Summary

Détermination de la production, de la cristallisation et de la structure du domaine iKK-contraignant de NEMO

Published: December 28, 2019
doi:

Summary

Nous décrivons des protocoles pour la détermination de structure du domaine IKK-contraignant de NEMO par la cristallographie de rayon X. Les méthodes incluent l’expression, la purification et la caractérisation des protéines ainsi que des stratégies pour une optimisation réussie des cristaux et la détermination de la structure de la protéine sous sa forme non liée.

Abstract

NEMO est une protéine d’échafaudage qui joue un rôle essentiel dans la voie NF-B en assemblant le complexe IKK avec les kinases IKKet et IKK. Lors de l’activation, le complexe IKK phosphorylate les molécules i-B conduisant à la translocation nucléaire NF-B et à l’activation des gènes cibles. L’inhibition de l’interaction NEMO/IKK est un paradigme thérapeutique attrayant pour la modulation de l’activité de la voie NF-B, faisant de NEMO une cible pour la conception et la découverte d’inhibiteurs. Pour faciliter le processus de découverte et d’optimisation des inhibiteurs NEMO, nous avons conçu une construction améliorée du domaine IKK-contraignant de NEMO qui permettrait la détermination de la structure de la protéine sous forme d’apo et tout en se liant à de petits inhibiteurs du poids moléculaire. Ici, nous présentons la stratégie utilisée pour la conception, l’expression et la caractérisation structurelle du domaine IKK-contraignant de NEMO. La protéine est exprimée dans les cellules E. coli, solubilisée dans des conditions dénaturantes et purifiée par trois étapes chromatographiques. Nous discutons des protocoles pour l’obtention de cristaux pour la détermination de la structure et décrions les stratégies d’acquisition et d’analyse des données. Les protocoles trouveront une large applicabilité à la détermination de la structure des complexes de NEMO et des inhibiteurs de petites molécules.

Introduction

La voie NF-B est activée en réponse à une variété de stimuli, y compris les cytokines, les produits microbiens et le stress, pour réguler l’expression des gènes cibles responsables de la réponse inflammatoire et immunitaire, la mort cellulaire ou la survie et la prolifération1. Les pathologies, y compris les maladies inflammatoires et auto-immunes et le cancer2,3,4,5 ont été corrélées à l’hyperactivation de la voie, qui a fait de la modulation de l’activité NF-B une cible de choix pour le développement de nouvelles thérapies6,7.

La voie canonique NF-B en particulier se distingue de la voie non canonique, responsable de la lymphorganogenèse et de l’activation des cellules B, par la dépendance de l’ancien à la protéine d’échafaudage NEMO (modulateur essentiel NF-B8) pour l’assemblage du complexe IKK avec les kinases IKKet et IKK. Le complexe IKK est responsable de la phosphorylation de l’IB (inhibiteur de l’IB) qui le cible pour la dégradation, libérant les dieux NF-B pour se translocaliser au noyau pour la transcription génique1 et est donc une cible attrayante pour le développement d’inhibiteurs pour moduler l’activité NF-B.

Notre recherche se concentre sur la caractérisation de l’interaction protéine-protéine entre NEMO et IKKMD, ciblant NEMO pour le développement de petites molécules inhibitrices de la formation complexe IKK. Le domaine de liaison minimal de NEMO, requis pour lier IKKMD, englobe les résidus 44-111, et sa structure a été déterminée en complexe avec un peptide correspondant à la séquence IKKMD 701-7459. NEMO et IKKMD forment un faisceau de quatre hélices où le dimère NEMO accueille les deux helices d’IKKMD(701-745) dans une rainure ouverte allongée avec une interface d’interaction étendue. IKK(734-742), également connu sous le nom de domaine neMO-contraignant (NBD), définit le point chaud le plus important pour la liaison, où les deux tryptophanes essentiels (739 741) enterrent profondément dans la poche NEMO. Les détails de la structure complexe peuvent aider à la conception et à l’optimisation de la structure des inhibiteurs de petites molécules ciblant NEMO. Dans le même temps, il est difficile que la liaison d’une petite molécule ou d’un peptide recrée dans NEMO le changement conformationnel complet (c.-à-d., ouverture étendue du dimère enroulé-enroulé NEMO) causé par la liaison du long IKKMD(701-745), comme on l’observe dans le cristal, et la structure de NEMO ou NEMO non lié à un inhibiteur de petite molécule peut représenter une meilleure cible pour la conception et l’inhibition de la conception et de l’inhibition des médicaments basés sur la structure.

