाई के लिए 40%−50% अधिक सेल प्रत्यारोपण मिश्रण तैयार करें।

2. ऑर्थोटोपिक स्तन कैंसर मॉडल और ट्यूमर आकार माप

  1. सेल प्रत्यारोपण से पहले कम से कम 1 सप्ताह के लिए आवास सुविधा के लिए 6 सप्ताह पुरानी महिला थैलेसीमिक नग्न चूहों को आदत बनाने की अनुमति दें।
    नोट: एक ही उम्र चूहों का उपयोग करने से डेटा भिन्नता कम हो जाएगी।
  2. प्रत्येक दौर के लिए, 3−4 मिन के लिए 1 एल/मिन की प्रवाह दर पर फ़िल्टर (0.2 माइक्रोन) हवा के साथ 4% पर आइसोफ्लोरीन के साथ पांच चूहों को एनेस्थेटइज़ करें। माउस श्वसन दर और पैटर्न परिवर्तन पर ध्यान दें, और यह सुनिश्चित करने के लिए एक अंगूठी चुटकी का उपयोग करें कि चूहे उचित संज्ञाहरण के तहत हैं। एक बार जब वे आगे नहीं बढ़ रहे हैं, एक माउस को हटा दें और एक ही संज्ञाहरण के साथ अपनी नाक और मुंह पर एक नाक शंकु जगह है ।
  3. झाड़ू शराब के साथ छोड़ दिया4 मैममैरी ग्रंथि। ठीक चूहे दांत संदंश का उपयोग करना, 25 जी सुई डालने के लिए 4मैममैरी ग्रंथि को थोड़ा उठाएं। सुनिश्चित करें कि सुई बेवेल है और फिर यह सुनिश्चित करने के लिए प्लंजर को थोड़ा खींचें कि सुई किसी भी रक्त वाहिकाओं को नहीं मारती है। यदि सिरिंज में कोई रक्त प्रवेश नहीं करता है, तो धीरे-धीरे सेल-बेसमेंट-झिल्ली-मैट्रिक्स मिश्रण के 100 माइक्रोन को स्तन वसा पैड में इंजेक्ट करना जारी रखें।
    नोट: एक दौर, उठाया क्षेत्र त्वचा के नीचे दिखाई देगा।
  4. तहखाने झिल्ली मैट्रिक्स कठोर होने के लिए 10−15 एस प्रतीक्षा करें, फिर सुई को हटा दें। इंडक्शन चैंबर में शेष चूहों के साथ प्रक्रिया दोहराएं। सभी इस्तेमाल की गई सुई और सीरिंज को तेज बॉक्स में रखें।
  5. सभी चूहों के लिए एक ही स्तन ग्रंथि इंजेक्शन साइट का प्रयोग करें। इंजेक्शन साइट पर पैनी नजर रखें और इंजेक्शन साइट से लीक होने वाले किसी भी सेल इम्प्लांटेशन मिक्स पर ध्यान दें।
    नोट: कुछ ही मिनटों के भीतर, माउस चेतना हासिल करना शुरू कर देगा।
  6. किसी भी ट्यूमर आकार माप से पहले 7−10 दिनों के लिए बिना किसी रुकावट के ज़ेनोबेड़ा को स्वतंत्र रूप से बढ़ने की अनुमति दें।
  7. विद्वेष आकार के लिए सभी चूहों की जांच करें। एक कैलिपर के साथ ट्यूमर के आकार को मापें। निम्नलिखित समीकरण के साथ ट्यूमर की मात्रा (मिमी3)निर्धारित करें:



    जहां एल सबसे लंबा आयाम है और डब्ल्यू एल के लिए लंबवत सबसे छोटा आयाम है ।
  8. मतलब के एक मानक विचलन से अधिक आउटलर्स की पहचान करें और उन्हें हटा दें। केवल प्रयोगों के लिए तुलनीय ट्यूमर आकार वाले चूहों का उपयोग करें। चूहों को विभिन्न उपचार समूहों में बेतरतीब ढंग से विभाजित करें और उपचार शुरू करें।
  9. एक सप्ताह में कैलिपर 2x द्वारा ट्यूमर के आकार को मापें। ज़ेनोग्राफ्स (यानी, नेक्रोसिस, लेसेशन) के सभी भौतिक परिवर्तनों पर ध्यान रखें।

3. वीवो बायोल्यूमिनेसेंस और पूर्व वीवो फ्लोरेसेंस इमेजिंग में

नोट: इस अध्ययन में, दोनों दो आयामी बायोल्यूमिनेसेंस और फ्लोरेसेंस इमेजिंग प्रयोग के अंतिम बिंदु पर आयोजित किए जाते हैं। बायोल्यूमिनेसेंस इमेजिंग (BLI) एक वाणिज्यिक प्रीक्लीनिकल ऑप्टिकल स्कैनर एक 16 बिट ठंडा सीसीडी कैमरा और गर्म इमेजिंग चरण से लैस का उपयोग कर किया गया था ।

