Summary
Mycobacterium tuberkulose viser øget produktion og frigivelse af ekstracellulære vesikler som reaktion på lave jern forhold. Dette arbejde beskriver en protokol til generering af lave jern forhold og metoder til rensning og karakterisering af mykobakterielle ekstracellulære vesikler frigivet som reaktion på jernmangel.
Abstract
Mykobakterier, herunder Mycobacterium tuberkulose (MTB), det udløsende middel for human tuberkulose, frigiver naturligt ekstracellulære vesikler (EVS), der indeholder immunologisk aktive molekyler. Viden om de molekylære mekanismer af vesikelprotein Biogenesis, indholdet af vesikler, og deres funktioner på patogenet-Host interface er meget begrænset. Håndtering af disse spørgsmål kræver strenge procedurer for isolation, rensning og validering af evt. Tidligere blev det konstateret, at vesikel-produktionen blev forbedret, når M. tuberkulose blev udsat for jern begrænsning, en tilstand, som MTB stødte på i værtsmiljøet. Præsenteret her er en komplet og detaljeret protokol til at isolere og rense EVs fra jern-mangelfulde mykobakterier. Der anvendes kvantitative og kvalitative metoder til validering af renset EVs.
Introduction
Mykobakterielle ekstrellulære vesikler (MEVs) er membranbundne nanopartikler, 60 − 300 Nm i størrelse, der naturligt frigives af hurtigt og langsomt voksende mykobakterier1. Mevs frigivet af patogene mykobakterier udgør en mekanisme til at interagere med værten via immunologisk aktive proteiner, lipider, og glycolipider udskilles i en koncentreret og beskyttet måde2,3,4. At karakterisere mevs og forstå deres Biogenese og funktioner, strenge og effektive metoder til vesikel rensning og validering er afgørende. Hidtil har mevs været isoleret fra de kultur filtrater af mykobakterier dyrket i en jern-rige medium1,5,6,7,8.
Tidligere arbejde viste imidlertid, at jern begrænsning i høj grad stimulerer vesikel frigivelse i MTB, eventuelt for at fange jern via mycobactin, en siderophore udskilte i MEVs9. Selv om der er beskrevet procedurer for MEVs-isolering fra MTB-kultur i højt jern medium, er en effektiv metode til at opnå MEVs fra lave jern kulturer ikke blevet rapporteret. Derfor er målet med denne metode at isolere, rense og kvantificere MEVs opnået fra lave jern kulturer, så de kan anvendes til biokemiske og funktionelle analyser og til analyse af genetiske determinanter for vesikel produktion i mykobakterier.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. fremstilling af jern-depleteret medium
- Der forberedes 1 liter minimalt medium (MM) ved at opløse 5 g KH2po4,5g L-asparagin, 20 ml glycerol og 2 g dextrose i 900 ml afioniseret vand i en plastikbeholder. Undgå glas for at forhindre jern forurening. Juster pH-værdien til 6,8 med 5 N NaOH og volumen til 1 L med vand.
- Der tilsættes 50 g metal chelaterende harpiks (MCR), og omrystes forsigtigt ved hjælp af en magnetisk Stir-stang i 24 timer ved 4 °C. Steriliser og fjern MCR ved filtrering gennem en 0,22 μm filterenhed med en plastik modtager. For at fremskynde filtrering og forhindre filter tilstopning, lad harpiks sediment i ca 30 min før filtrering.
Bemærk: Dette medium indeholder mindre end 2 μM rest jern, som bestemmes ved atomabsorptionsspektroskopi. - Supplement MM med 0,5 mg/L af ZnCl2, 40 mg/l af mgso4, og 0,1 mg/l af mnso4. Separat, forberede koncentrerede bestande (1.000 x) af hver af de metal kosttilskud i deioniseret vand og sterilisere ved filtrering før MM tilskud. Jern-depleteret, metal suppleret MM vil blive henvist her som lav jern MM (LIMM).
- Fra en 50 mM bestand af fæl3 opløst i 10 mm HCL tilsættes 1 ml til 1 L limm (50 μM endelig koncentration) for at forberede høj jern mm (Himm).
