Isolement des microglies spécifiques à la région de l'hémisphère cérébral d'une souris adulte pour le séquençage profond de l'ARN à une seule cellule
Summary
Nous fournissons un protocole pour l’isolement des microglies de différentes régions disséquées d’un hémisphère de cerveau de souris adulte, suivi de la préparation semi-automatisée de bibliothèque pour le séquençage profond d’ARN unicellulaire des transcriptomes pleine longueur. Cette méthode aidera à élucider l’hétérogénéité fonctionnelle des microglies dans la santé et la maladie.
Abstract
Comme macrophages résidents dans le système nerveux central, microglies contrôlent activement le développement du cerveau et l’homéostasie, et leurs dysfonctionnements peuvent conduire les maladies humaines. Des progrès considérables ont été réalisés pour découvrir les signatures moléculaires des microglies homéostatiques ainsi que des altérations de leur expression génique en réponse à des stimuli environnementaux. Avec l’avènement et la maturation des méthodologies génomiques unicellulaires, il est de plus en plus reconnu que les microglies hétérogènes peuvent sous-tendre les divers rôles qu’elles jouent dans différentes conditions développementales et pathologiques. Une dissection plus poussée d’une telle hétérogénéité peut être obtenue par un isolement efficace des microglies d’une région d’intérêt donnée, suivie d’un profilage sensible des cellules individuelles. Ici, nous fournissons un protocole détaillé pour l’isolement rapide des microglies de différentes régions du cerveau dans un seul hémisphère de cerveau de souris adulte. Nous démontrons également comment utiliser ces microglies triées pour le séquençage profond d’ARN à cellule profonde à base de plaque. Nous discutons de l’adaptabilité de cette méthode à d’autres scénarios et fournissons des lignes directrices pour améliorer le système afin de tenir compte des études à grande échelle.
Introduction
Les microglies, qui représentent 5 % à 10 % de toutes les cellules neurales, sont des macrophages résidents dispersés dans tout le système nerveux central (SNC)1. Protégées derrière la barrière hémato-encéphalique, les microglies typiques d’un cerveau adulte en bonne santé contiennent de nombreux processus fins qui s’étendent rapidement et se rétractent pour interagir avec les neurones et autres cellules gliales du parenchyme. Microglia peut également adopter la morphologie amoeboid associée à une fonction phagocytique accrue au cours de stades de développement spécifiques ou sur les défis immunitaires dans les blessures et la maladie1,2,3,4. De récentes découvertes passionnantes ont clairement démontré que les microglies ne sont en aucun cas des spectateurs passifs aux signaux dérivés du cerveau ou pathologiques, mais jouent un rôle central dans le contrôle du développement du cerveau et de l’homéostasie, par exemple, en soutenant la survie neuronale, en élagant des synapses immatures, en favorisant la différenciation des cellules de lignée d’oligodendrocytes ainsi qu’en angiogenèse1. Comme plus de fonctions de microglies sont élucidés, l’excitation est encore alimentée par des études de génétique humaine, qui ont montré que de nombreux gènes de risque de maladie neurodégénérative, tels que TREM2, sont principalement ou exclusivement exprimés par microglies5,6,7. Compte tenu de leur importance dans le développement et des rôles plausibles de la maladie-moteur, des efforts énormes ont été récemment mis en vue de notre compréhension de la régulation et de la fonction des gènes microglials dans l’espoir de trouver de nouvelles cibles thérapeutiques pour les maladies neurodégénératives1,8.
Le séquençage de l’ARN (ARN-seq) permet une caractérisation impartiale de l’expression génétique spécifique au type cellulaire, qui guide à son tour les scientifiques pour étudier les fonctions génétiques dans les réseaux cellulaires denses7. L’ARN-seq avait été principalement fait sur des échantillons en vrac, menant à la découverte d’une signature de gène microglial homéostatique qui les distingue des autres cellules neurales et immunitaires9. Cependant, une telle approche pourrait négliger les différences moléculaires et fonctionnelles entre les microglies, en particulier celles qui sont présentes de façon transitoire dans le développement, ou associées au vieillissement et à la maladie. En effet, l’ARN-seq unicellulaire (scRNA-seq) offre la sensibilité et la résolution qui ont révolutionné le domaine en révélant l’hétérogénéité précédemment sous-estimée des microglies dans une variété de contextes2,3,10. En outre, en raison de la présence d’autres cellules immunitaires similaires à l’interface de circulation du SNS, scRNA-seq fournit des informations aidant à la conception de nouveaux outils pour séparer et disséquer fonctionnellement ces cellules connexes avec peu de connaissances préalables2,11.
