Produktion, kristallisering och strukturbestämning av IKK-bindande domän för NEMO
Summary
Vi beskriver protokoll för strukturbestämning av IKK-bindande domän för NEMO genom röntgenkristallografi. Metoderna omfattar proteinuttryck, rening och karakterisering samt strategier för framgångsrik kristall optimering och strukturbestämning av proteinet i dess obundna form.
Abstract
NEMO är ett byggnads ställnings protein som spelar en viktig roll i NF-κB-vägen genom att montera IKK-komplexet med kinaser IKKα och IKKβ. Vid aktivering, IKK komplexa fosforylerar de iκb molekyler som leder till NF-κb nukleära flyttning och aktivering av målgener. Hämning av den NEMO/IKK interaktion är en attraktiv terapeutisk paradigm för modulering av NF-κB Pathway aktivitet, gör NEMO ett mål för inhibitorer design och upptäckt. För att underlätta processen för upptäckt och optimering av NEMO-hämmare, konstruerade vi en förbättrad konstruktion av IKK-bindande domän av NEMO som skulle möjliggöra strukturbestämning av proteinet i APO-form och samtidigt bunden till småmolekylära vikt hämmare. Här presenterar vi den strategi som används för design, uttryck och strukturell karakterisering av IKK-bindande domän av NEMO. Proteinet uttrycks i E. coli -celler, solubiliseras under denaturerande förhållanden och renas genom tre kromatografiska steg. Vi diskuterar protokollen för att få kristaller för strukturbestämning och beskriver datainsamlings-och analysstrategier. Protokollen kommer att finna stor tillämplighet på strukturen bestämning av komplex av NEMO och små molekyler hämmare.
Introduction
NF-κB-vägen aktiveras som svar på en mängd olika stimuli, inklusive cytokiner, mikrobiella produkter och stress, för att reglera uttrycket av målgener som svarar för inflammatoriska och immunrespons, celldöd eller överlevnad och proliferation1. Patologier inklusive inflammatoriska och autoimmuna sjukdomar och cancer2,3,4,5 har korrelerats till hyperaktivering av vägen, som har gjort modulering av NF-κb aktivitet ett främsta mål för utvecklingen av nya terapier6,7.
Den kanoniska NF-κB-vägen skiljer sig i synnerhet från den icke-kanoniska vägen, som ansvarar för lymphorganogenes och B-cells aktivering, av det förstnämnda beroendet av byggnads ställnings proteinet NEMO (NF-κB Essential modulator8) för monteringen av IKK-komplexet med kinaser IKKα och ikkβ. IKK-komplexet ansvarar för fosforyleringen av IκBα (inhibitor för κB) som riktar den mot nedbrytning, vilket frigör NF-κB-dimererna att translokalisera till kärnan för gentranskription1 och är därför ett attraktivt mål för utvecklingen av inhibitorer för att MODULERA NF-κb-aktiviteten.
Vår forskning fokuserar på karakterisering av protein-protein interaktion mellan NEMO och IKKβ, inriktning NEMO för utveckling av små molekyler hämmare av IKK komplex formation. Den minimala bindnings domänen för NEMO, som krävs för att binda IKKβ, omfattar resthalter 44-111, och dess struktur har fastställts i komplex med en peptid motsvarande IKKβ-sekvens 701-7459. Nemo och ikkβ bildar en Four-Helix bunt där Nemo dimer rymmer de två alfahelixar av ikkβ (701-745) i ett långsträckt öppet spår med en utökad interaktion gränssnitt. IKKβ (734-742), även känd som NEMO-bindande domän (NBD), definierar den viktigaste hot-spot för bindning, där de två viktiga tryptophans (739 741) begrava djupt i NEMO fickan. Detaljerna i den komplexa strukturen kan stöd i struktur-baserad design och optimering av småmolekylära hämmare riktar sig till NEMO. Samtidigt är det svårt att bindningen av en liten molekyl eller peptid skulle återskapa i NEMO den fullständiga överensstämande förändringen (dvs. omfattande öppnande av NEMO coiled-Coil dimer) orsakad av bindning av den långa IKKβ (701-745), som observerats i kristallen, och strukturen av obunden NEMO eller NEMO bunden till en liten molekyl hämmare kan representera ett bättre mål för strukturbaserad läkemedelsdesign och inhibitor optimering.