  1. इमेजिंग से पहले, इंडक्शन चैंबर में पांच ट्यूमर-असर चूहों को 3−4 मिन के लिए 1 एल/मिन की प्रवाह दर पर फ़िल्टर (0.2 माइक्रोन) हवा के साथ 3% पर आइसोफ्लोरीन स्थापित करके एनेस्थेटोइज़ करें। सुनिश्चित करें कि इंडक्शन चैंबर को आइसोफ्लोरीन के कर्मचारियों के जोखिम को कम करने के लिए एक निकाल हुड के अंदर रखा गया है।
  2. 27 जी सुई का उपयोग करके एक इंट्रापेरिटोनियल मार्ग द्वारा एनेस्थेटाइज्ड चूहों को डी-लूसिफ़ेरिन (150 मिलीग्राम/किलो) प्रशासन दें, और इमेजिंग कक्ष में एक एनेस्थेटाइज्ड माउस स्थानांतरित करें। स्कैनर इमेजिंग चैंबर में, 1 एल/मिन की प्रवाह दर के साथ एक वाहक के रूप में ओ2 के साथ 2%−2.5% पर आइसोफ्लोरीन को बनाए रखें।
    नोट: संज्ञाहरण प्रेरण कक्ष, इमेजिंग टेबल (यदि मंच गर्म नहीं है) के नीचे एक गर्म पैड रखकर प्रक्रिया के दौरान ~ 37 डिग्री सेल्सियस पर माउस के शरीर के तापमान को बनाए रखें, और पोस्टप्रोसीजर रिकवरी पिंजरे।
  3. अध्ययन चूहों इमेजिंग से पहले, निम्नलिखित मापदंडों का उपयोग करके कुल 40 मिन के अंतराल पर तीन अतिरिक्त ट्यूमर असर चूहों (किसी भी अध्ययन समूह ों को नहीं सौंपा गया जानवर) इमेजिंग करके लुसिफ़ेरिन काइनेटिक्स प्राप्त करें: फ़िल्टर-अवरुद्ध, उत्सर्जन फ़िल्टर-ओपन, एफ/स्टॉप 1, एफओवी-डी, मझोले बिनिंग (8 x 8), और ऑटो एक्सपोजर। बाद के सभी समय बिंदुओं के लिए इष्टतम छवि अधिग्रहण समय खिड़की को परिभाषित करने के लिए मापा गया पीक बायोल्यूमिनेसेंस सिग्नल का उपयोग करें।
  4. मेटास्टेसिस इमेजिंग करते समय, प्राथमिक ट्यूमर से उच्च BLI संकेत को काले दस्ताने से काटने वाली आस्तीन के साथ ढककर ढाल ें। फेफड़ों के मेटास्टेसिस इमेजिंग के लिए कैमरे का सामना कर रहे माउस के वेंट्रल पक्ष और मस्तिष्क मेटास्टेसिस इमेजिंग के लिए कैमरे का सामना कर रहे माउस के पृष्ठीय पक्ष के साथ चरण 3.3 में वर्णित एक ही मापदंडों का उपयोग करछवि प्राप्त करें।
    नोट: न्यूनतम ऑटो ल्यूमिनेसेंस के साथ एक लेने के लिए काले दस्ताने के कुछ अलग ब्रांडों का परीक्षण करना आवश्यक है।
  5. स्कैनर और डेटा विश्लेषण सॉफ्टवेयर का उपयोग करके, वक्ष गुहा या मस्तिष्क पर ब्याज के एक मानक आकार क्षेत्र (आरओआई) को आकर्षित करें ताकि यह सुनिश्चित किया जा सके कि मेटास्टैटिक बोझ का मूल्यांकन करने के लिए ब्याज का पूरा अंग कवर किया जाता है। कुल प्रवाह (फोटॉन/सेकंड) के रूप में बायोल्यूमिनेसेंस (बीएल) उत्पादन की मात्रा निर्धारित करें ।
  6. BLI के तुरंत बाद, सीओ2 asphyxiation के माध्यम से माउस इच्छामृत्यु (ACUC दिशा निर्देशों और संस्था को मंजूरी दे दी पशु प्रोटोकॉल के अनुसार) और फेफड़ों और मस्तिष्क को काटने कैंची और पूर्व वीवो इमेजिंग के लिए संदंश के साथ मस्तिष्क निकालें ।
    नोट: पूर्व वीवो इमेजिंग के लिए और फेफड़ों के मेटास्टेसिस नोड्यूल गिनती के लिए निकाले गए फेफड़ों को असंगत प्रक्रियाओं के कारण एक ही माउस पर नहीं किया जा सकता है।
  7. किसी भी सतही रक्तरंजित को हटाने और कम ऑटोफ्लोरेसेंस, काले प्लास्टिक प्लेट पर अंगों को रखने के लिए 1x पीबीएस के साथ सभी अंगों को जल्दी से कुल्ला करें। GFP डिटेक्शन के लिए 12-बिट सीसीडी कैमरे के साथ स्पेक्ट्रल अनमिक्सिंग क्षमता (ठोस-राज्य तरल क्रिस्टल तरंगदैर्ध्य ट्यूनिंग) से लैस एक बहुनिरीक्षण फ्लोरेसेंस स्कैनर के लिए अंगों का परिवहन करें।
  8. निकाले गए अंगों और गैर-ट्यूमर असर नियंत्रण चूहों के बहुस्पेक्ट्रल जीएफपी छवियों (उत्तेजना फिल्टर = 457 ± 23 एनएम; उत्सर्जन फिल्टर = 490 एनएम लांग पास) और 10 एनएम के एक कदम आकार में 500−720 एनएम के माध्यम से स्कैनिंग करके गैर ट्यूमर असर नियंत्रण चूहों का अधिग्रहण करें। ऑटोफ्लोरेसेंस के लिए सही करने के लिए गैर-ट्यूमर असर नियंत्रण चूहों से उत्पादित अंगों का उपयोग करें।
  9. मल्टीस्पेक्ट्रल जीएफपी इमेजिंग के बाद, इष्टतम इमेजिंग सेटिंग्स निर्धारित करें। निर्माता के प्रोटोकॉल के अनुसार सभी लक्षित अंगों और आचरण छवि विश्लेषण (यानी, स्पेक्ट्रल अनमिक्सिंग प्रक्रिया के लिए ऑटोफ्लोरेसेंस और जीएफपी के लिए एक स्पेक्ट्रल लाइब्रेरी उत्पन्न करें) का छवि अधिग्रहण करें।