Une gamme variée de plates-formes scRNA-seq ont été inventées, chacune adaptée à certaines applications12. En général, les méthodes à base de gouttelettes, telles que la génomique 10x, sont plus élevées dans le débit avec (des dizaines de) milliers de cellules séquencées dans chaque course, et ils sont moins sélectifs pour l’entrée qui peut contenir des populations de cellules mixtes nécessitant une catégorisation large. Les méthodes basées sur les plaques fournissent une sensibilité plus élevée et lisent la profondeur13,14, ciblant habituellement des populations spécifiques du tri cellulaire pour révéler des différences subtiles ou des transcriptions rares. Étant donné le faible pourcentage de cellules microgliales, en particulier celles qui sont associées au développement ou à la maladie, parmi tous les types de cellules du SNC, il est souvent souhaitable d’isoler les microglies d’une région d’intérêt spécifique et d’obtenir des informations transcriptomiques profondes et complètes afin de comprendre leur hétérogénéité.
Ici, nous fournissons des détails sur la façon d’isoler les microglies de différentes régions du cerveau de souris disséqués à partir d’un seul hémisphère, qui sont utilisés pour une seule cellule (ou en vrac) ARN-seq suivant une procédure semi-automatisée de préparation de bibliothèque à base de plaques. L’autre hémisphère peut alors être utilisé pour la validation histologique. Simplifié à partir d’une méthode9déjà publiée, ce protocole d’isolement vise à maximiser le rendement à partir d’une petite quantité de matériaux de départ, et en attendant maintenir des profils d’expression microgliale endogène. Nous utilisons le tri des cellules activées par la fluorescence (FACS) pour enrichir les microglies (ou d’autres cellules immunitaires connexes d’intérêt) en plaques de 96 puits et miniaturiser les volumes de réactifs pour la préparation de la bibliothèque afin d’augmenter le débit. Nous mettons en évidence cette plate-forme sensible scRNA-seq, bien que d’autres stratégies basées sur les plaques puissent être appliquées. Cette méthode peut être facilement adaptée pour isoler les microglies d’autres tissus disséqués, tels que les blessures ou les foyers de la maladie, et l’âge de la souris peut varier selon presque tous les stades postnatals. L’isolement efficace des microglies régionales pour les études de transcriptomique unicellulaire facilitera une meilleure compréhension de leurs fonctions en santé et en maladie.
Protocol
Representative Results
Discussion
Les microglies interagissent activement avec d’autres types de cellules du SNC, et elles sont très sensibles aux stimuli environnementaux. Afin de minimiser les réponses inflammatoires et les changements aberrants dans leur expression génique au cours du processus d’isolement, ce protocole a été simplifié à partir d’une méthode publiée précédemment9, et il est maintenant approprié d’isoler les microglies de plusieurs régions d’un seul hémisphère du cerveau de souris en parallèle. L…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Nous remercions Mariko L. Bennett, Liana Nicole Bonanno et Spyros Darmanis pour leur aide lors de l’élaboration de ce protocole. Nous remercions également le Stanford Shared FACS Facility, en particulier Meredith Weglarz et Lisa Nichols; Yen Tran, Michael Eckart de Stanford Protein and Nucleic Acid Facility (PAN) pour leur grand soutien pour le tournage. Ce travail est financé par la Fondation JPB et la Fondation Vincent J. Coates.
