Isolamento da Microglia específica da Região de um hemisfério cerebral de camundongo adulto para sequenciamento profundo de RNA unicelular
Summary
Nós fornecemos um protocolo para o isolamento da microglia de diferentes regiões dissecadas de um hemisfério cerebral de camundongo adulto, seguido de preparação de biblioteca semi-automatizada para sequenciamento profundo de RNA unicelular de transcrições completas. Este método ajudará a elucidar a heterogeneidade funcional da microglia na saúde e na doença.
Abstract
Como macrófagos residentes no sistema nervoso central, microglia controlar ativamente o desenvolvimento do cérebro e homeostase, e suas disfunções podem conduzir doenças humanas. Avanços consideráveis foram feitos para descobrir as assinaturas moleculares da microglia homeostática, bem como alterações de sua expressão gênica em resposta a estímulos ambientais. Com o advento e maturação de metodologias genômicas unicelulares, é cada vez mais reconhecido que a microglia heterogênea pode estar subjacente aos diversos papéis que desempenham em diferentes condições de desenvolvimento e patológicas. Uma dissecção mais adicional de tal heterogeneity pode ser conseguida com a isolação eficiente do microglia de uma região de interesse dada, seguida pelo perfil sensível de pilhas individuais. Aqui, nós fornecemos um protocolo detalhado para o rápido isolamento da microglia de diferentes regiões cerebrais em um único hemisfério cerebral adulto do rato. Também demonstramos como usar essas microglias classificadas para sequenciamento de RNA de células únicas profundas à base de placa. Discutimos a adaptabilidade deste método a outros cenários e fornecemos diretrizes para melhorar o sistema para acomodar estudos em larga escala.
Introduction
Microglia, representando 5%−10% de todas as células neurais, são macrófagos residentes espalhados por todo o sistema nervoso central (SNC)1. Protegido atrás de barreira sangue-cérebro, microglia típica em um cérebro adulto saudável contêm muitos processos finos que se estendem rapidamente e se retraem para interagir com neurônios e outras células gliais na parenchyma. Microglia também pode adotar a morfologia ameboiídea associada ao aumento da função fagocítica durante estágios específicos de desenvolvimento ou sobre desafios imunológicos em lesão e doença1,2,3,4. Recentes descobertas emocionantes demonstraram claramente que a microglia não são de forma passiva para sinais patológicos ou derivados do cérebro, mas desempenham papéis fundamentais no controle do desenvolvimento cerebral e homeostase, por exemplo, apoiando a sobrevivência neuronal, podar sinapses imaturas, promover a diferenciação de células de linhagem de oligodendrocyte, bem como angiogênese1. À medida que mais funções da microglia são elucidadas, a excitação é ainda mais alimentada por estudos de genética humana, que mostraram que muitos genes de risco de doenças neurodegenerativas, como trem2, são predominantemente ou exclusivamente expressos pela microglia5,6,7. Dada a sua importância no desenvolvimento e plausíveis papéis de condução de doenças, um enorme esforço foi recentemente colocado para a nossa compreensão da regulação do gene microglial e função na esperança de encontrar novos alvos terapêuticos para doenças neurodegenerativas1,8.
O sequenciamento de RNA (RNA-seq) permite caracterização imparcial da expressão gênica específica do tipo celular, que por sua vez orienta os cientistas a investigar as funções gênicas em redes celulares densas7. RNA-seq tinha sido feito principalmente em amostras a granel, levando à descoberta de uma assinatura do gene microglial homeostático que os distingue de outras células neurais e imunes9. No entanto, tal abordagem poderia ignorar as diferenças moleculares e funcionais entre a microglia, especialmente aqueles que estão transitoriamente presentes no desenvolvimento, ou associados ao envelhecimento e à doença. Na verdade, rna-seq de célula única (scRNA-seq) oferece a sensibilidade e resolução que revolucionaram o campo, revelando a heterogeneidade anteriormente subestimada da microglia em uma variedade de contextos2,3,10. Além disso, devido à presença de outras células imunes semelhantes na interface de circulação do SNC, a scRNA-seqs fornece informações que auxiliam o projeto de novas ferramentas para separar e dissecar funcionalmente essas células relacionadas com pouco conhecimento prévio2,11.
