Summary
Wir bieten ein Protokoll zur Isolierung von Mikroglia aus verschiedenen sezierten Regionen einer erwachsenen Maushirnhälfte, gefolgt von halbautomatischer Bibliotheksvorbereitung für die tiefe einzelzellige RNA-Sequenzierung von Transkriptomen in voller Länge. Diese Methode wird dazu beitragen, die funktionelle Heterogenität von Mikroglia bei Gesundheit und Krankheit aufzuklären.
Abstract
Als ansässige Makrophagen im zentralen Nervensystem, Mikroglia aktiv Steuern gehirnentwicklung und Homöostase, und ihre Funktionsstörungen können menschliche Krankheiten antreiben. Erhebliche Fortschritte wurden gemacht, um die molekularen Signaturen von heimostatischen Mikroglia sowie Veränderungen ihrer Genexpression als Reaktion auf Umweltreize aufzudecken. Mit dem Aufkommen und der Reifung einzelliger genomischer Methoden wird zunehmend erkannt, dass heterogene Mikroglia den unterschiedlichen Rollen zugrunde liegen können, die sie in verschiedenen entwicklungs- und pathologischen Bedingungen spielen. Eine weitere Zerlegung einer solchen Heterogenität kann durch eine effiziente Isolierung von Mikroglia aus einer bestimmten Interessensregion erreicht werden, gefolgt von einer sensiblen Profilierung einzelner Zellen. Hier bieten wir ein detailliertes Protokoll für die schnelle Isolierung von Mikroglia aus verschiedenen Hirnregionen in einer einzigen erwachsenen Maus-Gehirnhälfte. Wir zeigen auch, wie diese sortierten Mikroglia für die plattenbasierte tiefe einzelzellige RNA-Sequenzierung verwendet werden. Wir diskutieren die Anpassungsfähigkeit dieser Methode an andere Szenarien und stellen Richtlinien für die Verbesserung des Systems für groß angelegte Studien bereit.
Introduction
Mikroglia, die 5 % der Nervenzellen ausmacht, sind über das zentralnervousische System (ZNS) verstreuteMakrophagen. Geschützt hinter Blut - Hirn-Schranke, typische Mikroglia in einem gesunden erwachsenen Gehirn enthalten viele feine Prozesse, die schnell erweitern und zurückziehen, um mit Neuronen und anderen Gliazellen im Parenchym interagieren. Microglia kann auch die amoemoide Morphologie annehmen, die mit einer erhöhten phagozytischen Funktion in bestimmten Entwicklungsstadien oder bei Immunherausforderungen bei Verletzungen und Krankheiten1,2,3,4verbunden ist. Jüngste spannende Entdeckungen haben deutlich gezeigt, dass Mikroglia keineswegs passive Zuschauer von hirnabgeleiteten oder pathologischen Signalen sind, sondern eine zentrale Rolle bei der Steuerung der Gehirnentwicklung und Homöostase spielen, beispielsweise durch die Unterstützung des neuronalen Überlebens, das Beschnitt unreifer Synapsen, die Förderung der Differenzierung von Oligodendrozyten-Linienzellen sowie die Angiogenese1. Da mehr Funktionen von Mikroglia aufgeklärt werden, wird die Aufregung durch humangenetische Studien weiter angeheizt, die zeigten, dass viele neurodegenerative Krankheitsrisikogene, wie TREM2, überwiegend oder ausschließlich durch Mikroglia5,6,7ausgedrückt werden. Angesichts ihrer Bedeutung für die Entwicklung und der plausiblen rolle der Krankheit wurden in letzter Zeit enorme Anstrengungen unternommen, um unser Verständnis der mikroglialen Genregulation und -funktion zu verstehen, in der Hoffnung, neue therapeutische Ziele für neurodegenerative Erkrankungen zu finden1,8.
Die RNA-Sequenzierung (RNA-seq) ermöglicht eine unvoreingenommene Charakterisierung der zelltypspezifischen Genexpression, was wiederum Wissenschaftler bei der Untersuchung von Genfunktionen in dichten Zellnetzen leitet7. RNA-seq wurde hauptsächlich auf Massenproben durchgeführt, was zur Entdeckung einer panostatischen mikrogliaalen Gensignatur führte, die sie von anderen neuronalen und Immunzellen unterscheidet9. Ein solcher Ansatz könnte jedoch molekulare und funktionelle Unterschiede zwischen Mikroglia übersehen, insbesondere solche, die vorübergehend in der Entwicklung vorhanden sind oder mit Alterung und Krankheit in Verbindung gebracht werden. Tatsächlich bietet einzellige RNA-seq (scRNA-seq) die Empfindlichkeit und Auflösung, die das Feld revolutioniert haben, indem sie zuvor unterschätzte Heterogenität von Mikroglia in einer Vielzahl von Kontexten2,3,10. Darüber hinaus liefert scRNA-seq aufgrund des Vorhandenseins anderer ähnlicher Immunzellen an der CNS-Zirkulationsschnittstelle Informationen, die das Design neuer Werkzeuge unterstützen, um diese verwandten Zellen mit wenig Vorkenntnissen zu trennen und funktionell zu sezieren2,11.
Es wurde eine Vielzahl von scRNA-seq-Plattformen erfunden, die jeweils für bestimmte Anwendungen geeignet sind12. Im Allgemeinen sind tröpfchenbasierte Methoden, wie z. B. 10x Genomics, höher im Durchsatz mit (Zehntausenden) Tausenden von Zellen, die in jedem Durchlauf sequenziert werden, und sie sind weniger selektiv für die Eingabe, die gemischte Zellpopulationen enthalten kann, die eine umfassende Kategorisierung erfordern. Plattenbasierte Methoden bieten eine höhere Empfindlichkeit und Lesetiefe13,14, in der Regel auf bestimmte Populationen aus der Zellsortierung abzielen, um subtile Unterschiede oder seltene Transkripte aufzudecken. Angesichts des geringen Anteils mikrogliar alataler Zellen, insbesondere dieser entwicklungs- oder krankheitsassoziierten Subpopulationen, unter allen ZNS-Zelltypen ist es oft wünschenswert, Mikroglia aus einer bestimmten Interessensregion zu isolieren und tiefe und umfassende transkriptomische Informationen zu erhalten, um ihre Heterogenität zu verstehen.
