Summary
结核分枝杆菌显示，由于低铁条件，细胞外囊泡的产量增加并释放。这项工作详细介绍了产生低铁条件的协议，以及针对缺铁而释放的分菌外囊泡的纯化和表征方法。
Abstract
分枝杆菌，包括人类结核病的病原体结核分枝杆菌（Mtb），自然释放含有免疫活性分子的细胞外囊泡（EV）。关于囊泡生物成因的分子机制、囊泡的含量及其在病原体-宿主界面中的作用的知识非常有限。解决这些问题需要严格的EV隔离、纯化和验证程序。以前，当M. 结核病受到铁限制时，囊泡的产生会增强，Mtb 在宿主环境中遇到这种情况。这里介绍了一个完整和详细的协议，从缺铁的分枝杆菌分离和纯化EV。采用定量和定性方法验证纯化EV。
Introduction
分枝杆菌细胞外囊泡（MEVs）是膜结合的纳米颗粒，60~300nm大小，由快速生长和缓慢生长的分枝杆菌1自然释放。致病性分枝杆菌释放的MEVs通过免疫活性蛋白、脂质和糖脂以浓缩和保护方式分泌的宿主相互作用的机制2，3，4。为了描述MEV的特征并了解其生物发生和功能，严格而高效的囊泡纯化和验证方法至关重要。到目前为止，MEV已被分离出在富含铁的介质1，5，6，7，8的分枝杆菌的培养中。
然而，以前的工作表明，铁限制极大地刺激了Mtb的囊泡释放，可能通过mycobactin捕获铁，一种在MEVs9中分泌的侧磷酸盐。虽然已经描述了从高铁培养的Mtb培养的MEV分离的程序，但没有报告从低铁培养物获得MEV的有效方法。因此，此方法的目标是分离、纯化和量化从低铁培养物中获得的 MEV，以便它们可用于生化和功能测定以及分析分枝杆菌中囊泡生产的遗传决定因素。
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Protocol
1. 制备铁耗定义介质
- 在塑料容器中溶解5克KH2 PO 4、5gL-芦笋、20 mL甘油和2克脱离子水中的脱离子水，制备1升最小介质（MM）。避免使用玻璃以防止铁污染。将 pHH 调节到 6.8，带 5 N NaOH，用水将体积调节到 1 L。
- 加入 50 g 金属合合树脂 （MCR），在 4°C 下使用磁性搅拌棒轻轻搅拌 24 小时。通过带塑料接收器的 0.22 μm 过滤单元对 MCR 进行消毒和去除。为了加速过滤和防止过滤器堵塞，在过滤前让树脂沉淀物约30分钟。
注：此介质包含小于 2 μM 的残余铁，由原子吸收光谱确定。 - 补充 MM 与 0.5 毫克/升的 ZnCl2，40 毫克/升毫克4，和 0.1 毫克/升 MnSO4.另外，在去离子水中制备每种金属补充剂的浓缩库存（1，000x），并在 MM 补充前通过过滤进行灭菌。铁耗尽，金属补充MM将在这里被称为低铁MM（LIMM）。
- 从 50 mM 库存的 FeCl3溶解在 10 mM HCl 中，将 1 mL 添加到 1 L 的 LIMM（50 μM 最终浓度），以制备高铁 MM （HIMM）。
2. 在铁限条件下生长分枝杆菌
- 解冻50 μL的冷冻15%甘油库存的Mtb和条纹琼脂板补充10%ADN浓缩（5克/L白蛋白，2克/L葡萄糖，和0.85克/L氯化钠，0.2%甘油和0.05%补间-80）10 。在37°C下孵育板，直到菌落可见。
- 接种一个聚菌区Mtb 10在 2 mL 的分乳杆菌培养基 （材料表） 补充ADN浓缩.在37°C下用搅拌孵育。
- 让 Mtb 培养增长到后期对数阶段（OD540是 ±0.8）。要检查这一点，请使用分光光度计测量 OD540。
- 将晚对数培养物的200 μL传播到分菌胶组（材料表）上，辅以0.2%甘油、0.05%补间-80和ADN。接种至少5个板。在37°C下孵育板，直到细菌生长作为汇层可见。对于 Mtb，这需要 1 周的时间。
- 在 LIMM 中湿透无菌棉签。使用此拭子从琼脂板收集细菌，接种 100 mL 的 LIMM，以制备 OD540 ±1.0 的浓缩细菌悬浮液。
- 用LIMM将此悬浮液稀释10次至1L，并将其分成两个，2 L无菌塑料瓶，每个瓶含有500mL的培养瓶。
- 拿出2 mL的培养，并将其转移到5 mL培养管。加入 10 μL 的 10% vol/vol tyloxapol。
- 在37°C下孵育培养物，连续14天。
3. MEV集合
- 在收集时测量 2 mL 区域性的 OD540。在 ADN 和 0.05% Tween-80 的琼脂板上，对培养和板进行 1：10 的连续稀释，每个稀释板 100 μL。
- 将培养液转移到5个225 mL锥形离心管和离心机在2，850 x g下，在20°C下7分钟。
- 使用 50 mL 移液器收集培养上清液，并通过 0.22 μm 滤芯单元过滤消毒。
4. MEV隔离
- 将培养物过滤转移到置于4°C的搅拌细胞超滤系统中，并通过100 kDa截止膜将浓缩物过滤至+50 mL。在<50 psi处过滤浓缩物。
- 在4°C下将浓缩培养物在15，000 x g下滤液15分钟，并收集上清液。
- 在4°C下，在100，000 x g的聚碳酸酯超中心管中将培养物滤液离心2小时。
- 通过温和的移液将膜粒重新悬浮在总共 1 mL 的无菌磷酸盐缓冲盐水 （PBS） 中。