Materials
| 5 M Betaine | Sigma-Aldrich | Cat# B0300-5VL | |
| 10 mM dNTP mix | Thermo Fisher Scientific | Cat# R0192 | |
| 0.5 M EDTA, pH 8.0 | Thermo Fisher Scientific | Cat# 15575020 | |
| 10X Hanks’ Balanced Salt Solution | Thermo Fisher Scientific | Cat# 14185-052 | |
| 1 M HEPES | Thermo Fisher Scientific | Cat# 15630080 | |
| 1X KAPA HIFI Hotstart Master Mix | Kapa Biosciences | Cat# KK2602 | |
| 5 mL Round Bottom Polystyrene Tube, with Cell Strainer Cap | Corning | Cat# 352235 | |
| AATI, High Sensitivity NGS Fragment Analysis Kit (1 bp – 6,000 bp) | Advanced Analytical | Cat# DNF-474-1000 | |
| Bovine Serum Albumin | Sigma Aldrich | Cat# A8806 | |
| DNase I | Worthington | Cat# LS002007 | Working solution: 12500 units/ml |
| DTT, Molecular Grade | Promega | Cat# P1171 | |
| ERCC RNA Spike-In Mix | Thermo Fisher Scientific | Cat# 4456740 | |
| Fetal Bovine Serum | Thermo Fisher Scientific | Cat# 10437-028 | |
| Illumina XT Index Kit v2 Set A (96 indexes) | Illumina | Cat# FC-131-2001 | |
| Illumina XT Index Kit v2 Set B (96 indexes) | Illumina | Cat# FC-131-2002 | |
| Illumina XT Index Kit v2 Set C (96 indexes) | Illumina | Cat# FC-131-2003 | |
| Illumina XT Index Kit v2 Set D (96 indexes) | Illumina | Cat# FC-131-2004 | |
| Lambda Exonuclease (5 U/μl) | New England BioLabs | Cat# M0262S | |
| Mouse Fc block | BD Pharmingen | Cat# 553142 | |
| Myelin removal beads | Miltenyl Biotec | Cat# 130-096-433 | |
| Nextera XT DNA Sample Prep Kit | Illumina | Cat# FC-131-1096 | |
| NextSeq 500/550 High Output Kit v2.5 (150 Cycles) | Illumina | Cat# 20024907 | |
| PBS (10X), pH 7.4 | Thermo Fisher Scientific | Cat# 70011044 | |
| PCRClean DX beads | Aline Biosciences | Cat# C-1003-50 | |
| Propidium Iodide | Thermo Fisher Scientific | Cat# P3566 | Staining: 1:1000 |
| Qubit dsDNA HS Assay Kit | Thermal Fisher Scientific | Cat# Q32851 | |
| Rat monoclonal anti mouse/human CD11b, Brilliant Violet 421 (clone M1/70) | BioLegend | Cat# 101236; RRID: AB_11203704 | Staining: 1:300 |
| Rat monoclonal anti mouse CD45, PE/Cy7 (clone 30-F11) | Thermo Fisher Scientific | Cat# 25-0451-82; RRID: AB_469625 | Staining: 1:300 |
| Recombinant RNase Inhibitor | Takara Bio | Cat# 2313B | |
| SMARTScribe Reverse Transcriptase (100 U/μl) | Clontech | Cat# 639538 | Containing 5x First strand buffer |
| Oligonucleotides | |||
| 0.1 μM ISPCR Oligo: 5' – AAGCAGTGGTATCAA CGCAGAGT-3' |
(Picelli et al., 2014) | ||
| Oligo-dT30VN primer: 5' – AAGCAGTGGTATCAACGCA GAGTACT 30 VN-3' |
(Picelli et al., 2014) | ||
| TSO 5' – AAGCAGTGGTATCAACGCAGA GTACATrGrG+G-3' ("r" is forribobases and "+" is for an LNA base) |
(Picelli et al., 2014) | ||
| Solutions | |||
| FACS buffer | Recipe: sterile-filtered 1% FBS, 2 mM EDTA, 25 mM HEPES in 1X PBS | ||
| MCS buffer | Recipe: sterile-filtered 0.5% BSA, 2 mM EDTA in 1X PBS | ||
| Medium A | Recipe: 15 mM HEPES, 0.5% glucose in 1X HBSS without phenol red | ||
| Plates | |||
| 384-well Rigi-Plate PCR Microplates, Axygen Scientific | VWR | 89005-556 | |
| Hard-shell 96-well PCR plates | Bio-Rad | HSP9631 | |
| Others | |||
| Dumont #55 forceps | Fine Science Tools | 11295-51 | |
| Dounce homogenizer, 2 ml | Wheaton | 357422 | |
| Large depletion column | Miltenyi Biotec | 130-042-901 | |
| Large selection column | Miltenyi Biotec | 130-042-401 | |
| MACS MultiStand | Miltenyi Biotec | 130-042-303 | |
| QuadroMACS Separator | Miltenyi Biotec | 130-090-976 | |
| RNAzap | Thermo Fisher Scientific | AM9780 | |
| Strainer (70 μm) | Falcon | 352350 | |
| Equipment | |||
| BD FACSAria II | BD Biosciences | http://www.bdbiosciences.com/ | |
| Bioanalyzer | Agilent | 2100 | |
| Fragment Analyzer | Agilent | 5300 | |
| Mosquito HTS nanoliter pipetting robot | TTP Labtech | https://www.ttplabtech.com/ | |
| Qubit 4 Fluorometer | Thermo Fisher Scientific | Q33226 | |
References
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