La pleine longueur NEMO et les constructions de truncation plus petites englobant le domaine IKK-contraignant se sont avérées insolubles pour la détermination de structure dans la forme non liée par l’intermédiaire de la cristallographie de rayon X et des méthodes de résonance magnétique nucléaire (NMR)10,qui nous a incités à concevoir une version améliorée du domaine IKK-contraignant de NEMO. En effet, NEMO (44-111) sous la forme non liée n’est que partiellement plié et subit un échange conformationnel et nous nous sommes donc mis à stabiliser sa structure dimérique, pli de bobine enroulée et la stabilité, tout en préservant l’affinité de liaison pour IKK. En émettant trois heptades de séquences idéales de bobines sombres11 au n et C-termini de la protéine, et une série de mutations à quatre points, nous avons généré NEMO-EEAA, une construction entièrement dimérique et pliée dans une bobine enroulée, qui a sauvé l’affinité IKK-liaison à la gamme nanomolar comme observé pour la pleine longueur NEMO12. Comme avantage supplémentaire, nous espérions que les adaptateurs enroulés (basés sur la séquence GCN4) faciliteraient la cristallisation et, éventuellement, faciliteraient la détermination de la structure des rayons X par le remplacement moléculaire. Les adaptateurs enroulés ont été utilisés de la même façon pour augmenter la stabilité, améliorer le comportement de la solution et faciliter la cristallisation des bobines et des fragments d’anticorps trimmériques13,14. NEMO-EEAA est facilement exprimé et purifié à partir des cellules Escherichia. coli avec une étiquette cléavable Histidine, est soluble, plié dans une bobine faible stable enroulée et est facilement cristallisé, avec une diffraction à 1,9 . La présence des régions à bobines commandées de GCN4 pourrait en outre aider à l’apaisement des données des cristaux de NEMO-EEAA par remplacement moléculaire en utilisant la structure connue de GCN415.

Compte tenu des résultats obtenus avec apo-NEMO-EEAA, nous croyons que les protocoles décrits ici pourraient également être appliqués à la cristallisation de NEMO-EEAA en présence de petits peptides (comme le peptide NBD) ou d’inhibiteurs de petites molécules, dans le but de comprendre les exigences pour l’inhibition de NEMO et l’optimisation basée sur la structure des inhibiteurs initiaux de plomb à une affinité élevée. Étant donné la plasticité et la nature dynamique de nombreux domaines enroulés16, l’utilisation des adaptateurs enroulés pourrait trouver une applicabilité plus générale pour faciliter la détermination structurelle.

Protocol

1. Conception de la construction pour la cristallographie Clonez la séquence de NEMO-EEAA comme dans la publication précédente12 dans un vecteur d’expression chez E. coli en utilisant le promoteur T7, y compris une étiquette D’hexa-histidine N-terminal e et un site de clivage de protéase.REMARQUE : Dans ce protocole, nous avons utilisé un vecteur modifié pour inclure une étiquette d’hexa-histidine N-terminale et un site de clivage du virus du tabac Etch (TEV)<sup cla…

Representative Results

Clonage, expression et purification du domaine iKK-contraignant de NEMO.Le protocole a suivi dans cette étude pour obtenir la séquence finale de NEMO-EEAA (Figure 1A), qui a produit des cristaux de qualité de diffraction, a impliqué l’expression et la caractérisation de toutes les constructions intermédiaires, y compris l’ajout des adaptateurs enroulés-enroulés à N- et ou C-terminus, les mutations C76A, C95S et les mutations E56A, E57A. <strong …