2. dyrkning af mykobakterier i jern-begrænsede forhold
- Der tø 50 μL af et frosset 15% glycerol lager af MTB og stribe en agarplade suppleret med 10% ADN-tilsætning (5 g/L albumin, 2 g/L dextrose og 0,85 g/L natriumchlorid, 0,2% glycerol og 0,05% Tween-80)10. Pladen inkubates ved 37 °C, indtil kolonierne er synlige.
- Inokulere en enkelt koloni af MTB10 i 2 ml mycobakteriel bouillon medium (tabel over materialer) suppleret med ADN berigelse. Inkuber med agitation ved 37 °C.
- Lad MTB-kulturen vokse til den sene logaritmiske fase (OD540 er ~ 0,8). For at kontrollere dette skal du måle OD540 ved hjælp af et spektrofotometer.
- Spred 200 μL af den sene logaritmiske kultur på de mykobakterielle agarplader (tabel over materialer) suppleret med 0,2% glycerol, 0,05% Tween-80 og ADN. Inokulere mindst 5 plader. Pladerne inkubates ved 37 °C, indtil bakterievækst er synlig som et konfluent-lag. Dette tager ~ 1 uge for MTB.
- Våd en steril vatpind i LIMM. Brug denne vatpind til at indsamle bakterier fra agarpladerne og inokulere 100 mL LIMM for at tilberede en koncentreret bakterie suspension med en OD540 på ~ 1,0.
- Denne suspension fortyndes 10 gange til 1 L med LIMM og opdeles i to, 2 L sterile plastikflasker, der hver indeholder 500 mL kultur.
- Tag 2 mL kultur, og overfør det til et 5 mL kulturrør. Tilsæt 10 μL 10% Vol/Vol tyloxapol.
- Inkuber kulturerne ved 37 °C stående i 14 dage.
3. indsamling af MEVs
- Mål OD540 af 2 ml kulturen på indsamlingstidspunktet. 1:10 seriefortyndinger af kulturen og pladen 100 μL af hver fortynding på agarplader med ADN og 0,05% Tween-80.
- Kulturen overføres til 5 225 mL koniske centrifugerør og centrifugeres ved 2.850 x g i 7 minutter ved 20 °c.
- Saml kultur supernatanten med en 50 mL pipette, og Filtrer Steriliser den gennem en 0,22 μm filterenhed.
4. isolering af MEVs
- Kultur filtratet overføres til et ultrafiltrationsystem med omrørings celler anbragt ved 4 °C, og koncentratet filtreres ved < 50 PSI gennem en 100 kDa-cutoff-membran til ~ 50 mL.
- Den koncentrerede kultur filtrat centrifugeres ved 15.000 x g i 15 minutter ved 4 °c, og supernatanten opsamles.
- Kultur filtratet centrifugeres i polycarbonat ultracentrifugering-rør ved 100.000 x g i 2 timer ved 4 °c.
- De membranøse pellets opslæmmes i alt 1 mL sterilt fosfatbuffer saltvand (PBS) ved skånsom pipettering.
- Bland 0,5 mL af pellet suspensionen opnået i trin 4,4 med 1,5 mL 60% iodixanol-opløsning, hvilket giver en endelig iodixanol-koncentration på 45% WT/vol. dette mix i bunden af en 13 mm x 51 mm polypropylen tynd-walled ultracentrifuge tube.
- Overlejring MEV-iodixanol 45% suspension med 1 mL 40%, 35%, 30%, 25% og 20% (Vol/Vol i PBS) iodixanol opløsninger og 1 mL PBS foroven.
- Centrifugeres ved 100.000 x g i 18 timer ved 4 °c.
- Saml 1 mL tætheds gradient fraktioner startende fra toppen ved hjælp af en 1 mL Hamilton sprøjte.
- Hver samlet fraktion fortyndes til 20 mL med PBS og centrifugeres ved 100.000 x g i 2 timer ved 4 °c.
- Supernatanten fjernes, og pelleten suspenderes i 0,5 mL PBS. Denne pellet opbevares ved 4 °C.
5. kvantificering af MEVs
- I hver fraktion måles proteinkoncentrationen i en Bradford-analyse (tabel over materialer) efter fabrikantens retningslinjer.