Hier bieten wir Details, wie Mikroglia aus verschiedenen Maushirnregionen isoliert werden kann, die von einer einzigen Hemisphäre seziert werden, die nach einem halbautomatischen plattenbasierten Bibliotheksvorbereitungsverfahren für einzellige (oder Massen-) RNA-Seq verwendet werden. Die andere Hemisphäre kann dann für die histologische Validierung verwendet werden. Optimiert von einer zuvor veröffentlichten Methode9zielt dieses Isolationsprotokoll darauf ab, den Ertrag aus einer geringen Menge an Ausgangsmaterialien zu maximieren und in der Zwischenzeit endogene mikrogliaale Genexpressionsprofile zu pflegen. Wir verwenden fluoreszenzaktivierte Zellsortierung (FACS), um Mikroglia (oder andere verwandte Immunzellen von Interesse) in 96-Well-Platten anzureichern und die Volumen von Reagenzien für die Bibliotheksvorbereitung zu miniaturisieren, um den Durchsatz zu erhöhen. Wir heben diese sensible scRNA-seq-Plattform hervor, obwohl andere plattenbasierte Strategien angewendet werden können. Diese Methode kann leicht angepasst werden, um Mikroglia von anderen sezierten Geweben zu isolieren, wie Verletzungen oder Krankheitsherde, und das Alter der Maus kann in fast jedem postnatalen Stadium variieren. Eine effiziente Isolierung regionaler Mikroglia für einzellige Transkriptomikstudien wird ein besseres Verständnis ihrer Funktionen bei Gesundheit und Krankheit erleichtern.
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Protocol
Alle Verfahren, an denen Nagetiere beteiligt sind, entsprachen den Richtlinien der Stanford University, die den nationalen und staatlichen Gesetzen und Richtlinien entsprechen. Alle Tierverfahren wurden vom Verwaltungsgremium für Labortierpflege der Stanford University genehmigt.
HINWEIS: Alle Lösungs- und Pufferzusammensetzungen sind in Tabelle der Materialienenthalten.
1. Vorbereitung am Tag der Zellisolierung
- Bereiten Sie folgende Reagenzien vor und kühlen Sie sie auf Eis: Medium A (50 ml), magnetaktivierter Zellsortierungspuffer (30 ml), FACS-Puffer (25 ml), phosphatgepufferte Saline (PBS; 30 ml), DNase (320 l) und RNase-Inhibitor (30 l).
HINWEIS: Die hier zur Verfügung gestellten Volumina reichen aus, um Mikroglia aus 4 Hirnregionen (z.B. Kortex, Kleinhirn, Hippocampus und Striatum) einer einzelnen Maushirnhälfte zu isolieren. Skalieren Sie, wenn mehr Gewebe verwendet werden. - Legen Sie vier saubere 2 ml Dounce Homogenisatoren auf Eis und fügen Sie 2 ml Medium A mit 80 l DNase (12.500 Einheiten/ml) und 5 l RNase-Inhibitor in jeden Dounce-Homogenisator ein. Kühlen Sie die Kolben in 15 ml Rohren.
- Etikettieren Sie vier 6 cm Petrischalen mit Hirnregionen für die Gewebesammlung und fügen Sie 200 l kaltes Medium A in jede Schale auf Eis ein. Ca. 5 ml Medium A zur Zerlegung in eine 6 cm Petrischale geben.
HINWEIS: Stellen Sie vor der Anwendung sicher, dass alle Reagenzien steril und für RNA-Anwendungen geeignet sind. Bank- und Sezierwerkzeuge müssen sauber und mit RNase Dekontaminationslösung(Materialtabelle)besprüht werden.
2. Hirnregion-Sektion
HINWEIS: Dieser Schritt sollte ca. 30 min dauern.
- Injizieren Sie 400 x 500 l Ketamin/Xylazin (24 mg/ml Ketamin und 2,4 mg/ml Xylazin) in das Peritoneum einer jugendlichen zu erwachsenen Stage-Maus (>1 Monat alt).
HINWEIS: Eine männliche Maus wird hier zur Veranschaulichung verwendet, aber beide Geschlechter sind geeignet. - Warten Sie 5 min und kneifen Sie eine Hinterpfote, um einen Mangel an Rückzug zu gewährleisten.
- Verwenden Sie sofort eine 26 G x 3/8 Nadel, um eine transkardiale Perfusion mit 20 bis 30 ml eiskaltem PBS durchzuführen, bis der Puffer ohne sichtbares Blut abläuft.
- Enthaupten Sie die Maus mit einer chirurgischen Schere. Verwenden Sie eine kleine Schere, um die Haut zu schneiden, um den darunter liegenden Schädel freizulegen, und schneiden Sie dann durch die sagittale Naht, Lambdoidal Naht und koronare Naht. Verwenden Sie Zangen, um beide Seiten des parietalen Knochens und interparietalen Knochens abzuziehen, ohne das Gewebe zu beschädigen, und bewegen Sie das Gehirn vorsichtig in die Sezierform Petrischale mit Medium A.
- Verwenden Sie eine vorgekühlte Klinge, um das Gehirn durch die Mittellinie in zwei Hemisphären zu schneiden.
HINWEIS: Die vier hier beschriebenen Hirnregionen aus einer einzigen Hemisphäre ergeben eine ausreichende Anzahl von Mikroglia für einzellige oder massenhafte RNA-Seq-Anwendungen. Die andere Hemisphäre kann für die Immunhistochemie oder RNA-in-situ-Validierung verwendet werden. - Trennen Sie das Kleinhirn vom kortikalen Lappen und dem Hirnstamm mit #55 Zange und übertragen Sie das Gewebe in eine Sammlung Petrischale.
- Verwenden Sie #55 Zange, um den Hippocampus und das Striatum vorsichtig aus dem Kortex zu sezieren und jedes Gewebe in eine Sammlung Petrischale zu übertragen.
3. Mechanische Gewebedissoziation
HINWEIS: Halten Sie Zellen und Reagenzien die ganze Zeit kühl, außer während der Färbung Schritte. Dieser Schritt sollte ca. 30 min dauern.
- Schneiden Sie jedes Hirngewebe mit einer Rasierklinge in <1 mm3 feine Stücke.
- Verwenden Sie 1 ml Pipette (mit abgeschnittenen Spitzen), um Gewebeteile in die vorgekühlten Dounce Homogenisatoren zu übertragen, die jeweils 2 ml Medium A mit DNase- und RNase-Inhibitor enthalten.
- Homogenisieren Sie das Gewebe, indem Sie den Kolben langsam in und aus dem Dounce Homogenisator für 6-10 volle Striche verdrehen, bis keine sichtbaren Brocken vorhanden sind.
HINWEIS: Douncing tötet Neuronen und die meisten anderen Gliazellen, lässt aber mikrogliaale Zellen ziemlich intakt. Sowohl unzureichende als auch überdhüpfende Werte können zu einer geringen Ausbeute an Zellen führen. - Übertragen Sie dissoziierte Gewebe durch 70'm-Siebe in 50 ml-Röhren.