Uma disposição diversa de plataformas do scRNA-seq foi inventada, cada um apropriada para determinadas aplicações12. Em geral, os métodos baseados em gotículas, como 10x Genômica, são mais elevados em taxa de rendimento com (dezenas de) milhares de células sequenciadas em cada corrida, e são menos seletivas para a entrada que pode conter populações de células mistas que exigem uma categorização ampla. Métodos baseados em placas fornecem maior sensibilidade e ler profundidade13,14, geralmente visando populações específicas de classificação celular para revelar diferenças sutis ou transcrições raras. Dada a pequena porcentagem de células microgliais, particularmente aquelas subpopulações associadas ao desenvolvimento ou à doença, entre todos os tipos de células do SNC, muitas vezes é desejável isolar a microglia de uma região específica de interesse e obter informações transcriomicas profundas e completas para entender sua heterogeneidade.
Aqui, fornecemos detalhes sobre como isolar a microglia de diferentes regiões cerebrais do camundongo dissecadas de um único hemisfério, que são usados para RNA-seq de célulaúnica (ou a granel) após um procedimento de preparação de biblioteca semi-automatizado baseado em placa. O outro hemisfério pode então ser usado para validação histológica. Simplificado a partir de um método publicado anteriormente9,este protocolo de isolamento visa maximizar o rendimento de uma pequena quantidade de materiais de partida e, entretanto, manter perfis endógenos de expressão gênica microglial. Usamos a classificação celular ativada por fluorescência (FACS) para enriquecer a microglia (ou outras células imunes de interesse relacionadas) em placas de 96 poços e miniaturizar os volumes de reagentes para a preparação da biblioteca, a fim de aumentar a taxa de transferência. Destacamos essa plataforma scRNA-seq sensível, embora outras estratégias baseadas em placas possam ser aplicadas. Este método pode ser facilmente adaptado para isolar a microglia de outros tecidos dissecados, como lesões ou focos de doença, e a idade do rato pode variar em quase todos os estágios pós-natais. O isolamento eficiente da microglia regional para estudos de transcriptômica unicelular facilitará uma melhor compreensão de suas funções na saúde e na doença.
Protocol
Representative Results
Discussion
Microglia interage ativamente com outros tipos de células no SNC, e eles são muito sensíveis a estímulos ambientais. A fim de minimizar as respostas inflamatórias e as mudanças aberrantes em sua expressão gênica durante o processo de isolamento, este protocolo foi simplificado a partir de um método publicado anteriormente9, e agora é adequado para isolar microglia de várias regiões de um único hemisfério cerebral do rato em paralelo. Os tecidos e reagentes são mantidos em temperatur…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Agradecemos a Mariko L. Bennett, Liana Nicole Bonanno e Spyros Darmanis por sua ajuda durante o desenvolvimento deste protocolo. Agradecemos também à Instalação FACS Compartilhada de Stanford, particularmente Meredith Weglarz e Lisa Nichols; Yen Tran, Michael Eckart de Stanford Protein and Nucleic Acid Facility (PAN) por seu grande apoio para as filmagens. Este trabalho é financiado pela Fundação JPB e pela Fundação Vincent J. Coates.
