Mycobacterium tuberkulose viser øget produktion og frigivelse af ekstracellulære vesikler som reaktion på lave jern forhold. Dette arbejde beskriver en protokol til generering af lave jern forhold og metoder til rensning og karakterisering af mykobakterielle ekstracellulære vesikler frigivet som reaktion på jernmangel.
Mykobakterier, herunder Mycobacterium tuberkulose (MTB), det udløsende middel for human tuberkulose, frigiver naturligt ekstracellulære vesikler (EVS), der indeholder immunologisk aktive molekyler. Viden om de molekylære mekanismer af vesikelprotein Biogenesis, indholdet af vesikler, og deres funktioner på patogenet-Host interface er meget begrænset. Håndtering af disse spørgsmål kræver strenge procedurer for isolation, rensning og validering af evt. Tidligere blev det konstateret, at vesikel-produktionen blev forbedret, når M. tuberkulose blev udsat for jern begrænsning, en tilstand, som MTB stødte på i værtsmiljøet. Præsenteret her er en komplet og detaljeret protokol til at isolere og rense EVs fra jern-mangelfulde mykobakterier. Der anvendes kvantitative og kvalitative metoder til validering af renset EVs.
Mykobakterielle ekstrellulære vesikler (MEVs) er membranbundne nanopartikler, 60 − 300 Nm i størrelse, der naturligt frigives af hurtigt og langsomt voksende mykobakterier1. Mevs frigivet af patogene mykobakterier udgør en mekanisme til at interagere med værten via immunologisk aktive proteiner, lipider, og glycolipider udskilles i en koncentreret og beskyttet måde2,3,4. At karakterisere mevs og forstå deres Biogenese og funktioner, strenge og effektive metoder til vesikel rensning og validering er afgørende. Hidtil har mevs været isoleret fra de kultur filtrater af mykobakterier dyrket i en jern-rige medium1,5,6,7,8.
Tidligere arbejde viste imidlertid, at jern begrænsning i høj grad stimulerer vesikel frigivelse i MTB, eventuelt for at fange jern via mycobactin, en siderophore udskilte i MEVs9. Selv om der er beskrevet procedurer for MEVs-isolering fra MTB-kultur i højt jern medium, er en effektiv metode til at opnå MEVs fra lave jern kulturer ikke blevet rapporteret. Derfor er målet med denne metode at isolere, rense og kvantificere MEVs opnået fra lave jern kulturer, så de kan anvendes til biokemiske og funktionelle analyser og til analyse af genetiske determinanter for vesikel produktion i mykobakterier.
Flere metoder til at rense eukaryote celle-afledte exosomer er blevet udviklet12. I modsætning hertil er der begrænset information om effektive metoder til at rense bakterie afledte EVs7. Effektiv isolering af køretøjer, som er afledt af MTB, skal tage hensyn til de iboende vanskeligheder ved dyrkning af denne sygdomsfremkaldende Mycobacterium. MTB har en lang divisions tid (~ 24 timer) og skal håndteres på biosikkerhedsniveau tre (BSL-3) betingelser. Derfor er det vi…
The authors have nothing to disclose.
Vi er taknemmelige for Rafael Prados-Rosales for at dele anti-MEV antisera og Navneet Dogra for at udføre nanopartikel tracking analyse.
Amicon stirred cell Model 108 | EMD Milipore | UFSC40001 | Cell Ultrafiltration system |
BD Polypropilene 225 ml conical tubes | Fisher | 05-538-61 | Conical centrifuge tubes |
Biomax 100-kDa cut-off ultrafiltration membrane | EMD Milipore | PBHK07610 | Ultrafiltration membrane |
Chelex-100 resin | Bio-Rad | 142-2842 | Metal chelating resin |
Middlebrook 7H10 Agar | BD Difco | 262710 | Mycobacterial Agar plates |
Middlebrook 7H9 Broth | BD Difco | 271310 | Mycobacterial broth medium |
Nitro cellulose blotting membrane | GE Healthcare | 10600001 | Blotting Membrane |
Optiprep | Sigma | D1556 | Iodixanol |
Polycarbonate ultra centrifugation tubes 25 x 89 mm | Beckman Coulter | 355618 | Polycarbonate ultra centrifugation tubes 25 x 89 mm |
Polypropylene thin walled centrifuge tube 13×15 mm | Beckman Coulter | 344059 | Polypropylene thin walled centrifuge tube 13×15 mm |
Protein Assay dye | BioRad | 5000006 | Bradford Protein Staining |
SYPRO Ruby | Molecular Probes | S12000 | Ultrasensitive protein stain |
TMA-DPH | Molecular Probes | T204 | 1-(4-Trimethylammoniumphenyl)-6-Phenyl-1,3,5-Hexatriene p-Toluenesulfonate |
Vacuum filtration flasks | CellPro | V50022 | Filter Unit |