- Spülen Sie jeden Dounce Homogenisator und Kolben mit insgesamt 6 ml Kaltmedium A und filtern Sie die Spüllösung durch das gleiche Sieb in das entsprechende Rohr.
- Die Einzelzellaufhängungen (je ca. 8 ml) in 15 ml konische Rohre und Zentrifugen bei 400 x g für 5 min bei 4 °C mit Bremse = 5 übertragen.
4. MyelinEntfernung
HINWEIS: Dieser Schritt sollte ca. 60 min dauern.
- Bereiten Sie 1 große Erschöpfungsspalte (LD) (für Kortex) und 3 große Auswahlspalten (LS) (für die anderen 3 Regionen) in einem magnetischen Trennzeichen (Materialtabelle) vor. Spülen Sie jede Spalte mit 3 ml MCS-Puffer.
- Sobald die Zentrifugation abgeschlossen ist, Pipette aus und entsorgen Sie den Überstand, ohne das Pellet zu stören. Für das Cortex- und Daserebellumgewebe, resuspendieren Sie Zellen in 850 l MCS-Puffer mit 1,8 l RNase-Inhibitor. Für Hippocampus- und Striatumgewebe, resuspendieren Sie Zellen in 400 l MCS-Puffer mit 0,9 l RNase-Inhibitor.
HINWEIS: Die Spalten (LD vs. LS) und das volumen, das für die Resuspension verwendet wird, werden basierend auf der Menge an Myelin im Gewebe optimiert. Wenn andere Hirnregionen untersucht werden, müssen diese Bedingungen möglicherweise angepasst werden, abhängig von der Größe des Gewebes und wie viel Myelin existieren kann. Wirksamkeit der Myelin-Entfernung kann in Schritt 4.9 geschätzt werden. - Fügen Sie jeweils 100 L Myelinentfernungsperlen in Zellen aus Kortex und Kleinhirn hinzu und fügen Sie jeweils 50 L Myelinentfernungsperlen in Zellen aus Hippocampus und Striatum hinzu.
- Mischen Sie die Zellen vorsichtig mit Perlen und inkubieren Sie die Rohre auf Eis für 10 min.
- Bringen Sie das Volumen der Röhre mit kortikalen Zellen auf 2 ml mit MCS-Puffer, und alle anderen auf 1 ml (d. h., fügen Sie 1 ml für kortikale Zellen; 500 l für Hippocampus- und Striatalzellen; keine Notwendigkeit, Kleinhirnzellen Puffer hinzuzufügen).
- Sobald die Spalten leer vom Spülpuffer sind, legen Sie eine 15 ml-Röhre unter jeder Spalte. Laden Sie kortikale Zellen (2 ml) in die LD-Spalte und alle anderen (jeweils 1 ml) in die LS-Spalten. Verwenden Sie sofort jeweils 1 ml MCS-Puffer, um die Originalrohre zu waschen und die Lösung auf die entsprechenden Säulen zu laden.
- Waschen Sie die LD-Säule einmal mit 1 ml MCS-Puffer und waschen Sie jede LS-Säule zweimal mit 1 ml MCS-Puffer pro Wäsche. Fahren Sie fort, um die Durchflusslösung während des Waschens zu sammeln.
- Filtern Sie Zellen in runde FACS-Rohre durch 35 m Siebkappen.
HINWEIS: Jedes Rohr sollte etwa 4 ml einzellige Suspension von Myelin erschöpft sammeln. - Nehmen Sie optional 10 l der Zellsuspension und mischen Sie sie mit einer 10-L-Lösung mit 0,4 % Trypan-Blaulösung. Untersuchen Sie die Zellen unter einem 10-fachen Hellfeldmikroskop, um die Ausbeute, Überlebensrate und den Restmyelingehalt zu schätzen.
HINWEIS: Eine erfolgreiche Zubereitung sollte über 90% lebende Zellen (rund in Form und ohne den blauen Farbstoff) mit wenig bis gar keinem Myelin-Abfall erzeugen. - Pelletzellen in den FACS-Rohren bei 400 x g für 5 min bei 4 °C, mit Bremse = 5. Langsam überwasseren überstand und tupfte den Rand des Rohres auf Tissuepapier. Resuspend Zellen in jedem Rohr mit 300 L FACS Puffer.
HINWEIS: Wenn MCS-Sortierung bevorzugt wird, können CD11b Perlen verwendet werden, um Mikroglia und andere myeloische Zellen nach Myelin-Entfernung auszuwählen. Diese Zellen können dann für nicht-plattenbasierte scRNA-seq sowie Bulk-RNA-seq verwendet werden. Der Vorbehalt dieses alternativen Ansatzes ist, dass CD11b Perlen Mikroglia nicht von anderen verwandten Immunzellen trennen, die auch positiv für dieses Antigen sind.
5. Färbung für fluorescence-aktivierte Zellsortierung
HINWEIS: Dieser Schritt sollte ca. 40 min dauern.
- Fügen Sie in jedem Rohr 5 L Der Maus-Fc-Rezeptoren-Blockreagenz (Materialtabelle) hinzu. 5 min auf Eis inkubieren.
- Fügen Sie in jedem Rohr 1 L CD45-PE-Cy7 und 1 L CD11b-BV421 hinzu.
HINWEIS: Es können Antikörper mit anderen konjugierten Fluorophoren verwendet werden. Antikörper gegen TMEM119, einen spezifischen Marker für die panostatische Mikroglia9, können ebenfalls enthalten sein, es wird jedoch empfohlen, zusammen mit CD45 und CD11b verwendet zu werden, da bestimmte Mikroglia-Subpopulationen die TMEM119-Oberflächenexpression verlieren können. - Inkubieren Sie die Rohre auf einem Shaker für 10 min bei Raumtemperatur (RT).
- Fügen Sie 2 ml FACS-Puffer zum Waschen hinzu.
- Pelletzellen bei 4 °C, 400 x g für 5 min. Langsam überwasseren überstand und tupfen sie den Rand des Rohres auf Tissuepapier aus. Resuspend-Zellen in jedem Röhrchen mit 400 L FACS-Puffer mit 1 L RNase-Inhibitor und 0,5 l Propidiumjodid (PI, 1:1.000 Verdünnung).
6. Index FACS Sortierung
HINWEIS: Dieser Schritt sollte 1 h dauern.
- Nach dem Standard-FACS-Verfahren zeichnen Sie Tore basierend auf Streuung (ohne Schutt), Einzelzellen, lebende Zellen (PI-Negativ), Mikroglia und myeloische Zellen (CD45+, CD11b+).