Full längd NEMO och mindre trunkering konstruktioner som omfattar IKK-bindande domän har visat sig vara svårbevisad för strukturbestämning i obunden form via röntgen kristallografi och kärnmagnetisk resonans (NMR) metoder10, som föranledde oss att utforma en förbättrad version av IKK-bindande domän Nemo. Indeed, Nemo (44-111) i obunden form är bara delvis viks och genomgår konforma utbyte och vi därför att stabilisera sin dimeriskt struktur, lindade-spole vika och stabilitet, samtidigt som bindning affinitet för ikkβ. Genom att lägga till tre heptads av ideal dimeriskt lindade-Coil sekvenser11 vid N-och C-Termini av proteinet, och en serie av fyra punktmutationer, genererade vi Nemo-eeaa, en konstruktion helt dimeriskt och viks i en lindad spole, som räddade IKK-bindande affinitet till nanomolar sortiment som observerats för full längd Nemo12. Som en ytterligare fördel, vi hoppades att lindade-Coil adaptrar (baserat på GCN4 sekvens) skulle underlätta kristallisation och så småningom stöd i röntgen strukturbestämning via molekylär ersättning. Lindade-Coil adaptrar har på samma sätt utnyttjas för att både öka stabiliteten, förbättra lösningen beteende och underlätta kristallisering för trimeric lindade spolar och antikroppar fragment13,14. Nemo-eeaa är lätt att uttryckas och renas från Escherichia. coli -celler med en klyvbar histidin-tagg, är löslig, vikas i en stabil dimeriskt lindad spole och är lätt kristalliserad, med diffraktion till 1,9 Å. Närvaron av de beställda lindade-Coil regioner i GCN4 kan dessutom stöd i fasa data från kristaller av NEMO-EEAA genom molekylär ersättning med hjälp av den kända strukturen i GCN415.
Med tanke på de resultat som erhållits med APO-NEMO-EEAA, tror vi att de protokoll som beskrivs här kan också tillämpas på kristallisering av NEMO-EEAA i närvaro av små peptider (som NBD peptid) eller små molekyler hämmare, med målet att förstå kraven för NEMO hämning och strukturbaserad optimering av initiala bly-hämmare till hög affinitet. Med tanke på plasticitet och dynamiska karaktären hos många lindade-Coil domäner16, användning av lindade-Coil adaptrar kunde hitta mer allmän tillämplighet i medhjälp strukturell beslutsamhet.
Protocol
Representative Results
Discussion
Kristalliserings försök av NEMO i obunden form misslyckades, inklusive försök att använda full längd protein och flera trunkering konstruktioner som omfattar IKK-bindande domän. Vår biofysiska karakterisering av IKK-bindande domän av Nemo (rester 44-111) av cirkulär dichroism, NMR spektroskopi och fluorescens anisotropi uppgav att konstruktionen, om än kunna binda ikkβ, existerade i ett tillstånd av överensstämande utbyte, inte lämpar sig för kristallisation9,<sup class…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Vi tackar prof. D. Madden, för många hjälpsamma diskussioner i hela detta projekt. Vi tackar prof. D. Bolon för gåvan av plasmiden som innehåller den optimerade GCN4 lindade spolen. Vi tackar Dr. B. Guo för NEMO plasmider. Vi tackar Christina R. Arnoldy, Tamar Basiashvili och Amy E. Kennedy för att demonstrera förfarandet. Vi tackar BioMT kristallografi Core facility och avdelningarna för kemi och biokemi & cell bio logi vid Dartmouth för användning av kristallografi utrustning och BioMT personal för deras stöd. Denna forskning används AMX fd av den nationella Synchrotron ljuskälla II, en US Department of Energy (DOE) Office of Science användaranläggning drivs för DOE Office of Science av Brookhaven National Laboratory under kontrakt nr. DE-SC0012704. Vi tackar Personalen på NSLS II för deras stöd. Detta arbete finansierades av NIH bidrag R03AR066130, R01GM133844, R35GM128663 och P20GM113132, och en Munck-Pfefferkorn roman och interaktiva bidrag.