Discussion

Les tentatives de cristallisation de NEMO sous la forme non liée ont échoué, y compris des tentatives utilisant la protéine pleine longueur et plusieurs constructions de truncation englobant le domaine iKK-contraignant. Notre caractérisation biophysique du domaine iKK-contraignant de NEMO (résidus 44-111) par dichroisme circulaire, spectroscopie RmN et anisotropy de fluorescence a indiqué que la construction, bien que capable de lier IKK, existait dans un état d’échange conformationnel, ne convient pas à la cri…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Nous remercions le professeur D. Madden pour les nombreuses discussions utiles qui ont eu lieu tout au long de ce projet. Nous remercions le professeur D. Bolon pour le don du plasmide contenant la bobine optimisée GCN4 enroulée. Nous remercions le Dr B. Guo pour les plasmides NEMO. Nous remercions Christina R. Arnoldy, Tamar Basiashvili et Amy E. Kennedy d’avoir démontré la procédure. Nous remercions l’installation de base de cristallographie BioMT et les départements de chimie et de biochimie et de biologie cellulaire de Dartmouth pour l’utilisation de l’équipement de cristallographie et du personnel de BioMT pour leur soutien. Cette recherche a utilisé la ligne de faisceau AMX du National Synchrotron Light Source II, un Office of Science User Facility du département de l’Énergie des États-Unis exploité pour le DOE Office of Science par le Brookhaven National Laboratory en vertu du contrat no. DE-SC0012704. Nous remercions le personnel de NSLS II pour son soutien. Ces travaux ont été financés par les subventions des NIH R03AR066130, R01GM133844, R35GM128663 et P20GM113132, ainsi qu’une subvention Munck-Pfefferkorn Novel and Interactive.

Materials

20% w/v γ-PGA (Na+ form, LM) Molecular Dimensions MD2-100-150 For fine screen crystallization of NEMO-EEAA
3.5 kDa MWCO Dialysis Membrane Spectra/Por 132724 For dialysis removal of imidazole
Amicon Stirred Cell Millipose Sigma UFSC 05001 For protein concentration
Ammonium Chloride Millipore Sigma G8270 For minimal media labeling
Benzonase Nuclease Millipore Sigma 9025-65-4 For digestion of nucleic acid
BL21-CodonPlus (DE3)-RIL Competent Cells Agilent Technologies Model: 230245 TEV expression
CryoPro Hampton Research HR2-073 Cryo-protectants kit
D-Glucose (Dextrose) Millipore Sigma A9434 For minimal media labeling
Difco Terrific Broth ThermoFisher DF043817 For culture growth
Dithiothreitol > 99% Goldbio DTT25 For reduction of disulfides
E. coli: Rosetta 2 (DE3) Novagen 71400-3 Expression of unlabeled NEMO-EEAA
FORMULATOR Formulatrix Liquid handler/ screen builder
HCl – 1.0 M Solution Hampton Research HR2-581 For fine screen crystallization of NEMO-EEAA
HiLoad 16/600 Superdex 75 pg GE Healthcare 28989333 For size exclusion purification
HisTrap HP 5 mL column GE Healthcare 17524802 For purification of His-tagged NEMO-EEAA
HT 96 MIDAS Molecular Dimensions MD1-59 For sparse matrix screening of NEMO-EEAA
HT 96 Morpheous Molecular Dimensions MD1-46 For sparse matrix screening of NEMO-EEAA
Imidazole ThermoFisher 288-32-4 For elution from His-trap column
Isopropyl-beta-D-thiogalactoside Goldbio I2481C5 For induction of cultures
MRC2 crystallization plate Hampton Research HR3-083 Crystallization plate
NT8 – Drop Setter Formulatrix Crystallization
pET-16b Millipore Sigma 69662 For cloning of NEMO-EEAA
pET-45b Millipore Sigma 71327 For cloning of NEMO-EEAA
Phenylmethylsulfonyl fluoride ThermoFisher 36978 For inhibition of proteases
Polycarbonate Bottle for use in Ultracentrifuge Rotor Type 45 Ti Beckmann Coulter 339160 Ultracentrifuge bottle
Polyethylene Glycol 20,000 Hampton Research HR2-609 For fine screen crystallization of NEMO-EEAA
pRK793 (TEV) Addgene Plasmid 8827 For TEV production
QuikChange XL II Agilent Technologies 200522 Site directed mutagenesis
Required Cap Assembly: Beckmann Coulter 355623 Ultracenttrifuge bottle cap
ROCK IMAGER Formulatrix Crystallization Imager
Seed Bead Kit Hampton Research HR2-320 Seed generation
Sodium Chloride ≥ 99% Millipore Sigma S9888 For buffering of purification solutions
TCEP (Tris (2-Carboxyethyl) phosphine Hydrochloride) Goldbio TCEP1 Reducing agent
The Berkeley Screen Rigaku MD15-Berekely For sparse matrix screening of NEMO-EEAA
The PGA Screen Molecular Dimensions MD1-50 For fine screen crystallization of NEMO-EEAA
Tris – 1.0 M Solution Hampton Research HR2-589 For fine screen crystallization of NEMO-EEAA
Ultrapure Tris Buffer (powder format) Thermofisher 15504020 For buffering of purification solutions
Urea ThermoFisher 29700 For denaturation of NEMO-EEAA