HINWEIS: Typische mikrogliaale Zellen exprimieren CD45 auf niedrigeren Ebenen im Vergleich zu anderen grenzassoziierten Makrophagen, wie perivaskuläre und meningeale Makrophagen, und daher sollte das Gating auf CD45 Low CD11b+ ausreichen, wenn der Schwerpunkt der Forschung Genexpressionsprofile in diesen klassischen Mikroglia1,2sind. Bestimmte Teilmengen von Mikroglia können jedoch eine höhere CD45-Expression haben, und dies gilt insbesondere während der Entwicklung oder bei Krankheitszuständen. Um eine unvoreingenommene Analyse der mikrogliaalen Genexpression zu gewährleisten, können CD45 High- und CD45 Low-Immunophenotypen durch Indexsortierungseinstellung und beide Populationen, die für die Sequenzierung und nachgelagerte Analyse gesammelt werden, aufgezeichnet werden. Darüber hinaus kann die TMEM119-Oberflächenexpression verwendet werden, um die panostatische mikrogliaale Population anzusprechen (siehe Schritt 5.2) und zusammen mit CD45-Spiegeln und den Sequenzierungsergebnissen analysiert werden. - Sortieren Sie einzelne Mikroglia (mit einer 100-m-Düse) in 96-Well-Polymerase-Kettenreaktionsplatten (PCR), die jeweils 4 L Lysepuffer enthalten (Details siehe das veröffentlichte Protokoll14).
HINWEIS: Das External RNA Control Consortium (ERCC) RNA Spike-in Mix (Table of Materials) kann bei 1:2.4 x 107 im Lysepuffer für Qualitätskontrolle und Normalisierung hinzugefügt werden2. - Kurz wirbeln die Platten und drehen Sie sich mit einer Tischzentrifuge nach unten.
- Die Proben sofort auf Trockeneis einfrieren. Bewahren Sie die Platten bei -80 °C bis zur Bibliotheksvorbereitung auf.
HINWEIS: Alternativ können mehr Zellen in 1,5 ml-Röhren mit RNA-Extraktionspuffer für Bulk-RNA-seq gesammelt werden. Nach den Erfahrungen der Autoren reichen 3.000 Zellen aus, um Bibliotheken von guter Qualität nach dem veröffentlichten Protokoll2,14zu generieren.
7. Einzellige RNA-Sequenzierung Bibliothek Vorbereitung
HINWEIS: Hier wird dem veröffentlichten Protokoll14 gefolgt, um scRNA-seq-Bibliotheken mit Hilfe von Flüssigkeitshandhabungsrobotik und einigen Modifikationen zu generieren. In diesem Artikel wird das Verfahren nur kurz beschrieben, und die Unterschiede werden hervorgehoben. Die Gleichzeitige Verarbeitung von 4 Platten dauert ca. 2,5 Tage.
- Platten auf Eis auftauen und Reverse-Transkription mit Oligo-dT30VN-Primer (im Lysepuffer) durchführen, um cDNA mit thermischen Cyclern zu erzeugen (Tabelle 1): 42 °C 90 min; 70 °C 5 min; 4 °C halten. Verstärken Sie dann cDNA mit einem zusätzlichen Exonuklease-Verdauungsschritt am Anfang (Tabelle 2) mit dem PCR-Master-Mix und In-situ-PCR-Grundierungen(Materialtabelle) und der folgenden PCR-Bedingung: 37 °C 30 min; 95 °C 3 min; 23 Zyklen von 98 °C 20 s, 67 °C 15 s, 72 °C 4 min; 72 °C 5 Min.
- Reinigen Sie cDNA mit 18 l Magnetperlen pro Brunnen (0,7:1 Verhältnis). Inkubieren Sie die Platte auf einem magnetischen Ständer für 5 min und waschen Sie Proben zweimal mit frisch hergestelltem 80% Ethanol, 80 l pro Brunnen jedes Mal. Nach dem Trocknen der Platte für 15-20 min, elute cDNA mit 20 l Elutionspuffer pro Brunnen.
HINWEIS: Verwenden Sie zur Qualitätskontrolle einen Fragmentanalysator (hochempfindliche Sequenzierung [NGS] der nächsten Generation, 1,6.000 bp), um Größenverteilungen und CDNA-Konzentrationen zu überprüfen, und nur weitere Prozessproben mit einem Abstrich zwischen 500 und 5.000 bp und höher als 0,05 ng/l. - Um Bibliotheken zu erzeugen, mischen Sie 0,4 l jeder cDNA-Probe mit 1,2 L Tn5-Tagmentationsreagenzien aus dem Bibliotheksvorbereitungskit (Tabelle der Materialien) in einer 384-Well-Platte mit Hilfe einer Nanoliter-Pipettiermaschine, bei 55 °C 10 min.
HINWEIS: Hierbei wird 1/12,5 des vorgeschlagenen Reaktionsvolumens (5 l Probe und 15 l Tagmentationsreagenzien) zugegeben, um die Kosten zu senken und gleichzeitig den Durchsatz zu erhöhen. Eine Nanoliter-Pipettiermaschine(Tabelle der Materialien) wird verwendet, um Reagenzien (diese und folgende Schritte) von und auf 384-Well-Platten zu übertragen. - Fügen Sie 0,4 l Neutralisationspuffer hinzu, um die Tagmentationsreaktion bei RT für 5 min zu stoppen.
- Fügen Sie 384 Indizes(Materialtabelle, 0,4 l vorwärts und 0,4 l rückwärts), 1,2 l PCR-Mix zu Samples (jeweils 2 l) hinzu und verstärken Sie die Bibliotheken unter folgender Bedingung: 72 °C 3 min; 95 °C 30 s; 10 Zyklen von 95 °C 10 s, 55 °C 30 s, 72 °C 1 min; 72 °C 5 Min.
- Bündeln Sie alle einzelnen Bibliotheken (jeweils 1 L) aus derselben 384-Well-Platte zusammen und verwenden Sie magnetische Perlen(Tabelle der Materialien, 0,7:1-Verhältnis), um die endgültigen gepoolten Bibliotheken zu reinigen.
- Verwenden Sie ein Fluorometer (Materialtabelle), um die Konzentrationen zu messen, und einen Bioanalysator (Materialtabelle), um die Größenverteilungen von gepoolten Bibliotheken vor der Sequenzierung zu untersuchen. Richten Sie die Sequenzierungstiefe auf 1 Million Rohlesevorgänge pro Zelle aus.