- 将步骤 4.4 中获得的颗粒悬浮液的 0.5 mL 与 1.5 mL 的 60% 异丙醇溶液混合，最终产生 45% wt/vol 的碘氨醇浓度。
- 覆盖MEV-iodixanol 45%悬架，顶部为1mL40%、35%、30%、25%和20%（PBS中vol/vol）异丙醇溶液和1 mL的PBS。
- 在 100，000 x g下在 4 °C 下 18 小时离心。
- 使用 1 mL 汉密尔顿注射器从顶部开始收集 1 mL 密度梯度分数。
- 用PBS稀释每个收集的馏分至20 mL，在100，000 x g下将离心机稀释2小时，在4°C下。
- 去除上清液，将颗粒悬浮在 0.5 mL 的 PBS 中。将此颗粒储存在 4°C。
5. MEV的量化
- 根据制造商的指南，通过布拉德福德测定（材料表）测量每个馏分中的蛋白质浓度。
-
执行膜脂质分析。
- 用荧光膜探针1-（4-三甲基氨基）-6-苯基-1，3，5-六聚苯乙烯p-硫磺酸（TMA-DPH）孵育每个梯度分数的10μL，最终浓度为1μg/mL，最终浓度为1μg/mL，最终50μL的PBS体积为96井黑色板。
- 在33°C下孵育板20分钟。
- 测量 360 nm 激发和 430 nm 发射时的荧光。
6. Qualitative analysis of MEVs
-
执行蛋白质电泳。
- 将约 1 μg 的 MEV 样品与 4 μL 的 5x 样品加载缓冲液（10% w/v SDS、10 mM 二硫硫醇、20% v/v 甘油 0.2 M Tris-HCl、pH 6.8 0.05% w/v 溴酚蓝）混合，并在 85°C 的样品缓冲液中加热样品 5 分钟。
- 装载在 10% 三元/甘氨酸 SDS-聚丙烯酰胺凝胶11和运行缓冲液（25 mM Tris 基，190 mM 甘氨酸，0.1% SDS）运行在 10 V/cm 中，直到蓝色染料正面到达凝胶底部。
- 用超敏感蛋白染色溶液染色凝胶（材料表）。
-
执行点污点。
- 根据制造商的说明，在硝化纤维素膜上装载浓度约为0.5 μg/μL的MEV悬浮液2 μL，并在硝化纤维素膜上进行双倍连续稀释，并加工点斑。
- 使用小鼠中培养的抗血清，以稀释1：5，000作为主要抗体的MEVs，在1：10，000稀释时将山羊抗小鼠与马萝卜过氧化物酶（HRP）耦合为次级抗体。使用适当的HRP基质发泡检测试剂和成像系统检测抗原抗体复合物。
-
执行负染色和电子显微镜。
- 在室温下将2%谷醛固定在室温下2小时，在4%甲醛、1%谷醛和0.1%PBS中孵育过夜。
- 用2%的四氧化二氮染色固定样品90分钟。
- 在乙醇中连续脱水样品，并嵌入Spurr的环氧树脂中。
- 在透射电子显微镜下观察MEV。
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Representative Results
MEV通过在密度梯度中的差分沉淀得到纯化（图1，图2）。在所述条件下，MEV主要以梯度分数3（F3）分离，对应于25%的碘二醇。这一结论基于对蛋白质、膜脂的检测、完整MEV的微观可视化、纳米颗粒大小分布以及抗病毒抗血清的正反应（图2，图3）。向菌落形成单位（CCFUs）规范化的蛋白质和脂质浓度显示，与高铁条件（50 μM FeCl3）相比，低铁中的MEV产量大约增加了8倍（图3）。尽管介绍了一个有代表性的实验结果，但基于 MEV 的多个（>10）隔离，这是一个高度可重复的结果。该方法从1L低铁培养法中获得的纯MEV收率约为500μg蛋白质。
图1：MEV纯化和定量方法的图式表示。生长在琼脂板中的分枝杆菌用于接种铁耗少的最小介质，并生长 Mtb 以进行 EV 隔离。MEVs通过无细胞培养液中的不连续密度梯度进行纯化。结合膜脂质和囊泡蛋白测定、显微镜和纳米粒子分析，对纯化MEVs进行表征。请点击此处查看此图的较大版本。
图 2：纯化 MEV 的特征。（A） 所示为粗 MEV 的实际密度梯度分离的照片，以及梯度分数 3 （F3） 超离心收集纯化 MEV 的颗粒。（B） SDS凝胶染色，显示各种密度梯度分数的蛋白质轮廓。（C） 点斑点分析显示囊泡相关蛋白集中在F3中.（D） F3 中的 MEV 通过负染色观察到。（E） MEV 尺寸分布根据纳米粒子分析 （NTA）.请点击此处查看此图的较大版本。
图3：低铁培养基中MEV产量的比较分析。（A ）蛋白质和脂质定量和 （B） 从铁有限和铁足够的 Mtb 培养物中分离的纯化 MEV 的点斑点分析的代表性结果.请点击此处查看此图的较大版本。
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Discussion
