Mycobacterium tuberkulose viser økt produksjon og frigjøring av ekstracellulære blemmer som svar på lave jern forhold. Dette arbeidet detaljer en protokoll for generering av lave jern forhold og metoder for rensing og karakterisering av mykobakterieinfeksjoner ekstracellulære blemmer utgitt som svar på jernmangel.
Mykobakterier, inkludert Mycobacterium tuberkulose (MTB), den utløsende Agent for menneskelig tuberkulose, naturlig utgivelse ekstracellulære blemmer (EV) som inneholder immunologisk aktive molekyler. Kunnskap om molekylære mekanismer av vesicle kognitiv, innholdet av blemmer, og deres funksjoner på patogen-vert grensesnittet er svært begrenset. Å ta opp disse spørsmålene krever strenge prosedyrer for isolering, rensing og validering av EV ‘ r. Tidligere ble det funnet vesicle produksjon som ble forsterket da M. tuberkulose ble utsatt for jern begrensning, en tilstand som ble oppdaget av MTB i vertsmiljøet. Her presenteres en komplett og detaljert protokoll for å isolere og rense EV ‘ r fra jern mangelfull mykobakterier. Kvantitative og kvalitative metoder brukes for å validere renset EV ‘ r.
Mykobakterieinfeksjoner ekstracellulære blemmer (Model) er membran bundne nanopartikler, 60 − 300 NM i størrelse, naturlig utgitt av hurtig-og sakte voksende mykobakterier1. Model utgitt av patogene mykobakterier utgjør en mekanisme for å samhandle med verten via immunologisk aktive proteiner, lipider, og glykolipider skilles ut i en konsentrert og beskyttet måte2,3,4. Å karakterisere Model og oppfatte deres kognitiv og funksjonene, streng og effektiv metoder av vesicle rensing og godkjenningen er avgjørende. Hittil har Model blitt isolert fra kulturen filtrates av mykobakterier vokst i en jern-rik medium1,5,6,7,8.
Men tidligere arbeid demonstrerte at jern begrensning sterkt stimulerer vesicle utgivelse i MTB, muligens for å fange jern via mycobactin, en siderophore utskilles i Model9. Selv om prosedyrer for Model isolasjon fra MTB kultivert i høyt jern medium har blitt beskrevet, en effektiv metodikk for å få Model fra lav jern kulturer har ikke blitt rapportert. Derfor er målet med denne metoden å isolere, rense og kvantifisere Model innhentet fra lav jern kulturer slik at de kan brukes til biokjemiske og funksjonelle analyser og for analyse av genetiske faktorer for vesicle produksjon i mykobakterier.
Flere metoder for å rense eukaryote celle-avledet exosomes har blitt utviklet12. I kontrast er det begrenset informasjon om effektive metoder for å rense bakterier-avledet EV7. Effektiv isolering av MTB-avledet EV ‘ r må vurdere de iboende vanskelighetene med å dyrke denne patogene Mycobacterium. MTB har en lang divisjon tid (~ 24 h) og bør håndteres i biosafety nivå tre (BSL-3) forhold. Derfor er det viktig å optimalisere effektiviteten av MEV isolasjons metoder. F…
The authors have nothing to disclose.
Vi er takknemlige for Rafael Prados-Rosales for å dele anti-MEV antisera og Navneet Dogra for å utføre nanopartikkel sporings analyse.
Amicon stirred cell Model 108 | EMD Milipore | UFSC40001 | Cell Ultrafiltration system |
BD Polypropilene 225 ml conical tubes | Fisher | 05-538-61 | Conical centrifuge tubes |
Biomax 100-kDa cut-off ultrafiltration membrane | EMD Milipore | PBHK07610 | Ultrafiltration membrane |
Chelex-100 resin | Bio-Rad | 142-2842 | Metal chelating resin |
Middlebrook 7H10 Agar | BD Difco | 262710 | Mycobacterial Agar plates |
Middlebrook 7H9 Broth | BD Difco | 271310 | Mycobacterial broth medium |
Nitro cellulose blotting membrane | GE Healthcare | 10600001 | Blotting Membrane |
Optiprep | Sigma | D1556 | Iodixanol |
Polycarbonate ultra centrifugation tubes 25 x 89 mm | Beckman Coulter | 355618 | Polycarbonate ultra centrifugation tubes 25 x 89 mm |
Polypropylene thin walled centrifuge tube 13×15 mm | Beckman Coulter | 344059 | Polypropylene thin walled centrifuge tube 13×15 mm |
Protein Assay dye | BioRad | 5000006 | Bradford Protein Staining |
SYPRO Ruby | Molecular Probes | S12000 | Ultrasensitive protein stain |
TMA-DPH | Molecular Probes | T204 | 1-(4-Trimethylammoniumphenyl)-6-Phenyl-1,3,5-Hexatriene p-Toluenesulfonate |
Vacuum filtration flasks | CellPro | V50022 | Filter Unit |