- Befolgen Sie die standardmäßigen bioinformatischen Verfahren, um Sequenzierungslesevorgänge zu filtern und zu trimmen und Ausrichtung2durchzuführen. Verwenden Sie die Zähltabelle und die Metadaten als Eingaben, um Clusteranalysen mit dem Seurat-Paket15durchzuführen.
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Representative Results
Dieses Protokoll beschreibt eine Methode, um Mikroglia aus verschiedenen Hirnregionen in einer erwachsenen perfundierten Gehirnhälfte zu isolieren und zu sortieren, gefolgt von scRNA-seq. Wir verwenden Douncing, um einzellige Suspension zu erstellen und auch als ersten Schritt, um Mikroglia zu bereichern. Unzureichende oder überdouncing reduziert die Ausbeute. Darüber hinaus enthalten erwachsene Mausgehirne hohe Myelinspiegel, die auch die Sortiereffizienz reduzieren und nachgeben können, wenn sie nicht richtig entfernt werden. Daher untersuchen wir die Zellsuspension unter dem Mikroskop mit Trypanblau und einem Hämozytometer, um die Ausbeute, Zelllebensfähigkeit und Wirksamkeit der Myelinentfernung (Schritt 4.9) vor der Durchführung von Antikörperfärbungen zu schätzen (Abbildung 1). Die Gesamtzahl der Zellwerte sollte zu diesem Zeitpunkt über 30.000 für Kortex und über 5.000 für andere Gewebe betragen. Über 90% der Zellen sollten mit wenig Myelin-Trümmern lebensfähig sein.
Wir verwenden eine FACS-Maschine, um Mikroglia (oder myeloide Zellen) zu sortieren, die typischerweise CD45 niedrig und CD11b positiv sind. Zumindest für das kortikale Gewebe sollte eine erfolgreiche Isolierung über 80% Mikroglia aus allen lebenden Einzelzellen erzeugen (Abbildung 2). Die sterbende/tote Bevölkerung macht nur einen kleinen Bruchteil der Zubereitung aus (etwa 10%).
Sobald einzelne Mikroglia in den Lysepuffer eingefangen werden, wird RNA freigesetzt und anschließend in cDNA umgeschrieben, die dann für 23 Zyklen verstärkt wird. Es ist wichtig, die Qualität dieser cDNA-Beispiele – zumindest einen Teil davon – zu überprüfen, bevor Sie Bibliotheken erstellen. Als Kapillarelektrophorese-Plattform liefern der Fragmentanalysator und die hochempfindlichen NGS-Fragmentkits (1-6.000 bp) schnelle und genaue Informationen über die Größenverteilung sowie die Menge der cDNA-Moleküle, die in jedem Brunnen einer 96-Well-Platte vorhanden sind (Abbildung 3A). Für die Herstellung von Bibliotheken können Proben verwendet werden, die einen Abstrich (500 x 5.000 bp) und einen bestimmten Konzentrationsschwellenwert (z. B. 0,05 ng/l) zeigen. Ebenso sollten die gepoolten Bibliotheken vor der Sequenzierung auf einem Bioanalyzer getestet werden (Abbildung 3B).
Wir sequenzieren die Proben bis zu einer Tiefe von über 1 Million Rohlesevorgängen pro Zelle, was die Detektionsleistung dieser scRNA-seq-Methodik16sättiert. Mit einer Kartierungsrate von etwa 60 % können über 2.000 Gene pro Mikroglialzelle nachgewiesen werden. Wir haben veröffentlichte Daten erhalten, die mit dieser Isolationsmethode17erzeugt wurden, und haben ihre Reproduzierbarkeit aus unabhängigen Experimenten und Empfindlichkeiten für den Nachweis mikrogliaspezifischer Gene in der sequenzierten Population nachgewiesen (Abbildung 4).
Abbildung 1: Schätzung der Mikroglia-Isolationsausbeute, Zelllebensfähigkeit und Effizienz der Myelinentfernung. Das linke Panel zeigte das helle Feldbild (4x Vergrößerung) von Trypanblau-Gefärbten Zellen (aus DemKorte), nachdem sie Durchquerung von Myelinentfernungssäulen durchlaufen hatte. Die Ergebnisse für andere Regionen würden ähnlich aussehen, aber mit weniger Zellen. Die überwiegende Mehrheit (wenn nicht alle) der Zellen erschien hell (nicht-gefärbt) und rund aufgrund des Verlusts von Prozessen. Das richtige Bild war das Zoom-In (20x) des Boxbereichs und kleine Myelin-Trümmer waren vorhanden. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.
Abbildung 2: Tore, die zum Sortieren von Mikroglia verwendet werden. Die Daten zeigten die Gating-Strategie für die Sortierung von Mikroglia aus dem Kortex, und die gleiche Strategie wurde für andere Regionen verwendet. Zellablagerungen wurden zunächst aus dem Streudiagramm ausgeschlossen, und einzelne Zellen wurden durch Vorwärtsstreufläche (FSC-A)/Vorwärtsstreubreite (FSC-W) abgegrenzt. Lebende Zellen wurden durch PI-negativer Färbung eingezäutt, die aus etwa 90% aller Einzelzellen stammten. Microglia, die etwa 80% der lebenden Zellen repräsentiert, wurden aus dem CD45 Low CD11b+ Gate sortiert. Insgesamt konnten 30.000 Mikroglia isoliert und aus dem Kortexgewebe (aus einer Hemisphäre einer drei Monate alten Maus) sortiert werden. Die Indexsortierung wurde auf einem FACS-Computer durchgeführt. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.
Abbildung 3: Repräsentative Qualitätskontrollergebnisse für verstärkte cDNA aus einer einzigen mikroglialen Zelle und einer eventuell gepoolten Bibliothek. (A) Mit Hilfe eines Fragmentanalysators werden alle Fragmente mit ihren Größen auf der X-Achse und der relativen Fluoreszenzintensität auf der Y-Achse dargestellt, was die Häufigkeit einer bestimmten cDNA-Größe bedeutet. LM (unterer Marker, 1 bp) und UM (obere Marker, 6.000 bp) sind Lademarker mit bekannten Konzentrationen, die zur Messung der cDNA-Menge verwendet werden. Erfolgreich verstärkte cDNA aus einer repräsentativen Mikrogliazelle bildet eine Kurve (grüne gepunktete Linie) auf dem Größenverteilungsdiagramm oder einen Abstrich (beschriftete Halterung) auf dem Geldiagramm zwischen 500 bp und 5.000 bp. Andere markierte Peaks wurden durch ERCC-Spike-in-Moleküle oder ribosomale RNA verstärkt. Die Konzentration von cDNA zwischen 500 bp und 5.000 bp kann quantifiziert werden, und proben mit Konzentrationen von mehr als 0,05 ng/l und deren typische Kurven werden für die Bibliotheksvorbereitung beibehalten. RFU, relative Fluoreszenzeinheit. (B) Repräsentatives Qualitätskontrollergebnis auf einem Bioanalyzer, der die Größenverteilung einer endgültigen gepoolten Bibliothek (mit etwa 380 Zellen) anzeigt. In der Regel reicht es von 200 bp bis 2.000 bp mit einer durchschnittlichen Größe von 400 bis 600 bp. Die beiden scharfen Gipfel waren Lademarkierungen. FU, Fluoreszenzeinheit. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.