-
Udfør membran lipid analyse.
- Der inkubaterer 10 μL af hver gradient fraktion med fluorescerende membran sonde 1-(4-Trimethylammoniumphenyl) -6-phenyl-1, 3,5-Hexatrien p-toluenesulfonat (TMA-DPH) i en endelig koncentration på 1 μg/ml i en endelig 50 ΜL volumen PBS i 96 godt sort Plader.
- Pladerne inkubates ved 33 °C i 20 minutter.
- Fluorescens måles ved 360 nm excitation og 430 nm emission.
6. kvalitativ analyse af MEVs
-
Udføre proteinelektroforese.
- Bland ca. 1 μg MeV-prøver i 16 μl med 4 μl 5, 5x prøve indlæsnings buffer (10% w/v SDS, 10 mm dithiothreitol, 20% v/v glycerol 0,2 M Tris-HCl, ph 6,8 0,05% w/v bromphenolblåt blå) og Opvarm prøverne i prøve buffer ved 85 °c i 5 min.
- Belastning i en 10% Tris/Glycine SDS-polyacrylamid gel11 og køre ved 10 V/cm i løbe buffer (25 mm Tris base, 190 mm glycin, 0,1% SDS) indtil den blå farvestof front når bunden af gelen.
- Plette gelen med en ultrasensitiv protein farvningsopløsning (tabel over materialer).
-
Udfør prik blot.
- Der belastes2 μL af en MEVs suspension med en koncentration på ca. 0,5 μg/μL og dobbelte serielle fortyndinger på en nitrocellulose membran og proces for en prik blot efter fabrikantens anvisninger.
- Brug et antiserum, der er opvokset i mus, mod et præparat af MEVs ved en fortynding på 1:5000 som det primære antistof og en ged-anti-mus koblet til peberrod-peroxidase (HRP) ved en fortynding på 1:10000 som sekundært antistof. Detektér antigen-antistof komplekser med et passende HRP substrat blotting Detection reagens og et billedbehandlingssystem.
-
Udfør negativ farvning og elektronmikroskopi.
- Fix 250 μL MEVs med 2% glutaraldehyd i 0,1 M cacodylate ved stuetemperatur for 2 h og Inkuber natten over i 4% formaldehyd, 1% glutaraldehyd og 0,1% PBS.
- De faste prøver plette med 2% osmium tetroxid i 90 min.
- Serielt dehydrere prøven i ethanol og indlejre i Spurr's epoxyharpiks.
- Overhold MEVs under et transmissionselektronmikroskop.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
MEVs blev renset ved differentiel sedimentering i en massefylde gradient (figur 1, figur 2). Under de beskrevne forhold adskilte MEVs hovedsagelig i gradient fraktion 3 (F3), hvilket svarer til 25% iodixanol. Denne konklusion er baseret på påvisning af protein, membran lipid, mikroskopisk visualisering af intakt MEVs, nanopartikel størrelsesfordeling, og positiv reaktivitet med et antivesikel antiserum (figur 2, figur 3). Protein-og lipid-koncentrationen normaliseret til kolonidannende enheder (cfus) viste en ca. ottefoldige stigning af MeV-udbytte i lavt jern i forhold til høje jern forhold (50 μM fecl3) (figur 3). Selv om resultaterne af et repræsentativt eksperiment er præsenteret, dette er et meget reproducerbart resultat baseret på multiple (> 10) isoleringer af MEVs. Den rene MEV-ydelse opnået fra en 1 L lav jern kultur ved denne metode var ca. 500 μg protein.