References

  1. Gilmore, T. D. Introduction to NF-kappaB: players, pathways, perspectives. Oncogene. 25 (51), 6680-6684 (2006).
  2. Bassères, D. S., Baldwin, A. S. Nuclear factor-kappaB and inhibitor of kappaB kinase pathways in oncogenic initiation and progression. Oncogene. 25 (51), 6817-6830 (2006).
  3. Hayden, M. S., West, A. P., Ghosh, S. NF-kappaB and the immune response. Oncogene. 25 (51), 6758-6780 (2006).
  4. Lee, T. I., Young, R. A. Transcriptional regulation and its misregulation in disease. Cell. 152 (6), 1237-1251 (2013).
  5. Courtois, G., Gilmore, T. D. Mutations in the NF-kappaB signaling pathway: implications for human disease. Oncogene. 25 (51), 6831-6843 (2006).
  6. Zhao, J., et al. Development of novel NEMO-binding domain mimetics for inhibiting IKK/NF-κB activation. PLoS biology. 16 (6), 2004663 (2018).
  7. Zhang, Q., Lenardo, M. J., Baltimore, D. 30 Years of NF-κB: a blossoming of relevance to human pathobiology. Cell. 168 (1-2), 37-57 (2017).
  8. Jin, D. Y., Jeang, K. T. Isolation of full-length cDNA and chromosomal localization of human NF-kappaB modulator NEMO to Xq28. Journal of Biomedical Science. 6 (2), 115-120 (1999).
  9. Rushe, M., et al. Structure of a NEMO/IKK-associating domain reveals architecture of the interaction site. Structure. 16 (5), 798-808 (2008).
  10. Guo, B., Audu, C. O., Cochran, J. C., Mierke, D. F., Pellegrini, M. Protein engineering of the N-terminus of NEMO: structure stabilization and rescue of IKKβ binding. Biochemistry. 53 (43), 6776-6785 (2014).
  11. Havranek, J. J., Harbury, P. B. Automated design of specificity in molecular recognition. Nature Structural Biology. 10 (1), 45-52 (2003).
  12. Barczewski, A. H., Ragusa, M. J., Mierke, D. F., Pellegrini, M. The IKK-binding domain of NEMO is an irregular coiled coil with a dynamic binding interface. Scientific Reports. 9 (1), 2950 (2019).
  13. Arimori, T., et al. Fv-clasp: an artificially designed small antibody fragment with improved production compatibility, stability, and crystallizability. Structure. 25 (10), 1611-1622 (2017).
  14. Hernandez Alvarez, B., Hartmann, M. D., Albrecht, R., Lupas, A. N., Zeth, K., Linke, D. A new expression system for protein crystallization using trimeric coiled-coil adaptors. Protein Engineering, Design and Selection. 21 (1), 11-18 (2008).
  15. Oshaben, K. M., Salari, R., McCaslin, D. R., Chong, L. T., Horne, W. S. The native GCN4 leucine-zipper domain does not uniquely specify a dimeric oligomerization state. Biochemistry. 51 (47), 9581-9591 (2012).
  16. Truebestein, L., Leonard, T. A. Coiled-coils: The long and short of it. BioEssays: News and Reviews in Molecular, Cellular and Developmental Biology. 38 (9), 903-916 (2016).
  17. Bradford, M. M. A rapid and sensitive method for the quantitation of microgram quantities of protein utilizing the principle of protein-dye binding. Analytical Biochemistry. 72, 248-254 (1976).