4. मेटास्टैटिक स्तन कैंसर कोशिकाओं का आणविक पता लगाने

  1. पूर्व वीवो इमेजिंग के बाद, स्नैप पूरे मस्तिष्क को तरल नाइट्रोजन में फ्रीज कर देता है और डीएनए निष्कर्षण के लिए तैयार होने तक फ्रीजर में -80 डिग्री सेल्सियस पर स्टोर करता है।
  2. डीएनए निकालने के लिए पूरे दिमाग को डीएनए लिसिस बफर के 2 एमएल के साथ 5 लाख समरूपता वाली ट्यूब में डाल दें। स्नैप-फ्रोजन पूरे मस्तिष्क के ऊतकों को समरूप बनाने के लिए 50 पर पावर सेटिंग के साथ एक समरूपता का उपयोग करें। एक बार मस्तिष्क के ऊतकपूरी तरह से समरूप हो जाने के बाद, 1 एमएल निलंबन (lysate) को DNase-मुक्त और RNase-मुक्त 2 mL माइक्रोसेंटरिफ्यूज ट्यूब में स्थानांतरित करें और निर्माता के प्रोटोकॉल के अनुसार डीएनए को अलग करना जारी रखें।
    नोट: कैरीओवर डीएनए संदूषण को कम करने के लिए, प्रत्येक नमूने के बाद समरूपता को पहले DNase-मुक्त और RNase-मुक्त पानी में 75% इथेनॉल के साथ धोकर साफ करें, फिर 1 एम नाओएच समाधान के साथ रिंसिंग करें, इसके बाद DNase-मुक्त में 75% इथेनॉल के साथ कुल्ला करें और किसी भी डीएनए अवशेषको प्रभावी ढंग से कम करने और नष्ट करने के लिए RNase-मुक्त पानी।
  3. डीएनए लिसिस बफर के 100% इथेनॉल का 0.5 mL को lysate में जोड़ें। 3 न्यूनतम के लिए कमरे के तापमान पर उलटा और स्टोर द्वारा नमूना मिलाएं।
    नोट: कई बार या बहुत सख्ती से उलटा न करें। डीएनए ऊन जैसी तेज़ी के रूप में दिखाई देगा।
  4. डीएनए को ताजा DNase-मुक्त और RNase-मुक्त 2 ML माइक्रोसेंटरिफ्यूज ट्यूब पर स्थानांतरित करने के लिए एक पिपेट टिप का उपयोग करें। 1 मिन के लिए सैंपल एयर ड्राई होने दें डीएनए सैंपल को धोने के लिए माइक्रोसेन्ड्रिफ्यूज ट्यूब 3−6x को 1 mL 75% इथेनॉल डालें और उलटा करें। प्रत्येक धोने के बाद इथेनॉल को पाइपिंग द्वारा त्यागें। वॉश स्टेप 2x दोहराएं।
  5. हवा 10 एस के लिए डीएनए नमूना सूखी । इसके बाद डीएनए सैंपल को भंग करने के लिए 8 एमएम नाओएच के 52 माइक्रोन डालें। डीएनए क्वांटिटेशन के लिए डीएनए नमूने का पिपेट 2 माइक्रोन, और एकाग्रता समायोजन के बाद वास्तविक समय पीसीआर परख के लिए शेष 50 माइक्रोन का उपयोग करें।
    नोट: NaOH डीएनए नमूने को पूरी तरह से घुलनशील करने में मदद करता है।
  6. स्पेक्ट्रोफोटोमीटर के साथ प्रत्येक डीएनए नमूने का क्वांटिटेट 2 माइक्रोन और गुणवत्ता जांच संदर्भ के रूप में A260/280 के बीच एक अवशोषक अनुपात का उपयोग करें। इस सूत्र के साथ डीएनए एकाग्रता की गणना करें:

  7. डीएनए एकाग्रता को 50 एनजी/माइक्रोन में समायोजित करें। प्रत्येक डीएनए नमूने के लिए, एक वास्तविक समय पीसीआर परख के लिए शुरू टेम्पलेट के रूप में डीएनए के ५० एनजी का उपयोग करें । डीएनए नमूने को पतला करने के लिए 8 mM NaOH समाधान या DNase मुक्त और RNase मुक्त पानी का उपयोग करें।
  8. प्राइमर जोड़ी को एक्सोजेनस ग्रीन फ्लोरेसेंस प्रोटीन (जीएफपी) अनुक्रम इन-हाउस के लिए विशिष्ट डिजाइन करें, जो मेटास्टैटिक कोशिकाओं में जीएफपी टैग के वास्तविक समय पीसीआर डिटेक्शन के लिए एक ओपन सोर्स प्राइमर डिजाइन वेब पोर्टल का उपयोग करके परजीवी साइटों पर हमला और उपनिवेश किया गया।
    नोट: इस अध्ययन में एफ का उपयोग किया गया: 5'-AGAACGGCATCAAGGTGAAC-3', आर: 5'-TGCTCAGGGTTGTGTGTCG-3'।
  9. एक तेज रीयल-टाइम पीसीआर रिएजेंट और एक रियल टाइम पीसीआर मशीन का उपयोग करें जो तेजी से वास्तविक समय पीसीआर प्रोटोकॉल का समर्थन करती है। नियमित रूप से 30 चक्र प्रवर्धन चरणों के अलावा, किसी भी गैर विशिष्ट प्रवर्धन का पता लगाने के लिए रन के अंत में एक विसोशन वक्र कदम जोड़ें।
    नोट: आणविक पता लगाने के लिए निम्नलिखित स्थितियों का उपयोग किया गया: 95 डिग्री सेल्सियस 2 मिन गर्म शुरुआत, 95 डिग्री सेल्सियस 5 एस, 60 डिग्री सेल्सियस 15 एस के 40 चक्र, और अंत में एक पिघलने वाले वक्र विश्लेषण। जीएफपी एम्प्लीसन आकार में 135 बीपी है।
  10. एक भोली माउस मस्तिष्क डीएनए (नहीं एक एमडीए-एमबी-२३१ सेल प्रत्यारोपण) एक नकारात्मक नियंत्रण के रूप में प्रयोग करें । एमडीए-एमबी-231-जीएफपी/ल्यूक कोशिकाओं से निकाले गए डीएनए का सकारात्मक नियंत्रण के रूप में उपयोग करें। बिना किसी डीएनए टेम्पलेट (एनटीसी) के रूप में सभी पीसीआर एजेंटों को बिना किसी डीएनए टेम्पलेट के जोड़ें।
    नोट: प्रत्येक पीसीआर परख के लिए एक पीसीआर नियंत्रण की आवश्यकता होती है।

5. फेफड़ों में मेटास्टैटिक स्तन कैंसर सेल का पता लगाना

  1. मेटास्टैटिक फेफड़ों की नोड्यूल गिनती के लिए चुने गए चूहों उपसमूह के लिए, पूर्व वीवो इमेजिंग के तुरंत बाद आइसोफ्लोरीन (चरण 2.2 में) के साथ चूहों को एनेस्थेटाइज करें, रक्त संग्रह के लिए कार्डियक पंचर करेंक करें, और फिर सर्वाइकल अव्यवस्था से इच्छामृत्यु करें।
  2. कैंची विच्छेदन के साथ छाती गुहा खोलें और श्वासनली का पर्दाफाश करने के लिए दिल और थाइमस पिछले कटौती करें।
  3. ट्रेचिया में है Bouin समाधान युक्त एक 22 जी सुई के साथ एक 10 mL सिरिंज डालें । सिरिंज प्लंजर पुश जब तक ढह फेफड़ों है Bouin समाधान के ~ 2 mL के साथ सूजन हैं । फेफड़ों को फुलाने के बाद सिरिंज और सुई निकाल ें।
  4. पूरे फेफड़ों को 15 mL ट्यूब में रखें जिसमें बोइन का समाधान होता है, धीरे-धीरे ट्यूब को कई बार उलटना होता है, और कमरे के तापमान पर 24 घंटे के लिए भिगोने की अनुमति देता है।
  5. 24 घंटे के बाद, ट्यूब से बोइन के समाधान को हटा दें, फेफड़ों को पानी से कुल्ला एंकड करें, और फिर इसे 70% इथेनॉल के साथ ट्यूब में वापस रखें। विच्छेदन माइक्रोस्कोप का उपयोग करके फेफड़ों की सतहों पर मेटाटैसिस (सफेद पैच या नोड्यूल) गिनें।

6. डेटा संग्रह और विश्लेषण

  1. ट्यूमर वॉल्यूम डेटा रिकॉर्ड करें, साथ ही वीवो और पूर्व वीवो इमेजिंग डेटा में, आसान डेटा प्रविष्टि, संग्रह और प्रबंधन के लिए इलेक्ट्रॉनिक स्प्रेडशीट पर।
  2. प्रयोग के अंत में, डेटा प्लॉटिंग और सांख्यिकीय विश्लेषण के लिए इलेक्ट्रॉनिक स्प्रेडशीट और सांख्यिकीय सॉफ्टवेयर में सभी डेटा स्थानांतरित करें।

Representative Results

कैलिपर द्वारा ट्यूमर की मात्रा माप उपचार प्रभावकारिता(चित्रा 1)का आकलन करने के लिए एक अच्छी तरह से स्थापित विधि है। प्रत्यारोपित कोशिकाओं की संख्या, तहखाने झिल्ली मैट्रिक्स, माइक्रोबायोम, सुविधा स्वच्छता, और इंजेक्शन साइट का उपयोग ट्यूमर विकास दर को प्रभावित करने वाले प्रमुख कारक हैं।