Figur 1: skematisk gengivelse af den metode, der anvendes til MEV-rensning og kvantificering. Mykobakterier dyrket i agar plader blev brugt til at inokulere jern-forarmet minimal medium og vokse MTB for EV isolation. MEVs blev renset ved en diskontinuerlig tæthed gradient fra den celle-fri kultur filtrat. En kombination af membran lipid og vesikel protein bestemmelse, mikroskopi, og nanopartikel analyse blev gennemført for at karakterisere renset MEVs. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 2: karakterisering af rensede MEVs. A) det viste er fotografier af en faktisk massefylde gradient adskillelse af rå mevs og pellet af rensede mevs indsamlet af ultracentrifugering af gradient fraktion 3 (F3). B) en plettet SDS-gel, der viser protein profilen for de forskellige massefylde forløbs fraktioner. C) prik blot-analyse, der viser vesikle-associerede proteiner koncentreret i F3. D) mevs til stede i F3 observeret ved negativ farvning. E) MeV-størrelsesfordeling i henhold til nanopartikel-analyse (NTA). Venligst klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 3: komparativ analyse af MEV-udbyttet i lave og høje jern kulturer. Et repræsentativt resultat af (a) protein og lipid kvantificering og (B) prik blot analyse af renset mevs isoleret fra jern-begrænset og jern tilstrækkelig MTB kulturer. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Flere metoder til at rense eukaryote celle-afledte exosomer er blevet udviklet12. I modsætning hertil er der begrænset information om effektive metoder til at rense bakterie afledte EVs7. Effektiv isolering af køretøjer, som er afledt af MTB, skal tage hensyn til de iboende vanskeligheder ved dyrkning af denne sygdomsfremkaldende Mycobacterium. MTB har en lang divisions tid (~ 24 timer) og skal håndteres på biosikkerhedsniveau tre (BSL-3) betingelser. Derfor er det vigtigt at optimere effektiviteten af MEV isolations metoder. Da mykobakterier frigiver glycolipider og andre hydrofobe molekyler, der samler og let forurener rå MEV-præparater i mediet, er det vigtigt at rense og validere Mev'er, inden de udfører biokemiske og funktionelle undersøgelser. Baseret på tidligere observationer, der viste, at MTB øger frigivelsen af MEVs under betingelser for jern begrænsning, blev der etableret en protokol for EV-rensning fra jern begrænsede mykobakterier. Det er også blevet bekræftet, at ikke-virulent M. smegmatis øger også frigivelsen af EVS som reaktion på lave jern forhold (data ikke vist). Derfor kan den samme protokol anvendes til at rense EVs fra denne bakterie i BSL-2 betingelser.
Et kritisk trin i denne procedure er forberedelsen af det lave jern medium. Dette medium skal tilberedes som beskrevet her og opbevares i en plastikbeholder, ikke i glas, for at forhindre jern forurening. Kosttilskud, der almindeligvis anvendes i MTB-vækstmedium til stimulering af bakterievækst og forebyggelse af karakteristiske mykobakterielle klumpning, såsom kvægserum albumin, Tween-80 eller tyloxapol, skal undgås. Disse tilsætningsstoffer fører til lipoprotein komplekse artefakter, der copurify med vesikler og reducere vesikel udbytte. For CFU-bestemmelse kan en lille kultur i medium suppleret med vaskemiddel (Tween-80 eller tyloxapol) indstilles parallelt med den vaskemiddel frie store kultur. MEVs i kulturen filtrat er stabile ved 4 °C i flere dage. Derfor kan kultur filtratet opbevares nedkølet, hvis det ikke behandles med det samme.
Det samlede udbytte af renset MEV fra 1 L kultur var omkring 500 μg/L protein, hvilket er tilstrækkeligt til at udføre flere analyser såsom proteomics, lipidomics og funktionelle assays. Afhængigt af analysens art kan tilstrækkelige MEVs isoleres fra mindre volumener (dvs. 250 mL). Dette letter komparativ analyse af forhold og faktorer, som påvirker MEV-frigivelsen.
Dette er en effektiv metode til at rense MEVs, men det har begrænsninger. Det er en lang procedure med flere ultracentrifugering trin. I fremtiden vil denne metode blive sammenlignet med gel filtrerings kromatografi, og som molekylære markører af MEVs opdages, kan affinitets Capture metoder implementeres. Værten miljø er jern-begrænset, derfor MEVs produceret af MTB i et lavt jern medium er formentlig mere tæt forbundet med MEVs produceret under infektion og kunne give relevant indsigt om rollen af MEVs i tuberkulose patogenesen.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne har ingen interessekonflikter.