Abbildung 4: scRNA-seq-Analyse von Mikroglia isoliert aus 4 Hirnregionen von zwei männlichen Mäusen. (A) tSNE-Diagramm, das vermischtes Muster regionaler Mikroglia zeigt (nur Zellen aus maus#1 hervorgehoben). Sie bilden keine unterschiedlichen Cluster nach Regionenursprung enden, die über die subtile Verschiebung in konzentrierte Bereiche auf dem tSNE-Diagramm hinausgehen (möglicherweise aufgrund von Batch-Effekten). Diese Beobachtung steht im Einklang mit der begrenzten regionalen Heterogenität von Mikroglia, die auf der globalen Genexpression bei erwachsenen Mäusen basiert (siehe eine aktuelle Publikation2, um weitere Informationen zu diesem Thema zu erhalten). (B) tSNE-Diagramm mit überlappendem Muster von Mikroglia von zwei einzelnen Mäusen, die unabhängig verarbeitet wurden. Obwohl es kleine Batch-Effekte geben kann (Zellen, die sich in bestimmten Bereichen des Diagramms konzentrieren), bilden diese Zellen keine unterschiedlichen Cluster nach tierischem Ursprung. Dieses Ergebnis legt die Reproduzierbarkeit des Protokolls für den Vergleich von Daten zwischen Experimenten nahe. (C) Expression von Mikroglia-Signaturgenen, die von scRNA-seq mit einer Nachweisrate von über 95 % für bestimmte Marker wie Tmem119 und P2ry12und über 80 % Nachweisrate für bekannte Transkriptionsfaktoren wie Sall1 und Pu.1nachgewiesen wurden. Die Daten wurden aus der veröffentlichten Literatur17neu analysiert. (D) Bei der überwiegenden Mehrheit der isolierten Mikroglia fehlt es an Expression von Genen, die für andere Zelltypen spezifisch sind, wie Tubb3 (Neuronen), Aldh1l1 (Astrozyten), Gjb1 (Oligodendrozyten) und Tie1 (Endothelzellen). (E) Ausdruck von genbezogener mikrogliar ermöglichungsbedingter Aktivierung oder Stress. Klassische Marker, Tnf, Il1b, Nos2und Nfkb2, die niedrig ausgedrückt sind, werden oben angezeigt. Frühe Ansprechgene, Egr1 und Fos, werden unten angezeigt (siehe Diskussion). Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.
| Reagenz | Volumen (L) |
| Zelllyse | 4 |
| Reverse Transkriptase (100 U/L) | 0.95 |
| Rnase-Inhibitor | 0.25 |
| 5x Erster Strangpuffer | 2 |
| Dithiothreitol (DTT; 100 mM) | 0.5 |
| Betain (5 M) | 2 |
| MgCl2 (1 M) | 0.06 |
| Template-Schalter-Oligo (TSO; 100 M) | 0.1 |
| H2O | 0.14 |
| gesamt | 10 |
Tabelle 1: Transkriptionsbedingung umkehren. Reagenzvolumina für eine Reverse-Transkriptionsreaktion werden bereitgestellt.
| Reagenz | Volumen (L) |
| Reverse Transkriptionsprodukt | 10 |
| 2x PCR-Master-Mix | 12.5 |
| ISPCR-Grundierung (10 m) | 0.25 |
| Lambda exonuclease | 0.1125 |
| H2O | 2.1375 |
| gesamt | 25 |
Tabelle 2: PCR-Verstärkungszustand. Reagenzvolumina für eine PCR-Verstärkung von cDNA aus einer einzelnen Zelle werden bereitgestellt.
| Plattenbasiert (dieses Protokoll) | Tröpfchenbasis (10x Genomik) | |
| Empfindlichkeit | Mehr Gene nachgewiesen | Weniger Gene nachgewiesen |
| Volle Länge | Ja | Nein (5' oder 3' Ende) |
| Flexibilität für Zellnummern/Populationen | Geeignet für die Charakterisierung kleiner oder seltener Subpopulationen | Geeignet für eine breite Kategorisierung großer Zellpopulationen |
| Durchsatz | Bis zu mehreren tausend Zellen | Hunderte bis Zehntausende Zellen |
| Eindeutiger molekularer Identifikator | Nein | Ja |
| Kosten pro Zelle | $1$$5 | weniger als 1 $ |
| Experimentelle Schwierigkeit | Mehr Schritte und in der Regel erfordern Flüssigkeitshandhabung Robotik | Einfache Ausführung mit kommerzialisierten Maschinen |
| Zellpopulationen | Gezielt durch FACS-Sortierung | Unvoreingenommene |
Tabelle 3: Vergleich zwischen plattenbasierten und tröpfchenbasierten scRNA-seq-Methoden. In diesem Artikel wird das plattenbasierte scRNA-seq-Verfahren in voller Länge bereitgestellt, das die Vorteile einer höheren Empfindlichkeit, einer sequenzierenden Sequenzierung in voller Länge und Flexibilität für eine kleine Anzahl von Zellen als Eingänge bietet. Droplet-basierte Methoden bieten die Vorteile eines höheren Durchsatzes, niedrigerer Kosten, einfacher Ausführung und Daten in einzigartigen molekularen Identifikatoren. Sie ergänzen sich je nach Zweck der Experimente.