Materials
| 20% w/v γ-PGA (Na+ form, LM) | Molecular Dimensions | MD2-100-150 | For fine screen crystallization of NEMO-EEAA |
| 3.5 kDa MWCO Dialysis Membrane | Spectra/Por | 132724 | For dialysis removal of imidazole |
| Amicon Stirred Cell | Millipose Sigma | UFSC 05001 | For protein concentration |
| Ammonium Chloride | Millipore Sigma | G8270 | For minimal media labeling |
| Benzonase Nuclease | Millipore Sigma | 9025-65-4 | For digestion of nucleic acid |
| BL21-CodonPlus (DE3)-RIL Competent Cells | Agilent Technologies | Model: 230245 | TEV expression |
| CryoPro | Hampton Research | HR2-073 | Cryo-protectants kit |
| D-Glucose (Dextrose) | Millipore Sigma | A9434 | For minimal media labeling |
| Difco Terrific Broth | ThermoFisher | DF043817 | For culture growth |
| Dithiothreitol > 99% | Goldbio | DTT25 | For reduction of disulfides |
| E. coli: Rosetta 2 (DE3) | Novagen | 71400-3 | Expression of unlabeled NEMO-EEAA |
| FORMULATOR | Formulatrix | Liquid handler/ screen builder | |
| HCl – 1.0 M Solution | Hampton Research | HR2-581 | For fine screen crystallization of NEMO-EEAA |
| HiLoad 16/600 Superdex 75 pg | GE Healthcare | 28989333 | For size exclusion purification |
| HisTrap HP 5 mL column | GE Healthcare | 17524802 | For purification of His-tagged NEMO-EEAA |
| HT 96 MIDAS | Molecular Dimensions | MD1-59 | For sparse matrix screening of NEMO-EEAA |
| HT 96 Morpheous | Molecular Dimensions | MD1-46 | For sparse matrix screening of NEMO-EEAA |
| Imidazole | ThermoFisher | 288-32-4 | For elution from His-trap column |
| Isopropyl-beta-D-thiogalactoside | Goldbio | I2481C5 | For induction of cultures |
| MRC2 crystallization plate | Hampton Research | HR3-083 | Crystallization plate |
| NT8 – Drop Setter | Formulatrix | Crystallization | |
| pET-16b | Millipore Sigma | 69662 | For cloning of NEMO-EEAA |
| pET-45b | Millipore Sigma | 71327 | For cloning of NEMO-EEAA |
| Phenylmethylsulfonyl fluoride | ThermoFisher | 36978 | For inhibition of proteases |
| Polycarbonate Bottle for use in Ultracentrifuge Rotor Type 45 Ti | Beckmann Coulter | 339160 | Ultracentrifuge bottle |
| Polyethylene Glycol 20,000 | Hampton Research | HR2-609 | For fine screen crystallization of NEMO-EEAA |
| pRK793 (TEV) | Addgene | Plasmid 8827 | For TEV production |
| QuikChange XL II | Agilent Technologies | 200522 | Site directed mutagenesis |
| Required Cap Assembly: | Beckmann Coulter | 355623 | Ultracenttrifuge bottle cap |
| ROCK IMAGER | Formulatrix | Crystallization Imager | |
| Seed Bead Kit | Hampton Research | HR2-320 | Seed generation |
| Sodium Chloride ≥ 99% | Millipore Sigma | S9888 | For buffering of purification solutions |
| TCEP (Tris (2-Carboxyethyl) phosphine Hydrochloride) | Goldbio | TCEP1 | Reducing agent |
| The Berkeley Screen | Rigaku | MD15-Berekely | For sparse matrix screening of NEMO-EEAA |
| The PGA Screen | Molecular Dimensions | MD1-50 | For fine screen crystallization of NEMO-EEAA |
| Tris – 1.0 M Solution | Hampton Research | HR2-589 | For fine screen crystallization of NEMO-EEAA |
| Ultrapure Tris Buffer (powder format) | Thermofisher | 15504020 | For buffering of purification solutions |
| Urea | ThermoFisher | 29700 | For denaturation of NEMO-EEAA |
References
- Gilmore, T. D. Introduction to NF-kappaB: players, pathways, perspectives. Oncogene. 25 (51), 6680-6684 (2006).
- Bassères, D. S., Baldwin, A. S. Nuclear factor-kappaB and inhibitor of kappaB kinase pathways in oncogenic initiation and progression. Oncogene. 25 (51), 6817-6830 (2006).
- Hayden, M. S., West, A. P., Ghosh, S. NF-kappaB and the immune response. Oncogene. 25 (51), 6758-6780 (2006).
- Lee, T. I., Young, R. A. Transcriptional regulation and its misregulation in disease. Cell. 152 (6), 1237-1251 (2013).
- Courtois, G., Gilmore, T. D. Mutations in the NF-kappaB signaling pathway: implications for human disease. Oncogene. 25 (51), 6831-6843 (2006).
- Zhao, J., et al. Development of novel NEMO-binding domain mimetics for inhibiting IKK/NF-κB activation. PLoS biology. 16 (6), 2004663 (2018).
- Zhang, Q., Lenardo, M. J., Baltimore, D. 30 Years of NF-κB: a blossoming of relevance to human pathobiology. Cell. 168 (1-2), 37-57 (2017).
- Jin, D. Y., Jeang, K. T. Isolation of full-length cDNA and chromosomal localization of human NF-kappaB modulator NEMO to Xq28. Journal of Biomedical Science. 6 (2), 115-120 (1999).
- Rushe, M., et al. Structure of a NEMO/IKK-associating domain reveals architecture of the interaction site. Structure. 16 (5), 798-808 (2008).