Materials
| 5 M Betaine | Sigma-Aldrich | Cat# B0300-5VL | |
| 10 mM dNTP mix | Thermo Fisher Scientific | Cat# R0192 | |
| 0.5 M EDTA, pH 8.0 | Thermo Fisher Scientific | Cat# 15575020 | |
| 10X Hanks’ Balanced Salt Solution | Thermo Fisher Scientific | Cat# 14185-052 | |
| 1 M HEPES | Thermo Fisher Scientific | Cat# 15630080 | |
| 1X KAPA HIFI Hotstart Master Mix | Kapa Biosciences | Cat# KK2602 | |
| 5 mL Round Bottom Polystyrene Tube, with Cell Strainer Cap | Corning | Cat# 352235 | |
| AATI, High Sensitivity NGS Fragment Analysis Kit (1 bp – 6,000 bp) | Advanced Analytical | Cat# DNF-474-1000 | |
| Bovine Serum Albumin | Sigma Aldrich | Cat# A8806 | |
| DNase I | Worthington | Cat# LS002007 | Working solution: 12500 units/ml |
| DTT, Molecular Grade | Promega | Cat# P1171 | |
| ERCC RNA Spike-In Mix | Thermo Fisher Scientific | Cat# 4456740 | |
| Fetal Bovine Serum | Thermo Fisher Scientific | Cat# 10437-028 | |
| Illumina XT Index Kit v2 Set A (96 indexes) | Illumina | Cat# FC-131-2001 | |
| Illumina XT Index Kit v2 Set B (96 indexes) | Illumina | Cat# FC-131-2002 | |
| Illumina XT Index Kit v2 Set C (96 indexes) | Illumina | Cat# FC-131-2003 | |
| Illumina XT Index Kit v2 Set D (96 indexes) | Illumina | Cat# FC-131-2004 | |
| Lambda Exonuclease (5 U/μl) | New England BioLabs | Cat# M0262S | |
| Mouse Fc block | BD Pharmingen | Cat# 553142 | |
| Myelin removal beads | Miltenyl Biotec | Cat# 130-096-433 | |
| Nextera XT DNA Sample Prep Kit | Illumina | Cat# FC-131-1096 | |
| NextSeq 500/550 High Output Kit v2.5 (150 Cycles) | Illumina | Cat# 20024907 | |
| PBS (10X), pH 7.4 | Thermo Fisher Scientific | Cat# 70011044 | |
| PCRClean DX beads | Aline Biosciences | Cat# C-1003-50 | |
| Propidium Iodide | Thermo Fisher Scientific | Cat# P3566 | Staining: 1:1000 |
| Qubit dsDNA HS Assay Kit | Thermal Fisher Scientific | Cat# Q32851 | |
| Rat monoclonal anti mouse/human CD11b, Brilliant Violet 421 (clone M1/70) | BioLegend | Cat# 101236; RRID: AB_11203704 | Staining: 1:300 |
| Rat monoclonal anti mouse CD45, PE/Cy7 (clone 30-F11) | Thermo Fisher Scientific | Cat# 25-0451-82; RRID: AB_469625 | Staining: 1:300 |
| Recombinant RNase Inhibitor | Takara Bio | Cat# 2313B | |
| SMARTScribe Reverse Transcriptase (100 U/μl) | Clontech | Cat# 639538 | Containing 5x First strand buffer |
| Oligonucleotides | |||
| 0.1 μM ISPCR Oligo: 5' – AAGCAGTGGTATCAA CGCAGAGT-3' |
(Picelli et al., 2014) | ||
| Oligo-dT30VN primer: 5' – AAGCAGTGGTATCAACGCA GAGTACT 30 VN-3' |
(Picelli et al., 2014) | ||
| TSO 5' – AAGCAGTGGTATCAACGCAGA GTACATrGrG+G-3' ("r" is forribobases and "+" is for an LNA base) |
(Picelli et al., 2014) | ||
| Solutions | |||
| FACS buffer | Recipe: sterile-filtered 1% FBS, 2 mM EDTA, 25 mM HEPES in 1X PBS | ||
| MCS buffer | Recipe: sterile-filtered 0.5% BSA, 2 mM EDTA in 1X PBS | ||
| Medium A | Recipe: 15 mM HEPES, 0.5% glucose in 1X HBSS without phenol red | ||
| Plates | |||
| 384-well Rigi-Plate PCR Microplates, Axygen Scientific | VWR | 89005-556 | |
| Hard-shell 96-well PCR plates | Bio-Rad | HSP9631 | |
| Others | |||
| Dumont #55 forceps | Fine Science Tools | 11295-51 | |
| Dounce homogenizer, 2 ml | Wheaton | 357422 | |
| Large depletion column | Miltenyi Biotec | 130-042-901 | |
| Large selection column | Miltenyi Biotec | 130-042-401 | |
| MACS MultiStand | Miltenyi Biotec | 130-042-303 | |
| QuadroMACS Separator | Miltenyi Biotec | 130-090-976 | |
| RNAzap | Thermo Fisher Scientific | AM9780 | |
| Strainer (70 μm) | Falcon | 352350 | |
| Equipment | |||
| BD FACSAria II | BD Biosciences | http://www.bdbiosciences.com/ | |
| Bioanalyzer | Agilent | 2100 | |
| Fragment Analyzer | Agilent | 5300 | |
| Mosquito HTS nanoliter pipetting robot | TTP Labtech | https://www.ttplabtech.com/ | |
| Qubit 4 Fluorometer | Thermo Fisher Scientific | Q33226 | |
References
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