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Discussion
Mikroglia interagieren aktiv mit anderen Zelltypen im ZNS und sind sehr empfindlich auf Umweltreize reagieren. Um Entzündungsreaktionen und abnorme Veränderungen in ihrer Genexpression während des Isolationsprozesses zu minimieren, wurde dieses Protokoll von einer zuvor veröffentlichten Methode9gestrafft und ist nun geeignet, Mikroglia aus mehreren Regionen einer einzelnen Maushirnhälfte parallel zu isolieren. Die Gewebe und Reagenzien werden bei kalter Temperatur gehalten und Experimente werden zeitnah (ca. 3,5 h von der Zerlegung bis zur Sortierung) mit weniger Wassen und weniger Reagenzien auf der Grundlage begrenzter Gewebegrößen durchgeführt. Wir entscheiden uns für andere Homogenisierungsmethoden, wie die enzymatische Verdauung, weil mechanische Dissoziation Neuronen und andere Gliazellen abtöten und damit entfernen kann, während sie wenig Schaden oder Aktivierung an Microglia9,18verursacht. Überdouncing kann jedoch die Ausbeute von Mikroglia verringern und sollte vermieden werden. Es wurde bereits gezeigt, dass mechanische Dissoziation und Perlen-basierte Myelin-Entfernung gefolgt von FACS-Sortierung weniger Aktivierung zu Mikroglia einführen, basierend auf minimaler Expression von klassischen entzündlichen Genen, z.B. Tnf, Il1b, Nos2und Nfkb29 (Abbildung 4E). Dennoch könnte Mikroglia immer noch auf die Ex-vivo-Bedingungen während der Dissoziation und Sortierung reagieren, indem sie frühe Reaktionsgene wie Fos und Egr1 (Abbildung 4E) hochregulieren, die normalerweise nicht durch Mikroglia in vivo2,19, ausgedrückt werden, und solche Veränderungen aus transkriptomischen Studien sollten immer in histologischen Abschnitten validiert werden.
Hier bieten wir Verfahren zur Isolierung von Mikroglia aus Kortex, Kleinhirn, Hippocampus und Striatum aus einer erwachsenen Maus Gehirnhälfte, und dieses Protokoll kann leicht an andere Regionen oder Stadien angepasst werden. Dies ist nützlich für Situationen, zum Beispiel, wenn krankheitsbetroffene Mikroglia auf bestimmte Bereiche des Gehirns beschränkt sind, die ausseziert werden können, oder in Alterungsstudien, in denen das Poolen von Proben aufgrund signifikanter individueller Variationen ungeeignet ist. Mit der Verfügbarkeit von Antikörpern gegen mikrogliale (oder pan angeborene Immun) Epitope könnte dieses Protokoll auch für die Isolierung von Mikroglia in Ratten- oder menschlichen Geweben angepasst werden9. Bei der Anpassung an größere oder ältere Gewebe ist es wichtig, das Volumen der Myelinentfernungsperlen und die Art der verwendeten Säulen zu berücksichtigen und zu testen. Ein alternativer Ansatz zur Myelinentfernung ist die Dichtegradientenzentrifugation in kommerziellen Low-Viskositätsmedien20. Insgesamt sind diese beiden Methoden in ihrer Effizienz vergleichbar, obwohl die Methode der Dichtegradientenzentrifugation etwas höhere Erträge liefern kann, und andererseits ist die Methode der magnetischen Perlen weniger wahrscheinlich, Endotoxine einzuführen, die Mikroglia21,22aktivieren können.
Aufgrund des geringen Anteils an Mikroglia unter den gesamten Gehirnzellen ist es oft wichtig, Mikroglia vor der Durchführung einzelliger transkriptomischer Studien anzureichern oder zu reinigen. Wir verwenden FACS als sensiblen Ansatz, um schwach dargestellte Zelltypen zu erfassen, und wählen Mikroglia basierend auf CD11b und CD45-Oberflächenexpression aus. Aus einer Hemisphäre erhalten wir routinemäßig 30.000 Mikroglia für Kortex und 5.000 US-Mikroglia für Kleinhirn, Hippocampus oder Striatum. Diese Erträge sind ausreichend für die meisten einzelligen Anwendungen sowie Bulk-RNA-seq (3.000 oder mehr Zellen können verwendet werden). Es ist erwähnenswert, dass Mikroglia DIE CD45-Immunreaktivität während der Entwicklung oder Krankheit2hochregulieren kann, wobei Zellen mit niedrigem und hohem CD45-Gehalt aufgezeichnet und indexsortiert werden sollten. Eine weitere Möglichkeit zur Anreicherung von Mikroglia ist die Verwendung von CD11b-Perlen-vermittelten magnetisch-aktivierten Zellsortierung nach Myelinentfernung, aber dies würde scRNA-seq auf Tröpfchenmethoden beschränken.
Um die mikrogliale Genexpression bei einzelzelliger Auflösung zu untersuchen, sortieren wir Zellen in der Regel in mindestens 2-3 96-Well-Platten pro Probe und führen die Bibliotheksvorbereitung mit Flüssigkeitshandhabungsmaschinen durch. Es hat sich gezeigt, dass dieser plattenbasierte Bibliotheksvorbereitungsansatz eine der sensibelsten scRNA-seq-Methoden bei der Nachweisgrenze ist und eine genaue Quantifizierung seltener Transkripte wie Transkriptionsfaktoren13,14,16ermöglicht. Aufgrund der Sequenzierung in voller Länge unterliegt dieser Ansatz nicht einer 5' oder 3' Voreingenommenheit und kann zur Analyse von Spleißvarianten verwendet werden (Tabelle 3). Darüber hinaus hat dieses plattenbasierte Protokoll im Gegensatz zu tröpfchenbasierten Methoden, die in der Regel Hunderte oder Tausende von Zellen in einer Reaktion erfordern, die Flexibilität, eine kleine Anzahl von Zellen in jedes Experiment einzubeziehen und die Populationsgröße schrittweise zu erweitern, indem später mehr Platten in das Design eingefügt werden. Dies ist vorteilhaft, wenn man kleine Teilmengen von Mikroglia unter bestimmten Bedingungen wie der embryonalen Entwicklung untersucht.
Während dieses Protokoll reproduzierbar hochwertige scRNA-seq-Bibliotheken für regionale Mikroglia des Gehirns erzeugt, ist es aufgrund der relativ hohen Kosten oft nur für kleine Studien geeignet (ca. 5 USD/Zelle für die Bibliotheksvorbereitung, immer noch billiger als 23 USD/Zelle, wenn Sie das SmartSeq v4-Kit aus dem Regal verwenden). Mehrere Strategien können dazu beitragen, die Kosten zu senken und den Durchsatz zu erhöhen. Zunächst können Zellen in 384-Well-Platten mit nur 0,5 l Lysepuffer sortiert werden, und dies erfordert nur 1/8 Volumen reagenzien für die anfängliche Naktranskriptions- und PCR-Verstärkungsschritte. Zweitens ist es möglich, hauseigene Tn5-Transposase zu produzieren, die eine ähnliche Qualität wie die in einem handelsüblichen Kit23hat. Diese beiden Änderungen könnten die Kosten für die Bibliotheksvorbereitung auf 1 USD/Zelle reduzieren. Drittens können mithilfe angepasster Indizes Tausende von Zellen für die Sequenzierung auf einem System zusammengepoolt werden, ohne die Sequenzierungstiefe (>1 Million Lese-/Zellen) zu opfern17. Diese Verbesserungen zusammen mit der Integration von automatisierten Flüssigkeitshandhabungsrobotern ermöglichen einen tiefen Seq-Bereich mit hohem Durchsatz, der aus fast allen definierten Regionen isoliert ist.