多种纯化真核细胞衍生体外体的方法已经开发12。相比之下，关于纯化细菌衍生EV7的有效方法的信息有限。Mtb衍生的EV的有效分离需要考虑生长这种致病性分枝杆菌的内在困难。Mtb 的分部时间长（±24 小时），应在生物安全三级 （BSL-3） 条件下处理。因此，优化MEV隔离方法的效率非常重要。由于分枝杆菌释放糖脂和其他疏水性分子，聚合和容易污染粗MEV制剂到培养基，重要的是净化和验证MEV之前进行生化和功能研究。根据先前的观察，证明Mtb在铁限制条件下增强MEVs的释放，建立了从铁受限分枝杆菌中净化EV的协议。还证实，非毒性M.smegmatis也增加EV的释放，以应对低铁条件（数据未显示）。因此，在BSL-2条件下，同样的协议可用于从这种细菌中纯化EV。
此过程的一个关键步骤是制备低铁介质。此介质应按此处描述进行制备，并储存在塑料容器中，而不是玻璃中，以防止铁污染。在 Mtb 生长培养基中常用的补充剂，用于刺激细菌生长和防止典型的分型菌团结块，如牛血清白蛋白、Tween-80 或 tyloxapol，必须避免。这些添加剂导致脂蛋白复合伪影，与囊泡联合，降低囊泡产量。对于CFU测定，可以设置一种介质中的小培养体，辅以洗涤剂（Tween-80或tyloxapol），与无洗涤剂大培养体平行。培养液中的MEV在4°C下稳定数天。因此，如果不立即处理，培养液可冷藏。
1 L培养物纯化MEV的总产量约为500μg/L蛋白，足以进行蛋白质组学、脂质学和功能测定等多重分析。根据测定的类型，可以从较小的体积（即 250 mL）中分离出足够的 MEV。这有助于比较分析影响MEV释放的条件和因素。
这是净化MEV的有效方法，但它有局限性。这是一个漫长的过程，具有多个超离心步骤。今后，该方法将比较凝胶过滤色谱，并发现MEV的分子标记，实现亲和捕获方法。宿主环境是铁的，因此Mtb在低铁介质中产生的MEV可能与感染期间产生的MEV更密切相关，可以提供有关MEV在结核病发病机制中的作用的见解。
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Disclosures
作者没有利益冲突。
Acknowledgments
我们感谢拉斐尔·普拉多斯-罗萨莱斯分享了抗MEV抗血清和纳夫内特多格拉执行纳米粒子跟踪分析。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Amicon stirred cell Model 108 | EMD Milipore | UFSC40001 | Cell Ultrafiltration system |
| BD Polypropilene 225 mL conical tubes | Fisher | 05-538-61 | Conical centrifuge tubes |
| Biomax 100 kDa cut-off ultrafiltration membrane | EMD Milipore | PBHK07610 | Ultrafiltration membrane |
| Chelex-100 resin | Bio-Rad | 142-2842 | Metal chelating resin |
| Middlebrook 7H10 Agar | BD Difco | 262710 | Mycobacterial Agar plates |
| Middlebrook 7H9 Broth | BD Difco | 271310 | Mycobacterial broth medium |
| Nitro cellulose blotting membrane | GE Healthcare | 10600001 | Blotting Membrane |
| Optiprep | Sigma | D1556 | Iodixanol |
| Polycarbonate ultra centrifugation tubes 25 mm x 89 mm | Beckman Coulter | 355618 | Polycarbonate ultra centrifugation tubes 25 mm x 89 mm |
| Polypropylene thin walled centrifuge tube 13 mm x 15 mm | Beckman Coulter | 344059 | Polypropylene thin walled centrifuge tube 13 mm x 15 mm |
| Protein Assay dye | BioRad | 5000006 | Bradford Protein Staining |
| SYPRO Ruby | Molecular Probes | S12000 | Ultrasensitive protein stain |
| TMA-DPH | Molecular Probes | T204 | 1-(4-Trimethylammoniumphenyl)-6-Phenyl-1,3,5-Hexatriene p-Toluenesulfonate |
| Vacuum filtration flasks | CellPro | V50022 | Filter Unit |
References
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