Mycobacterium tuberculosis mostra un aumento della produzione e del rilascio di vescibole extracellulari in risposta a basse condizioni di ferro. Questo lavoro descrive in dettaglio un protocollo per la generazione di basse condizioni e metodi di ferro per la purificazione e la caratterizzazione delle vesciche extracellulari micobatteriche rilasciate in risposta alla carenza di ferro.
I micobatteri, tra cui Mycobacterium tuberculosis (Mtb), l’agente causale della tubercolosi umana, rilasciano naturalmente vescicoli extracellulari (EV) contenenti molecole immunologicamente attive. La conoscenza dei meccanismi molecolari della biogenesi vescicante, del contenuto delle vescibole e delle loro funzioni nell’interfaccia patogeno-ospite è molto limitata. Per affrontare queste questioni sono necessarie procedure rigorose per l’isolamento, la purificazione e la convalida dei veicoli elettrici. In precedenza, la produzione di vescicola era migliorata quando M. tuberculosis era esposto a restrizione del ferro, una condizione riscontrata da Mtb nell’ambiente host. Presentato qui è un protocollo completo e dettagliato per isolare e purificare i veicoli elettrici dai micobatteri carenti di ferro. I metodi quantitativi e qualitativi vengono applicati per convalidare i VE purificati.
Le vescicole extracellulari micobatteriche (MEV) sono nanoparticelle legate alla membrana, di dimensioni di 60-300 nm, naturalmente rilasciate da micobatteri a crescita rapida e lenta1. I MEV rilasciati dai micobatteri patogeni costituiscono un meccanismo per interagire con l’ospite tramite proteine immunologicamente attive, lipidi e glicolipidi secreti in modo concentrato e protetto2,3,4. Per caratterizzare i MEV e comprenderne la biogenesi e le funzioni, sono cruciali metodi rigorosi ed efficienti di purificazione e convalida delle vesciche. Finora, i MEV sono stati isolati dalla coltura filtrati di micobatteri coltivati in un mezzo ricco di ferro1,5,6,7,8.
Tuttavia, il lavoro precedente ha dimostrato che la limitazione del ferro stimola notevolmente il rilascio di vesciche in Mtb,possibilmente per catturare il ferro tramite mycobactin, un siderophore secreto in MEV9. Sebbene siano state descritte le procedure per l’isolamento dei MEV dai Mtb coltivati nell’alto mezzo di ferro, non è stata riportata una metodologia efficiente per ottenere MEV da culture di ferro basso. Pertanto, l’obiettivo di questo metodo è quello di isolare, purificare e quantificare i MEV ottenuti da colture di ferro basse in modo che possano essere utilizzati per saggi biochimici e funzionali e per l’analisi dei determinanti genetici della produzione di vescicoli nei micobatteri.
Sono stati sviluppati diversi metodi per purificare gli esosomi eucarioti derivati dalle cellule12. Al contrario, vi sono informazioni limitate sui metodi efficaci per purificare gli EV7derivati dai batteri. L’isolamento efficiente dei veicoli elettrici derivati da Mtb deve considerare le difficoltà intrinseche nella coltivazione di questo micatacterio patogeno. Mtb ha un lungo tempo di divisione (24 h) e deve essere gestito in condizioni di biosicurezza di livello tre (BS…
The authors have nothing to disclose.
Siamo grati a Rafael Prados-Rosales per aver condiviso l’antisera anti-MEV e Navneet Dogra per aver eseguito l’analisi del monitoraggio delle nanoparticelle.
Amicon stirred cell Model 108 | EMD Milipore | UFSC40001 | Cell Ultrafiltration system |
BD Polypropilene 225 ml conical tubes | Fisher | 05-538-61 | Conical centrifuge tubes |
Biomax 100-kDa cut-off ultrafiltration membrane | EMD Milipore | PBHK07610 | Ultrafiltration membrane |
Chelex-100 resin | Bio-Rad | 142-2842 | Metal chelating resin |
Middlebrook 7H10 Agar | BD Difco | 262710 | Mycobacterial Agar plates |
Middlebrook 7H9 Broth | BD Difco | 271310 | Mycobacterial broth medium |
Nitro cellulose blotting membrane | GE Healthcare | 10600001 | Blotting Membrane |
Optiprep | Sigma | D1556 | Iodixanol |
Polycarbonate ultra centrifugation tubes 25 x 89 mm | Beckman Coulter | 355618 | Polycarbonate ultra centrifugation tubes 25 x 89 mm |
Polypropylene thin walled centrifuge tube 13×15 mm | Beckman Coulter | 344059 | Polypropylene thin walled centrifuge tube 13×15 mm |
Protein Assay dye | BioRad | 5000006 | Bradford Protein Staining |
SYPRO Ruby | Molecular Probes | S12000 | Ultrasensitive protein stain |
TMA-DPH | Molecular Probes | T204 | 1-(4-Trimethylammoniumphenyl)-6-Phenyl-1,3,5-Hexatriene p-Toluenesulfonate |
Vacuum filtration flasks | CellPro | V50022 | Filter Unit |