जीएफपी इमेजिंग के विपरीत, BLI को BLI इमेजिंग से पहले कम से कम 15−20 min को कम से कम ल्यूसिफ़ेरेस सब्सट्रेट के प्रशासन की आवश्यकता थी। इसके अलावा, माउस तनाव, सेल लाइन, उपचार, और लूसिफ़ेरेरिपोर्टर सभी बायोल्यूमिनेसेंस सिग्नल स्तर को प्रभावित करते हैं। इस प्रकार, अध्ययन समूहों के बीच तुलनीय संकेतप्राप्त करने के लिए, सबसे अच्छा इमेजिंग समय सीमा(चित्रा 2)निर्धारित करने के लिए एक पूर्व इमेजिंग BLI गतिज अध्ययन किया जाना चाहिए।

बेहतर सिग्नल-टू-बैकग्राउंड रेशियो26,27के कारण वीवो बायोल्यूमिनेसेंस इमेजिंग में पूरा शरीर जीएफपी अप्रोच(चित्रा 3)की तुलना में निम्न स्तर के मेटास्टेसिस सिग्नल का पता लगाने में काफी संवेदनशील था । इसके अलावा, बायोल्यूमिनेसेंस सिग्नल ने कुछ मिलीमीटर तक जीएफपी की तुलना में गहरी पैठ प्रदान की। हालांकि, बायोल्यूमिनेसेंस सिग्नल उत्पादन के लिए एटीपी की आवश्यकता होती है, जो पूर्व वीवो ऊतक नमूनों के मूल्यांकन में एक सीमित कारक है। यदि जानवरों को जल्दी से संसाधित किया जाता है, तो BLI मेटाटैसिस पर मात्रात्मक परिणाम प्राप्त करने के लिए एक व्यवहार्य दृष्टिकोण हो सकता है। इस लक्ष्य को प्राप्त करने का एक तरीका एक समय में एक जानवर को संसाधित करना है। हालांकि, इस अध्ययन के लिए यह दृष्टिकोण व्यवहार्य नहीं था क्योंकि चूहों की एक बड़ी पलटन का उपयोग किया गया था। BLI संकेत का पता नहीं चला जब अंगों ४५ मिन पोस्ट लूसिफ़ेरिन इंजेक्शन के आसपास चित्रित किया गया । इस स्थिति में ड्यूल रिपोर्टर सेल लाइन का इस्तेमाल उपयोगी होता है। GFP अणु की स्थिर प्रकृति के कारण, शोधकर्ताओं को लक्ष्य अंगों(चित्रा 4)से GFP संकेतों पर कब्जा करने से पहले शव को संसाधित करने के लिए पर्याप्त समय होगा ।

चित्रा 5 कैसे कैलिपर ट्यूमर आकार माप डेटा व्याख्या विकृत सकता है की एक वास्तविक जीवन उदाहरण प्रदान करता है, क्योंकि विद्वेष व्यवहार्य ट्यूमर सेल सामग्री के सबसे खो दिया है लेकिन अभी भी अपने बड़े द्रव्यमान और आकार बनाए रखा । उन विद्वेष की हिस्टोपैथोलॉजिकल परीक्षा ने द्रव्यमान के अंदर परिगलन का संकेत दिया(चित्रा 5बी)।

शोधकर्ताओं के लिए जो ऑर्थोटोपिक स्तन कैंसर मॉडल में मस्तिष्क मेटास्टेसिस के बारे में इमेजिंग परिणामों को चुनौती देते हैं, वास्तविक समय पीसीआर द्वारा आणविक पता लगाने ठोस सबूत प्रदान कर सकते हैं(चित्रा 6)। इस मामले में, एक्सोजेनस जीएफपी डीएनए अनुक्रम इस समस्या को दूर करने का सबसे अच्छा तरीका था, क्योंकि ट्रांससंक्रमित जीएफपी डीएनए अनुक्रम स्वाभाविक रूप से मनुष्यों या कृंतक में मौजूद नहीं है।

Figure 1
चित्रा 1: ट्यूमर मात्रा माप। ट्यूमर की मात्रा/एक कैलिपर के साथ माप लोड करने के लिए 10 दिन पर शुरू विद्वेष प्रत्यारोपण के बाद और फिर 2x एक सप्ताह प्रयोग के अंत तक मापा गया था । त्रुटि सलाखों की गणना एसईएम मूल्य द्वारा की जाती है। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।

Figure 2
चित्रा 2: इष्टतम छवि अधिग्रहण खिड़की का निर्धारण। बाएं: एक बड़े विद्वेष के साथ एक माउस और एक छोटे से विद्वेष के साथ एक माउस इष्टतम ल्यूसिफ़ेरिन गतिज रेंज निर्धारण के लिए चुना गया था। सही: लूसिफ़ेरिन गतिज वक्र 40 मिन के लिए हर 2 मिन छवियों को प्राप्त करके प्राप्त की। 15−22 मिन के बीच एक पठार मनाया गया था, जिसे बाद के सभी इमेजिंग के लिए इष्टतम छवि अधिग्रहण समय के रूप में इस्तेमाल किया गया था। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।

Figure 3
चित्रा 3: पूरे शरीर BLI इमेजिंग । एल: पूरे शरीर BLI इमेजिंग । एम: एक काले दस्ताने की आस्तीन के साथ कवर निचले शरीर के साथ वेंट्रल दृश्य। आर: एक काले दस्ताने की आस्तीन के साथ कवर निचले शरीर के साथ पृष्ठीय दृश्य । ब्लिम इमेजिंग द्वारा वेंट्रल व्यू में एक एक्सिलरी लिम्फ नोड मेटास्तासिस का पता लगाया जाता है। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।

