Isolering og karakterisering af ekstracellulære vesikler produceret af jern begrænsede mykobakterier
Summary
Mycobacterium tuberkulose viser øget produktion og frigivelse af ekstracellulære vesikler som reaktion på lave jern forhold. Dette arbejde beskriver en protokol til generering af lave jern forhold og metoder til rensning og karakterisering af mykobakterielle ekstracellulære vesikler frigivet som reaktion på jernmangel.
Abstract
Mykobakterier, herunder Mycobacterium tuberkulose (MTB), det udløsende middel for human tuberkulose, frigiver naturligt ekstracellulære vesikler (EVS), der indeholder immunologisk aktive molekyler. Viden om de molekylære mekanismer af vesikelprotein Biogenesis, indholdet af vesikler, og deres funktioner på patogenet-Host interface er meget begrænset. Håndtering af disse spørgsmål kræver strenge procedurer for isolation, rensning og validering af evt. Tidligere blev det konstateret, at vesikel-produktionen blev forbedret, når M. tuberkulose blev udsat for jern begrænsning, en tilstand, som MTB stødte på i værtsmiljøet. Præsenteret her er en komplet og detaljeret protokol til at isolere og rense EVs fra jern-mangelfulde mykobakterier. Der anvendes kvantitative og kvalitative metoder til validering af renset EVs.
Introduction
Mykobakterielle ekstrellulære vesikler (MEVs) er membranbundne nanopartikler, 60 − 300 Nm i størrelse, der naturligt frigives af hurtigt og langsomt voksende mykobakterier1. Mevs frigivet af patogene mykobakterier udgør en mekanisme til at interagere med værten via immunologisk aktive proteiner, lipider, og glycolipider udskilles i en koncentreret og beskyttet måde2,3,4. At karakterisere mevs og forstå deres Biogenese og funktioner, strenge og effektive metoder til vesikel rensning og validering er afgørende. Hidtil har mevs været isoleret fra de kultur filtrater af mykobakterier dyrket i en jern-rige medium1,5,6,7,8.
Tidligere arbejde viste imidlertid, at jern begrænsning i høj grad stimulerer vesikel frigivelse i MTB, eventuelt for at fange jern via mycobactin, en siderophore udskilte i MEVs9. Selv om der er beskrevet procedurer for MEVs-isolering fra MTB-kultur i højt jern medium, er en effektiv metode til at opnå MEVs fra lave jern kulturer ikke blevet rapporteret. Derfor er målet med denne metode at isolere, rense og kvantificere MEVs opnået fra lave jern kulturer, så de kan anvendes til biokemiske og funktionelle analyser og til analyse af genetiske determinanter for vesikel produktion i mykobakterier.
Protocol
Representative Results
Discussion
Flere metoder til at rense eukaryote celle-afledte exosomer er blevet udviklet12. I modsætning hertil er der begrænset information om effektive metoder til at rense bakterie afledte EVs7. Effektiv isolering af køretøjer, som er afledt af MTB, skal tage hensyn til de iboende vanskeligheder ved dyrkning af denne sygdomsfremkaldende Mycobacterium. MTB har en lang divisions tid (~ 24 timer) og skal håndteres på biosikkerhedsniveau tre (BSL-3) betingelser. Derfor er det vi…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Vi er taknemmelige for Rafael Prados-Rosales for at dele anti-MEV antisera og Navneet Dogra for at udføre nanopartikel tracking analyse.
Materials
| Amicon stirred cell Model 108 | EMD Milipore | UFSC40001 | Cell Ultrafiltration system |
| BD Polypropilene 225 ml conical tubes | Fisher | 05-538-61 | Conical centrifuge tubes |
| Biomax 100-kDa cut-off ultrafiltration membrane | EMD Milipore | PBHK07610 | Ultrafiltration membrane |
| Chelex-100 resin | Bio-Rad | 142-2842 | Metal chelating resin |
| Middlebrook 7H10 Agar | BD Difco | 262710 | Mycobacterial Agar plates |
| Middlebrook 7H9 Broth | BD Difco | 271310 | Mycobacterial broth medium |
| Nitro cellulose blotting membrane | GE Healthcare | 10600001 | Blotting Membrane |
| Optiprep | Sigma | D1556 | Iodixanol |
| Polycarbonate ultra centrifugation tubes 25 x 89 mm | Beckman Coulter | 355618 | Polycarbonate ultra centrifugation tubes 25 x 89 mm |
| Polypropylene thin walled centrifuge tube 13×15 mm | Beckman Coulter | 344059 | Polypropylene thin walled centrifuge tube 13×15 mm |
| Protein Assay dye | BioRad | 5000006 | Bradford Protein Staining |
| SYPRO Ruby | Molecular Probes | S12000 | Ultrasensitive protein stain |
| TMA-DPH | Molecular Probes | T204 | 1-(4-Trimethylammoniumphenyl)-6-Phenyl-1,3,5-Hexatriene p-Toluenesulfonate |
| Vacuum filtration flasks | CellPro | V50022 | Filter Unit |
References
- Prados-Rosales, R., et al. Mycobacteria release active membrane vesicles that modulate immune responses in a TLR2-dependent manner in mice. Journal of Clinical Investigation. 121, 1471-1483 (2011).
- Gupta, S., Rodriguez, G. M. Mycobacterial extracellular vesicles and host pathogen interactions. Pathogens and Disease. 76 (4), (2018).
- Athman, J. J., et al. Bacterial Membrane Vesicles Mediate the Release of Mycobacterium tuberculosis Lipoglycans and Lipoproteins from Infected Macrophages. Journal of Immunology. 195, 1044-1053 (2015).
- Athman, J. J., et al. Mycobacterium tuberculosis Membrane Vesicles Inhibit T Cell Activation. Journal of Immunology. 198, 2028-2037 (2017).
- Rath, P., et al. Genetic regulation of vesiculogenesis and immunomodulation in Mycobacterium tuberculosis. Proceedings of the National Academy of Science U.S.A. 110, E4790-E4797 (2013).
- White, D. W., Elliott, S. R., Odean, E., Bemis, L. T., Tischler, A. D. Mycobacterium tuberculosis Pst/SenX3-RegX3 Regulates Membrane Vesicle Production Independently of ESX-5 Activity. mBio. 9, pii 00778 (2018).
- Dauros Singorenko, P., et al. Isolation of membrane vesicles from prokaryotes: a technical and biological comparison reveals heterogeneity. Journal of Extracellular Vesicles. 6, 1324731 (2017).
- Prados-Rosales, R., Brown, L., Casadevall, A., Montalvo-Quiros, S., Luque-Garcia, J. L. Isolation and identification of membrane vesicle-associated proteins in Gram-positive bacteria and mycobacteria. MethodsX. 1, 124-129 (2014).
- Prados-Rosales, R., et al. Role for Mycobacterium tuberculosis membrane vesicles in iron acquistion. Journal of Bacteriology. 196, 1250-1256 (2014).
- Sanders, E. Aseptic Laboratory Techniques: Plating Methods. Journal of Visualized Experiments. 63, e3064 (2012).
- Harlow, E., Lane, L. . Antibodies. A laboratory manual. , (1988).
- Lotvall, J., et al. Minimal experimental requirements for definition of extracellular vesicles and their functions: a position statement from the International Society for Extracellular Vesicles. Journal of Extracellular Vesicles. 3, 26913 (2014).
