깊은 단세포 RNA 염기서열 분석에 대한 하나의 성인 마우스 뇌 반구에서 영역 별 Microglia의 격리
Summary
우리는 성인 마우스 뇌 반구의 다른 해부 된 영역에서 microglia의 격리를위한 프로토콜을 제공하고, 전체 길이 전사체의 깊은 단일 세포 RNA 시퀀싱을위한 반자동 라이브러리 준비를 제공합니다. 이 방법은 건강과 질병에서 microglia의 기능적 이질성을 해명하는 데 도움이됩니다.
Abstract
중추 신경계에 거주 대식세포로, microglia 적극적으로 뇌 발달과 항상성을 제어, 그들의 기능 장애는 인간의 질병을 구동 할 수있다. 상당한 발전은 환경 자극에 응하여 그들의 유전자 발현의 변경뿐만 아니라 항상성 microglia의 분자 서명을 밝히기 위하여 만들어졌습니다. 단세포 게놈 방법론의 출현과 성숙으로, 이종 microglia는 다른 발달 및 병리학 조건에서 재생하는 다양한 역할을 기초로 할 수 있다는 것을 점점 인식되고 있습니다. 이러한 이질성의 추가 해부는 관심있는 특정 영역에서 microglia의 효율적인 분리를 통해 달성 될 수 있으며, 개별 세포의 민감한 프로파일링이 뒤따릅니다. 여기서, 우리는 단일 성인 마우스 뇌 반구에서 상이한 뇌 영역에서 microglia의 신속한 격리에 대한 상세한 프로토콜을 제공한다. 우리는 또한 플레이트 기반 깊은 단세포 RNA 순서를 위해 이 분류된 microglia를 사용하는 방법을 설명합니다. 이 방법의 다른 시나리오에 대한 적응성에 대해 논의하고 대규모 연구를 수용할 수 있도록 시스템을 개선하기 위한 지침을 제공합니다.
Introduction
모든 신경 세포의 5%-10%를 나타내는 Microglia는 중추 신경계 (CNS)1에걸쳐 흩어져 있는 상주 대식세포입니다. 혈액-뇌 장벽 뒤에 보호, 건강 한 성인 두뇌에 전형적인 microglia 신속 하 게 확장 하 고 천골에서 신경 세포와 상호 작용 하는 후퇴 많은 미세 한 프로세스를 포함. Microglia는 또한 특정 발달 단계 도중 증가된 식세포 기능과 관련되었던 amoeboid 형태를 채택할 수 있습니다 또는 상해와 질병에 있는 면역 도전에1,2,3,4. 최근의 흥미로운 발견은 microglia가 뇌 유래 또는 병리학 적 신호에 결코 수동적인 방관자가 아니라, 예를 들어, 신경 생존을 지원하고, 미성숙 시냅스를 가지치기, 올리고벤드로크세포 세포 분화를 촉진하고, 혈관신생1을촉진함으로써 뇌 발달 및 항상성 조절에 중추적인 역할을 한다는 것을 분명히 입증하였다. microglia의 더 많은 기능이 해명됨에 따라, 흥분은 TREM2와 같은 많은 신경 퇴행성 질환 위험 유전자가 주로 또는 독점적으로 마이크로 글리아5,6,7에의해 표현된다는 것을 보여주었던 인간 유전학 연구에 의해 더욱 촉진됩니다. 발달과 그럴듯한 질병 구동 역할에 있어서 의의를 감안할 때, 최근 신경퇴행성 질환에 대한 새로운 치료 표적을 찾기 위해 미세교세포 유전자 조절 및 기능에 대한 이해를 위해 엄청난 노력이 투입되고있다1,8.
RNA 시퀀싱 (RNA-seq)은 세포 유형 별 유전자 발현의 편견없는 특성화를 허용하며, 이는 차례로 조밀한 세포 네트워크에서 유전자 기능을 조사하는 과학자를안내합니다 7. RNA-seq는 주로 대량 샘플에서 이루어졌으며, 다른 신경 및 면역 세포와 구별되는 항상성 미세 교만 유전자 시그니처의 발견으로이어졌습니다 9. 그러나, 이러한 접근은 microglia 사이 분자와 기능적인 다름을 간과할 수 있었습니다, 특히 그 개발에 일시적으로 나타나거나, 노화와 질병과 관련되었던. 실제로, 단세포 RNA-seq(scRNA-seq)는 다양한 문맥2,3,10에서이전에 과소평가된 마이크로글리아의 이질성을 밝혀냄으로써 분야에 혁명을 일으켰던 감도 및 분해능을 제공한다. 또한, CNS 순환 계면에서 다른 유사한 면역 세포의 존재로 인해, scRNA-seq는 이러한 관련 세포를 거의 사전 지식 없이 분리하고 기능적으로 해부하는 새로운 도구의 설계를 돕는 정보를 제공한다2,11.