- Guo, B., Audu, C. O., Cochran, J. C., Mierke, D. F., Pellegrini, M. Protein engineering of the N-terminus of NEMO: structure stabilization and rescue of IKKβ binding. Biochemistry. 53 (43), 6776-6785 (2014).
- Havranek, J. J., Harbury, P. B. Automated design of specificity in molecular recognition. Nature Structural Biology. 10 (1), 45-52 (2003).
- Barczewski, A. H., Ragusa, M. J., Mierke, D. F., Pellegrini, M. The IKK-binding domain of NEMO is an irregular coiled coil with a dynamic binding interface. Scientific Reports. 9 (1), 2950 (2019).
- Arimori, T., et al. Fv-clasp: an artificially designed small antibody fragment with improved production compatibility, stability, and crystallizability. Structure. 25 (10), 1611-1622 (2017).
- Hernandez Alvarez, B., Hartmann, M. D., Albrecht, R., Lupas, A. N., Zeth, K., Linke, D. A new expression system for protein crystallization using trimeric coiled-coil adaptors. Protein Engineering, Design and Selection. 21 (1), 11-18 (2008).
- Oshaben, K. M., Salari, R., McCaslin, D. R., Chong, L. T., Horne, W. S. The native GCN4 leucine-zipper domain does not uniquely specify a dimeric oligomerization state. Biochemistry. 51 (47), 9581-9591 (2012).
- Truebestein, L., Leonard, T. A. Coiled-coils: The long and short of it. BioEssays: News and Reviews in Molecular, Cellular and Developmental Biology. 38 (9), 903-916 (2016).
- Bradford, M. M. A rapid and sensitive method for the quantitation of microgram quantities of protein utilizing the principle of protein-dye binding. Analytical Biochemistry. 72, 248-254 (1976).
- Kapust, R. B., et al. Tobacco etch virus protease: mechanism of autolysis and rational design of stable mutants with wild-type catalytic proficiency. Protein Engineering. 14 (12), 993-1000 (2001).
- Miladi, B., et al. A new tagged-TEV protease: construction, optimisation of production, purification and test activity. Protein Expression and Purification. 75 (1), 75-82 (2011).
- Miller, M. S., et al. Getting the Most Out of Your Crystals: Data Collection at the New High-Flux, Microfocus MX Beamlines at NSLS-II. Molecules. 24 (3), (2019).
- McCoy, A. J., Grosse-Kunstleve, R. W., Adams, P. D., Winn, M. D., Storoni, L. C., Read, R. J. Phaser crystallographic software. Journal of Applied Crystallography. 40, 658-674 (2007).
- Adams, P. D., et al. PHENIX: a comprehensive Python-based system for macromolecular structure solution. Acta Crystallographica Section D: Biological Crystallography. 66, 213-221 (2010).
- Terwilliger, T. C., et al. Iterative model building, structure refinement and density modification with the PHENIX AutoBuild wizard. Acta Crystallographica. Section D, Biological Crystallography. 64, 61-69 (2008).
- Emsley, P., Cowtan, K. Coot: model-building tools for molecular graphics. Acta Crystallographica. Section D, Biological Crystallography. 60, 2126-2132 (2004).
- Terwilliger, T. C., et al. phenix.mr_rosetta: molecular replacement and model rebuilding with Phenix and Rosetta. Journal of Structural and Functional Genomics. 13 (2), 81-90 (2012).
- Strong, M., Sawaya, M. R., Wang, S., Phillips, M., Cascio, D., Eisenberg, D. Toward the structural genomics of complexes: crystal structure of a PE/PPE protein complex from Mycobacterium tuberculosis. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 103 (21), 8060-8065 (2006).
- Tickle, I. J., et al. . STARANISO. , (2018).
- French, S., Wilson, K. On the treatment of negative intensity observations. Acta Crystallographica Section A: Crystal Physics, Diffraction, Theoretical and General Crystallography. 34 (4), 517-525 (1978).
- Goldschmidt, L., Cooper, D. R., Derewenda, Z. S., Eisenberg, D. Toward rational protein crystallization: A Web server for the design of crystallizable protein variants. Protein Science: A Publication of the Protein Society. 16 (8), 1569-1576 (2007).
- Zhou, L., et al. Disulfide-mediated stabilization of the IκB kinase binding domain of NF-κB essential modulator (NEMO). Biochemistry. 53 (50), 7929-7944 (2014).
- D’Arcy, A., Bergfors, T., Cowan-Jacob, S. W., Marsh, M. Microseed matrix screening for optimization in protein crystallization: what have we learned. Acta Crystallographica. Section F, Structural Biology Communications. 70, 1117-1126 (2014).