  18. Kapust, R. B., et al. Tobacco etch virus protease: mechanism of autolysis and rational design of stable mutants with wild-type catalytic proficiency. Protein Engineering. 14 (12), 993-1000 (2001).
  19. Miladi, B., et al. A new tagged-TEV protease: construction, optimisation of production, purification and test activity. Protein Expression and Purification. 75 (1), 75-82 (2011).
  20. Miller, M. S., et al. Getting the Most Out of Your Crystals: Data Collection at the New High-Flux, Microfocus MX Beamlines at NSLS-II. Molecules. 24 (3), (2019).
  21. McCoy, A. J., Grosse-Kunstleve, R. W., Adams, P. D., Winn, M. D., Storoni, L. C., Read, R. J. Phaser crystallographic software. Journal of Applied Crystallography. 40, 658-674 (2007).
  22. Adams, P. D., et al. PHENIX: a comprehensive Python-based system for macromolecular structure solution. Acta Crystallographica Section D: Biological Crystallography. 66, 213-221 (2010).
  23. Terwilliger, T. C., et al. Iterative model building, structure refinement and density modification with the PHENIX AutoBuild wizard. Acta Crystallographica. Section D, Biological Crystallography. 64, 61-69 (2008).
  24. Emsley, P., Cowtan, K. Coot: model-building tools for molecular graphics. Acta Crystallographica. Section D, Biological Crystallography. 60, 2126-2132 (2004).
  25. Terwilliger, T. C., et al. phenix.mr_rosetta: molecular replacement and model rebuilding with Phenix and Rosetta. Journal of Structural and Functional Genomics. 13 (2), 81-90 (2012).
  26. Strong, M., Sawaya, M. R., Wang, S., Phillips, M., Cascio, D., Eisenberg, D. Toward the structural genomics of complexes: crystal structure of a PE/PPE protein complex from Mycobacterium tuberculosis. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 103 (21), 8060-8065 (2006).
  27. Tickle, I. J., et al. . STARANISO. , (2018).
  28. French, S., Wilson, K. On the treatment of negative intensity observations. Acta Crystallographica Section A: Crystal Physics, Diffraction, Theoretical and General Crystallography. 34 (4), 517-525 (1978).
  29. Goldschmidt, L., Cooper, D. R., Derewenda, Z. S., Eisenberg, D. Toward rational protein crystallization: A Web server for the design of crystallizable protein variants. Protein Science: A Publication of the Protein Society. 16 (8), 1569-1576 (2007).
  30. Zhou, L., et al. Disulfide-mediated stabilization of the IκB kinase binding domain of NF-κB essential modulator (NEMO). Biochemistry. 53 (50), 7929-7944 (2014).
  31. D’Arcy, A., Bergfors, T., Cowan-Jacob, S. W., Marsh, M. Microseed matrix screening for optimization in protein crystallization: what have we learned. Acta Crystallographica. Section F, Structural Biology Communications. 70, 1117-1126 (2014).

Play Video

Cite This Article
Barczewski, A. H., Ragusa, M. J., Mierke, D. F., Pellegrini, M. Production, Crystallization, and Structure Determination of the IKK-binding Domain of NEMO. J. Vis. Exp. (154), e60339, doi:10.3791/60339 (2019).

View Video