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Disclosures
Die Autoren haben nichts zu verraten.
Acknowledgments
Wir danken Mariko L. Bennett, Liana Nicole Bonanno und Spyros Darmanis für ihre Hilfe bei der Entwicklung dieses Protokolls. Wir danken auch der Stanford Shared FACS Facility, insbesondere Meredith Weglarz und Lisa Nichols; Yen Tran, Michael Eckart von Stanford Protein and Nucleic Acid Facility (PAN) für ihre große Unterstützung bei den Dreharbeiten. Diese Arbeit wird von der JPB Foundation und der Vincent J. Coates Foundation finanziert.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 5 M Betaine | Sigma-Aldrich | Cat# B0300-5VL | |
| 10 mM dNTP mix | Thermo Fisher Scientific | Cat# R0192 | |
| 0.5 M EDTA, pH 8.0 | Thermo Fisher Scientific | Cat# 15575020 | |
| 10X Hanks’ Balanced Salt Solution | Thermo Fisher Scientific | Cat# 14185-052 | |
| 1 M HEPES | Thermo Fisher Scientific | Cat# 15630080 | |
| 1X KAPA HIFI Hotstart Master Mix | Kapa Biosciences | Cat# KK2602 | |
| 5 mL Round Bottom Polystyrene Tube, with Cell Strainer Cap | Corning | Cat# 352235 | |
| AATI, High Sensitivity NGS Fragment Analysis Kit (1 bp – 6,000 bp) | Advanced Analytical | Cat# DNF-474-1000 | |
| Bovine Serum Albumin | Sigma Aldrich | Cat# A8806 | |
| DNase I | Worthington | Cat# LS002007 | Working solution: 12500 units/ml |
| DTT, Molecular Grade | Promega | Cat# P1171 | |
| ERCC RNA Spike-In Mix | Thermo Fisher Scientific | Cat# 4456740 | |
| Fetal Bovine Serum | Thermo Fisher Scientific | Cat# 10437-028 | |
| Illumina XT Index Kit v2 Set A (96 indexes) | Illumina | Cat# FC-131-2001 | |
| Illumina XT Index Kit v2 Set B (96 indexes) | Illumina | Cat# FC-131-2002 | |
| Illumina XT Index Kit v2 Set C (96 indexes) | Illumina | Cat# FC-131-2003 | |
| Illumina XT Index Kit v2 Set D (96 indexes) | Illumina | Cat# FC-131-2004 | |
| Lambda Exonuclease (5 U/μl) | New England BioLabs | Cat# M0262S | |
| Mouse Fc block | BD Pharmingen | Cat# 553142 | |
| Myelin removal beads | Miltenyl Biotec | Cat# 130-096-433 | |
| Nextera XT DNA Sample Prep Kit | Illumina | Cat# FC-131-1096 | |
| NextSeq 500/550 High Output Kit v2.5 (150 Cycles) | Illumina | Cat# 20024907 | |
| PBS (10X), pH 7.4 | Thermo Fisher Scientific | Cat# 70011044 | |
| PCRClean DX beads | Aline Biosciences | Cat# C-1003-50 | |
| Propidium Iodide | Thermo Fisher Scientific | Cat# P3566 | Staining: 1:1000 |
| Qubit dsDNA HS Assay Kit | Thermal Fisher Scientific | Cat# Q32851 | |
| Rat monoclonal anti mouse/human CD11b, Brilliant Violet 421 (clone M1/70) | BioLegend | Cat# 101236; RRID: AB_11203704 | Staining: 1:300 |
| Rat monoclonal anti mouse CD45, PE/Cy7 (clone 30-F11) | Thermo Fisher Scientific | Cat# 25-0451-82; RRID: AB_469625 | Staining: 1:300 |
| Recombinant RNase Inhibitor | Takara Bio | Cat# 2313B | |
| SMARTScribe Reverse Transcriptase (100 U/μl) | Clontech | Cat# 639538 | Containing 5x First strand buffer |
| Oligonucleotides | |||
| 0.1 μM ISPCR Oligo: 5' - AAGCAGTGGTATCAA CGCAGAGT-3' |
(Picelli et al., 2014) | ||
| Oligo-dT30VN primer: 5' - AAGCAGTGGTATCAACGCA GAGTACT 30 VN-3' |
(Picelli et al., 2014) | ||
| TSO 5' - AAGCAGTGGTATCAACGCAGA GTACATrGrG+G-3' ("r" is forribobases and "+" is for an LNA base) |
(Picelli et al., 2014) | ||
| Solutions | |||
| FACS buffer | Recipe: sterile-filtered 1% FBS, 2 mM EDTA, 25 mM HEPES in 1X PBS | ||
| MCS buffer | Recipe: sterile-filtered 0.5% BSA, 2 mM EDTA in 1X PBS | ||
| Medium A | Recipe: 15 mM HEPES, 0.5% glucose in 1X HBSS without phenol red | ||
| Plates | |||
| 384-well Rigi-Plate PCR Microplates, Axygen Scientific | VWR | 89005-556 | |
| Hard-shell 96-well PCR plates | Bio-Rad | HSP9631 | |
| Others | |||
| Dumont #55 forceps | Fine Science Tools | 11295-51 | |
| Dounce homogenizer, 2 ml | Wheaton | 357422 | |
| Large depletion column | Miltenyi Biotec | 130-042-901 | |
| Large selection column | Miltenyi Biotec | 130-042-401 | |
| MACS MultiStand | Miltenyi Biotec | 130-042-303 | |
| QuadroMACS Separator | Miltenyi Biotec | 130-090-976 | |
| RNAzap | Thermo Fisher Scientific | AM9780 | |
| Strainer (70 μm) | Falcon | 352350 | |
| Equipment | |||
| BD FACSAria II | BD Biosciences | http://www.bdbiosciences.com/ | |
| Bioanalyzer | Agilent | 2100 | |
| Fragment Analyzer | Agilent | 5300 | |
| Mosquito HTS nanoliter pipetting robot | TTP Labtech | https://www.ttplabtech.com/ | |
| Qubit 4 Fluorometer | Thermo Fisher Scientific | Q33226 |
References
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