scRNA-seq 플랫폼의 다양한 배열이 발명되었으며, 각각 특정 애플리케이션12에적합합니다. 일반적으로, 10x 유전체학과 같은 액적 기반 방법은 각 실행에서 시퀀싱된 수천 개의 셀을 통해 처리량이 더 높으며, 광범위한 분류를 필요로 하는 혼합 된 세포 집단을 포함할 수 있는 입력에 대해 덜 선택적입니다. 플레이트 기반 방법은 더 높은 감도및 읽기 깊이13,14를제공하며, 일반적으로 세포 분류로부터 특정 집단을 타겟팅하여 미묘한 차이 또는 희귀 한 성적 증명서를 밝힙니다. microglial 세포의 작은 백분율을 감안할 때, 특히 그 발달- 또는 질병 관련 하위 집단, 모든 CNS 세포 모형 중, 관심있는 특정 지역에서 microglia를 격리하고 그들의 이질성을 이해하기 위하여 깊고 전체 길이 전사체 정보를 얻는 것이 바람직하다.
여기서, 우리는 반자동 플레이트 기반 라이브러리 준비 절차에 따라 단일 세포 (또는 대량) RNA-seq에 사용되는 단일 반구에서 해부된 다른 마우스 뇌 영역에서 microglia를 분리하는 방법에 대한 세부 정보를 제공합니다. 그런 다음 다른 반구를 조직학적 유효성 검사에 사용할 수 있습니다. 이전에 공표된 방법9로부터간소화된 이 절연 프로토콜은 소량의 시작 물질로부터 수율을 최대화하고, 한편 내인성 미세교유전자 발현 프로파일을 유지하는 것을 목표로 한다. 우리는 형광 활성화 세포 선별 (FACS)을 사용하여 마이크로 글리아 (또는 기타 관련 면역 세포)를 96 웰 플레이트로 풍부하게하고 처리량을 높이기 위해 라이브러리 준비를위한 시약의 양을 소형화합니다. 우리는 다른 플레이트 기반 전략이 적용될 수 있더라도, 이 민감한 scRNA-seq 플래트홈을 강조합니다. 이 방법은 상해 또는 질병 초점과 같은 다른 해부 된 조직에서 microglia를 쉽게 분리하도록 쉽게 적응 할 수 있으며 마우스의 나이는 거의 모든 출생 후 단계에 따라 다를 수 있습니다. 단세포 전사체 연구를 위한 국소 microglia의 능률적인 격리는 건강과 질병에 있는 그들의 기능의 더 나은 이해를 촉진할 것입니다.
Protocol
Representative Results
Discussion
Microglia적극적으로 CNS에 있는 그밖 세포 모형과 상호 작용하고, 환경 자극에 아주 과민합니다. 격리 과정 동안 그들의 유전자 발현에 있는 선동적인 반응 그리고 비정상적인 변경을 극소화하기 위하여, 이 프로토콜은 이전에 간행된 방법9에서능률화되었습니다, 그리고 지금 병렬로 단 하나 마우스 두뇌 반구의 다중 지구에서 microglia를 격리하기 위하여 적당합니다. 조직과 시약은…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
우리는 마리코 L. 베넷, 리아나 니콜 보난노, 스파이로스 다르마니스가 이 프로토콜을 개발하는 동안 도움을 준 것에 대해 감사드립니다. 우리는 또한 스탠포드 공유 FACS 시설, 특히 메러디스 웨글라츠와 리사 니콜스 감사합니다; 스탠포드 단백질 과 핵산 시설 (PAN)에서 엔 트랜, 마이클 에카트는 촬영에 대한 큰 지원을위해. 이 작품은 JPB 재단과 빈센트 J. 코트 재단에 의해 지원됩니다.