Acknowledgments
Vi er taknemmelige for Rafael Prados-Rosales for at dele anti-MEV antisera og Navneet Dogra for at udføre nanopartikel tracking analyse.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Amicon stirred cell Model 108 | EMD Milipore | UFSC40001 | Cell Ultrafiltration system |
| BD Polypropilene 225 mL conical tubes | Fisher | 05-538-61 | Conical centrifuge tubes |
| Biomax 100 kDa cut-off ultrafiltration membrane | EMD Milipore | PBHK07610 | Ultrafiltration membrane |
| Chelex-100 resin | Bio-Rad | 142-2842 | Metal chelating resin |
| Middlebrook 7H10 Agar | BD Difco | 262710 | Mycobacterial Agar plates |
| Middlebrook 7H9 Broth | BD Difco | 271310 | Mycobacterial broth medium |
| Nitro cellulose blotting membrane | GE Healthcare | 10600001 | Blotting Membrane |
| Optiprep | Sigma | D1556 | Iodixanol |
| Polycarbonate ultra centrifugation tubes 25 mm x 89 mm | Beckman Coulter | 355618 | Polycarbonate ultra centrifugation tubes 25 mm x 89 mm |
| Polypropylene thin walled centrifuge tube 13 mm x 15 mm | Beckman Coulter | 344059 | Polypropylene thin walled centrifuge tube 13 mm x 15 mm |
| Protein Assay dye | BioRad | 5000006 | Bradford Protein Staining |
| SYPRO Ruby | Molecular Probes | S12000 | Ultrasensitive protein stain |
| TMA-DPH | Molecular Probes | T204 | 1-(4-Trimethylammoniumphenyl)-6-Phenyl-1,3,5-Hexatriene p-Toluenesulfonate |
| Vacuum filtration flasks | CellPro | V50022 | Filter Unit |
References
- Prados-Rosales, R., et al. Mycobacteria release active membrane vesicles that modulate immune responses in a TLR2-dependent manner in mice. Journal of Clinical Investigation. 121, 1471-1483 (2011).
- Gupta, S., Rodriguez, G. M. Mycobacterial extracellular vesicles and host pathogen interactions. Pathogens and Disease. 76 (4), (2018).
- Athman, J. J., et al. Bacterial Membrane Vesicles Mediate the Release of Mycobacterium tuberculosis Lipoglycans and Lipoproteins from Infected Macrophages. Journal of Immunology. 195, 1044-1053 (2015).
- Athman, J. J., et al. Mycobacterium tuberculosis Membrane Vesicles Inhibit T Cell Activation. Journal of Immunology. 198, 2028-2037 (2017).
- Rath, P., et al. Genetic regulation of vesiculogenesis and immunomodulation in Mycobacterium tuberculosis. Proceedings of the National Academy of Science U.S.A. 110, E4790-E4797 (2013).
- White, D. W., Elliott, S. R., Odean, E., Bemis, L. T., Tischler, A. D. Mycobacterium tuberculosis Pst/SenX3-RegX3 Regulates Membrane Vesicle Production Independently of ESX-5 Activity. mBio. 9, pii 00778 (2018).
- Dauros Singorenko, P., et al. Isolation of membrane vesicles from prokaryotes: a technical and biological comparison reveals heterogeneity. Journal of Extracellular Vesicles. 6, 1324731 (2017).
- Prados-Rosales, R., Brown, L., Casadevall, A., Montalvo-Quiros, S., Luque-Garcia, J. L. Isolation and identification of membrane vesicle-associated proteins in Gram-positive bacteria and mycobacteria. MethodsX. 1, 124-129 (2014).
- Prados-Rosales, R., et al. Role for Mycobacterium tuberculosis membrane vesicles in iron acquistion. Journal of Bacteriology. 196, 1250-1256 (2014).
- Sanders, E. Aseptic Laboratory Techniques: Plating Methods. Journal of Visualized Experiments. 63, e3064 (2012).
- Harlow, E., Lane, L. Antibodies. A laboratory manual. , Cold Spring Harbor Laboratory. (1988).
- Lotvall, J., et al. Minimal experimental requirements for definition of extracellular vesicles and their functions: a position statement from the International Society for Extracellular Vesicles. Journal of Extracellular Vesicles. 3, 26913 (2014).