Figure 4
चित्रा 4: पूर्व वीवो BLI/GFP सिग्नल डिटेक्शन । माउस की बलि देने के बाद इसी माउस 20 मिन से दिमाग और फेफड़ों में जीएफपी सिग्नल का पता चला। BLI सिग्नल का पता नहीं चला 45 मिन पोस्ट लूसिफ़ेरिन इंजेक्शन। भोली माउस मस्तिष्क और फेफड़ों में कोई GFP संकेत का पता चला था। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।

Figure 5
चित्रा 5: कैलिपर माप पर ऑप्टिकल इमेजिंग तकनीकों के फायदे। (A)एक प्राथमिक ट्यूमर में वीवो जीएफपी सिग्नल डिटेक्शन में दिखाई देने वाले प्रतिनिधि छवि। केवल विद्वेष के एक छोटे से हिस्से ने जीएफपी सिग्नल दिखाया, जिसमें सुझाव दिया गया था कि द्रव्यमान का एक महत्वपूर्ण हिस्सा स्ट्रोमा था। यह पारंपरिक कैलिपर माप द्वारा निर्धारित नहीं किया जा सकता है और एक गलत निष्कर्ष के लिए नेतृत्व कर सकते हैं । यह उदाहरण पशु मॉडल अध्ययन के लिए ऑप्टिकल इमेजिंग के महत्व पर प्रकाश डालता है। (ख)इसी माउस के हिस्टोपैथोलॉजी सेक्शन में दिखाया गया है कि परिगलित क्षेत्र (यानी, आंतरिक क्षेत्र) ने भी ट्यूमर आकार गणना में योगदान दिया। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।

Figure 6
चित्रा 6: पिघलने वक्र विश्लेषण । पिघल वक्र भूखंड GFP एम्प्लिक्स की विशिष्टता दिखा रहा है। एमडीए-एमबी-231-ल्यूक/जीएफपी प्रत्यारोपित चूहों से प्राप्त मस्तिष्क से डीएनए और संस्कृति में उगाए गए एमडीए-एमबी-231-ल्यूक/जीएफपी कोशिकाओं से अलग डीएनए को परख दिया गया । मस्तिष्क के ऊतकों में जीएफपी सामग्री का आकलन करने के लिए वास्तविक समय पीसीआर परख का प्रदर्शन किया गया था। (ए, बी) सकारात्मक नियंत्रण के पिघलने घटता है और डीएनए माउस मस्तिष्क से निकाला, क्रमशः । (ग)पैनलों ए और बी के छा-लक घटता, माउस मस्तिष्क DNAs से चोटी संकेतों का संकेत एक्सोजेनेस जीएफपी अनुक्रम के लिए विशिष्ट हैं । कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।

Discussion

जानवरों में टीएनबीसी के अध्ययन के लिए, दो मूत्र मॉडल विकसित किए गए हैं: एमडीए-एमबी-231 मानव स्तन एडेनोकार्सिनोमा कोशिकाएं प्रतिरक्षा से समझौता चूहों (यानी एथिमिक न्यूड चूहों, एनएसजी चूहों) में और प्रतिरक्षा-सक्षम बीएबी/सी चूहों में 4T1। दोनों मॉडलों के अपने फायदे हैं। एक अध्ययन के लिए पशु मॉडल का चुनाव अनुसंधान लक्ष्यों पर निर्भर करता है। उदाहरण के लिए, एमडीए-एमबी-231 मॉडल इम्यूनोसमझौता चूहों में उगाई जाने वाली एक मानव टीएनबीसी सेल लाइन है जो इम्यूनोप्रेस्ड मानव स्तन कैंसर के रोगियों की नकल करती है। दूसरी ओर, बाल्ब/सी चूहों में ऑर्थोटोपिक 4T1 ट्रिपल-निगेटिव मोनीमूत्र स्तन कैंसर कोशिकाओं का आक्रामक फेनोटाइप मेटास्टैटिक प्रक्रिया की बारीकी से नकल करता है क्योंकि यह चरण चतुर्थ मानव स्तन कैंसर के रोगियों में होता है । नसों में सेल इंजेक्शन दृष्टिकोण के विपरीत, मानव एमडीए-एमबी-231 स्तन कैंसर कोशिकाओं को इसी तरह मैममैरी फैट पैड11,,12 में ऑर्थोटोपिक स्तन कैंसर मॉडल11,,13में इंजेक्ट किया गया था। लंबे समय तक ट्यूमर की वृद्धि और अर्जित मेटास्टैटिक क्षमता अधिक शारीरिक रूप से प्रासंगिक है, इस प्रकार यह एक कृत्रिम मेटास्टैटिक कैंसर मॉडल4,,14नहीं है। इस तरह के एक सहज मेटाटैसिस मॉडल बारीकी से दीक्षा चरण के अलावा मानव स्तन कैंसर के विकास की नकल करता है । यह मेटास्टैटिक स्तन कैंसर में वीवो ड्रग स्क्रीनिंग और चिकित्सीय प्रभावकारिता मूल्यांकन में एक महत्वपूर्ण मॉडल है।