Materials
| 5 M Betaine | Sigma-Aldrich | Cat# B0300-5VL | |
| 10 mM dNTP mix | Thermo Fisher Scientific | Cat# R0192 | |
| 0.5 M EDTA, pH 8.0 | Thermo Fisher Scientific | Cat# 15575020 | |
| 10X Hanks’ Balanced Salt Solution | Thermo Fisher Scientific | Cat# 14185-052 | |
| 1 M HEPES | Thermo Fisher Scientific | Cat# 15630080 | |
| 1X KAPA HIFI Hotstart Master Mix | Kapa Biosciences | Cat# KK2602 | |
| 5 mL Round Bottom Polystyrene Tube, with Cell Strainer Cap | Corning | Cat# 352235 | |
| AATI, High Sensitivity NGS Fragment Analysis Kit (1 bp – 6,000 bp) | Advanced Analytical | Cat# DNF-474-1000 | |
| Bovine Serum Albumin | Sigma Aldrich | Cat# A8806 | |
| DNase I | Worthington | Cat# LS002007 | Working solution: 12500 units/ml |
| DTT, Molecular Grade | Promega | Cat# P1171 | |
| ERCC RNA Spike-In Mix | Thermo Fisher Scientific | Cat# 4456740 | |
| Fetal Bovine Serum | Thermo Fisher Scientific | Cat# 10437-028 | |
| Illumina XT Index Kit v2 Set A (96 indexes) | Illumina | Cat# FC-131-2001 | |
| Illumina XT Index Kit v2 Set B (96 indexes) | Illumina | Cat# FC-131-2002 | |
| Illumina XT Index Kit v2 Set C (96 indexes) | Illumina | Cat# FC-131-2003 | |
| Illumina XT Index Kit v2 Set D (96 indexes) | Illumina | Cat# FC-131-2004 | |
| Lambda Exonuclease (5 U/μl) | New England BioLabs | Cat# M0262S | |
| Mouse Fc block | BD Pharmingen | Cat# 553142 | |
| Myelin removal beads | Miltenyl Biotec | Cat# 130-096-433 | |
| Nextera XT DNA Sample Prep Kit | Illumina | Cat# FC-131-1096 | |
| NextSeq 500/550 High Output Kit v2.5 (150 Cycles) | Illumina | Cat# 20024907 | |
| PBS (10X), pH 7.4 | Thermo Fisher Scientific | Cat# 70011044 | |
| PCRClean DX beads | Aline Biosciences | Cat# C-1003-50 | |
| Propidium Iodide | Thermo Fisher Scientific | Cat# P3566 | Staining: 1:1000 |
| Qubit dsDNA HS Assay Kit | Thermal Fisher Scientific | Cat# Q32851 | |
| Rat monoclonal anti mouse/human CD11b, Brilliant Violet 421 (clone M1/70) | BioLegend | Cat# 101236; RRID: AB_11203704 | Staining: 1:300 |
| Rat monoclonal anti mouse CD45, PE/Cy7 (clone 30-F11) | Thermo Fisher Scientific | Cat# 25-0451-82; RRID: AB_469625 | Staining: 1:300 |
| Recombinant RNase Inhibitor | Takara Bio | Cat# 2313B | |
| SMARTScribe Reverse Transcriptase (100 U/μl) | Clontech | Cat# 639538 | Containing 5x First strand buffer |
| Oligonucleotides | |||
| 0.1 μM ISPCR Oligo: 5' – AAGCAGTGGTATCAA CGCAGAGT-3' |
(Picelli et al., 2014) | ||
| Oligo-dT30VN primer: 5' – AAGCAGTGGTATCAACGCA GAGTACT 30 VN-3' |
(Picelli et al., 2014) | ||
| TSO 5' – AAGCAGTGGTATCAACGCAGA GTACATrGrG+G-3' ("r" is forribobases and "+" is for an LNA base) |
(Picelli et al., 2014) | ||
| Solutions | |||
| FACS buffer | Recipe: sterile-filtered 1% FBS, 2 mM EDTA, 25 mM HEPES in 1X PBS | ||
| MCS buffer | Recipe: sterile-filtered 0.5% BSA, 2 mM EDTA in 1X PBS | ||
| Medium A | Recipe: 15 mM HEPES, 0.5% glucose in 1X HBSS without phenol red | ||
| Plates | |||
| 384-well Rigi-Plate PCR Microplates, Axygen Scientific | VWR | 89005-556 | |
| Hard-shell 96-well PCR plates | Bio-Rad | HSP9631 | |
| Others | |||
| Dumont #55 forceps | Fine Science Tools | 11295-51 | |
| Dounce homogenizer, 2 ml | Wheaton | 357422 | |
| Large depletion column | Miltenyi Biotec | 130-042-901 | |
| Large selection column | Miltenyi Biotec | 130-042-401 | |
| MACS MultiStand | Miltenyi Biotec | 130-042-303 | |
| QuadroMACS Separator | Miltenyi Biotec | 130-090-976 | |
| RNAzap | Thermo Fisher Scientific | AM9780 | |
| Strainer (70 μm) | Falcon | 352350 | |
| Equipment | |||
| BD FACSAria II | BD Biosciences | http://www.bdbiosciences.com/ | |
| Bioanalyzer | Agilent | 2100 | |
| Fragment Analyzer | Agilent | 5300 | |
| Mosquito HTS nanoliter pipetting robot | TTP Labtech | https://www.ttplabtech.com/ | |
| Qubit 4 Fluorometer | Thermo Fisher Scientific | Q33226 | |
References
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