माउस में ट्यूमर प्रत्यारोपण साइट एक माइक्रोएनवायरमेंट प्रदान करने में एक महत्वपूर्ण भूमिका निभाती है जो ट्यूमर के विकास को बनाए रखती है और मनुष्यों में होने वाले मेटास्टैटिक फेनोटाइप के चयन के समान है। समीपस्थ लिम्फ नोड और एडीपोस ऊतक की उपस्थिति स्तन कैंसर15,16की रोग प्रगति को प्रभावित करने वाले प्रमुख कारक हैं । एक मानव रोगी में, लिम्फ नोड और एडीपोज ऊतक दोनों प्रमुख बातचीत कारक हैं जो स्तन कैंसर17,,18,,19की द्रोह और घटनाओं को प्रभावित करते हैं। इस प्रकार, इंजेक्शन साइट के लिए सही शारीरिक स्थान का चयन मानव रोग की तुलना में ट्यूमर मॉडल की प्रासंगिकता को अत्यधिक प्रभावित कर सकता है। इस अध्ययन में मुख्य रूप से उपर्युक्त आवश्यकताओं के कारण प्रत्यारोपण साइट के रूप में चौथी स्तन ग्रंथि का उपयोग किया गया और यह शारीरिक रूप से अधिक सुलभ और हेरफेर करने में आसान है।

विभिन्न ट्यूमर मात्रा गणना विधियों उपलब्ध हैं, और एक शोधकर्ता किसी भी वे फिट देख चुन सकते हैं । इस अध्ययन के लिए चयनित एल्गोरिदम Faustino-Rocha एट अल, जो अलग ट्यूमर मात्रा गणना फार्मूले की तुलना में निष्कर्षों पर आधारित है और निष्कर्ष निकाला है कि नीचे फार्मूला सबसे सटीक20है ।

बेसमेंट झिल्ली मैट्रिक्स एक महत्वपूर्ण बाह्य मैट्रिक्स विभिन्न इन विट्रो21 में और वीवो22,,23 परख में उपयोग किया जाता है। ज़ेनोबेड़ा द्रोह पर तहखाने झिल्ली मैट्रिक्स के प्रभाव के बारे में22,,24,,25 विरोधाभासी रिपोर्टें हैं। ऐसा लगता है कि यह केवल विद्वेष की प्रारंभिक स्थापना को प्रभावित करता है और25के विद्वेष विकास पर आगे कोई प्रभाव नहीं पड़ता है । वर्णित विद्वेष प्रत्यारोपण के लिए, तहखाने झिल्ली मैट्रिक्स कैंसर की कोशिकाओं के साथ मिलाया गया था सेल/जेल मिश्रण समाधान चिपचिपाहट बढ़ाने के लिए प्रत्यारोपण से पहले । तहखाने झिल्ली मैट्रिक्स की उपस्थिति इंजेक्शन साइट से मिश्रण समाधान के नुकसान को कम कर देती है और प्रत्यारोपण साइट पर मिश्रण समाधान रखता है, इस प्रकार प्रत्यारोपित विद्वेष की मात्रा की एकरूपता को बढ़ाता है।

एमडीए-एमबी-231 सेल लाइन एक घातक अमर मानव स्तन adenocarcinoma सेल लाइन है और अपनी ट्रिपल नकारात्मक स्थिति की वजह से स्तन कैंसर अनुसंधान में एक लोकप्रिय उपकरण है। दोहरी रिपोर्टर्स (लूसिफ़ेरेज़ और जीएफपी) सेल लाइन का उपयोग वीवो और पूर्व वीवो इमेजिंग में हैंडलिंग में अधिक लचीलापन की अनुमति देता है। यह अच्छी तरह से स्थापित है कि बायोल्यूमिनेसेंस सिग्नल में जीएफपी संकेतों की तुलना में अधिक संवेदनशीलता, गहराई से पता लगाने की क्षमता और बेहतर विपरीत (सिग्नल-टू-शोर अनुपात) है। इस वजह से, यह पूरे शरीर इमेजिंग के लिए एक व्यापक रूप से इस्तेमाल इमेजिंग तौर-तरीके है। दुर्भाग्य से, बायोल्यूमिनेसेंस डिटेक्शन एक संकीर्ण समय खिड़की (~ 15−20 मिनट पोस्ट लूसिफ़ेरिन इंजेक्शन) द्वारा सीमित है जिसके दौरान सिग्नल डिटेक्शन रैखिक है। BLI संकेत तेजी से घटता है जब जानवरों इच्छामृत्यु कर रहे हैं । यह एक प्रयोगात्मक डिजाइन मुद्दा बन जाता है यदि कई चूहों को इच्छामृत्यु और कई ऊतकों या अंगों की कटाई की आवश्यकता होती है। इन अध्ययनों में, रक्त प्रत्यक्ष दिल पंचर, मस्तिष्क, प्राथमिक ट्यूमर, फेफड़े, और प्रभावित लिम्फ नोड द्वारा काटा गया था ४० चूहों में जांच की गई । जब तक अंगों को काटा गया और पूर्व वीवो इमेजिंग के लिए तैयार किया गया, बायोल्यूमिनेसेंस सिग्नल अज्ञेय था। इसलिए, इन स्थितियों में जीएफपी का पता लगाना अधिक उपयुक्त है। जीएफपी सिग्नल का उत्सर्जन दृश्यमान रेंज में है, और इन तरंगदैर्ध्य में, रक्त (यानी हीमोग्लोबिन) के कारण सिग्नल अवशोषण काफी अधिक है। इसके अलावा, NADH, लिपो-पिगमेंट और फ्लेविन के कारण दिखाई देने वाली सीमा में ऑटोफ्लोरेसेंस एक महत्वपूर्ण पृष्ठभूमि में परिणाम देता है जो निम्न स्तर के जीएफपी सिग्नल और ऑटोफ्लोरेसेंस पृष्ठभूमि के बीच अंतर करना मुश्किल बनाता है। पारंपरिक फिल्टर-जोड़ी इमेजिंग के बजाय एक बहुस्पेक्ट्रल फ्लोरेसेंस इमेजिंग दृष्टिकोण को नियोजित करना और स्पेक्ट्रल अनमिक्सिंग एल्गोरिदम का उपयोग करने से ब्याज के अंग में सच्चे जीएफपी सिग्नल की पहचान करने में मदद मिलती है। इसलिए, पूर्व वीवो अंग/ऊतक मूल्यांकनों में वीवो डिटेक्शन और मल्टीस्पेक्ट्रल जीएफपी इमेजिंग में पूरे शरीर में बायोल्यूमिनेसेंस इमेजिंग की ताकत के संयोजन से, चूहों की एक बड़ी पलटन में मात्रात्मक डेटा को अधिकतम किया जा सकता है ।

कोई फर्क नहीं पड़ता कि पशु अध्ययन के लिए किस दृष्टिकोण का चयन किया जाता है, अंग/ऊतक पुनर्प्राप्ति से पहले सभी रक्त निकालने की अत्यधिक सिफारिश की जाती है, विशेष रूप से मेटास्टैटिक बोझ को लक्षित करने वाले अध्ययनों के लिए । यह प्रोटोकॉल वास्तविक समय पीसीआर assays द्वारा ऑर्थोटोपिक स्तन कैंसर मॉडल में चूहों (नहीं दिखाए गए डेटा) से प्राप्त पूरे रक्त नमूनों से GFP संकेतों का पता लगाता है। अंगों/ऊतकों में रक्त की मात्रा को कम करने से लक्षित अंगों में झूठे सकारात्मक संकेत कम हो जाएंगे ।

निष्कर्ष में, एमडीए-एमबी-२३१-ल्यूक/जीएफपी कोशिकाओं का उपयोग करके ऑर्थोटोपिक स्तन कैंसर मॉडल एक अत्यधिक प्रासंगिक पशु मॉडल है जो मानव टीएनबीसी रोगी की स्थिति की बारीकी से नकल करता है । यह मॉडल मनुष्यों के समान ट्यूमर माइक्रोएनवायरमेंट में चिकित्सीय प्रभावकारिता का अध्ययन, निगरानी और आकलन करने के लिए आवश्यक है। ड्यूल रिपोर्टर सेल लाइनों का इस्तेमाल इस ऑर्थोटोपिक ब्रेस्ट कैंसर मॉडल की व्यावहारिकता को और बढ़ाता है।

Disclosures

लेखकों के पास खुलासा करने के लिए कुछ नहीं है ।

Acknowledgments

लेखक राष्ट्रीय स्वास्थ्य संस्थानों, राष्ट्रीय कैंसर संस्थान, बेथेस्डा एमडी, कैंसर और सूजन कार्यक्रम, और फ्रेडरिक नेशनल लेबोरेटरी - छोटे पशु इमेजिंग कार्यक्रम के इंट्राम्यूरल रिसर्च प्रोग्राम द्वारा समर्थन स्वीकार करना चाहते हैं, लीडोस बायोमेडिकल रिसर्च, इंक, फ्रेडरिक मैरीलैंड, यूएसए।

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Bouins Solution Sigma HT10132-1L Lung metastatic nodule staining
D-Luciferin, Potassium Salt GoldBio LUCK-1G Luciferase substrate
DNAzol ThermoFisher 10503027 DNA extraction Kit
Excel Microsoft Spreadsheet software
homogenizer Virtis Cyclone Virtishear For tissue homogenization
IVIS SPECTRUM scanner Perkin Elmer fluorescence and BLI imaging system
Maestro GNIR-FLEX fluorescence scanner Perkin Elmer fluorescence imaging system
MatriGel Matrix Corning 356234 Store at -20C and keep old (4 C) when in use.
MDA-MB-231 / Luciferase-2A-GFP Stable Cell Line GenTarget SC044 Dual Reporter human breast cancer cell line
Microscope ThermoFisher EVOS histology image capture
Phosphate-Buffered Saline ThermoFisher 10010049 rinse buffer
Primer3 MIT Primer Design
Prism GraphPad Statistical Analysis Software
Puromycin ThermoFisher A1113803 Antibiotics
RPMI 1640 media ThermoFisher 61870127 Culture media
SeniFAST SYBR Lo-ROX kit Bioline BIO-94020 Fast Real-Time PCR Reagent
StepOne Plus Real-Time PCR system ThermoFisher Real-Time PCR machine

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References

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कैंसर रिसर्च इश्यू 157 एमडीए-एमबी-231 ऑर्थोटोपिक मेटास्टेसिस ब्रेस्ट कैंसर टीएनबीसी
ऑर्थोटोपिक स्तन कैंसर मॉडल का उपयोग कर ट्रिपल नकारात्मक स्तन कैंसर का अध्ययन
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