Summary

Aislamiento y caracterización de vesículas extracelulares producidas por micobacterias limitadas por hierro

Published: October 31, 2019
doi:

Summary

Mycobacterium tuberculosis muestra un aumento de la producción y liberación de vesículas extracelulares en respuesta a condiciones bajas de hierro. Este trabajo detalla un protocolo para generar condiciones de hierro bajas y métodos para la purificación y caracterización de vesículas extracelulares micobacterianas liberadas en respuesta a la deficiencia de hierro.

Abstract

Las micobacterias, incluyendo Mycobacterium tuberculosis (Mtb), el agente causante de la tuberculosis humana, liberan naturalmente vesículas extracelulares (EV) que contienen moléculas inmunológicamente activas. El conocimiento sobre los mecanismos moleculares de la biogénesis vesícula, el contenido de las vesículas y sus funciones en la interfaz patógeno-huésped es muy limitado. Abordar estas preguntas requiere procedimientos rigurosos para el aislamiento, purificación y validación de vehículos eléctricos. Anteriormente, se encontró que la producción de vesículas se mejoró cuando M. tuberculosis estaba expuesta a una restricción de hierro, una condición encontrada por Mtb en el entorno huésped. Aquí se presenta un protocolo completo y detallado para aislar y purificar los vehículos eléctricos de las micobacterias con deficiencia de hierro. Se aplican métodos cuantitativos y cualitativos para validar los vehículos eléctricos purificados.

Introduction

Las vesículas extracelulares micobacterianas (MEV) son nanopartículas unidas a la membrana, de 60 a 300 nm de tamaño, liberadas naturalmente por micobacterias de crecimiento rápido y lento1. Los MEV liberados por micobacterias patógenas constituyen un mecanismo para interactuar con el huésped a través de proteínas inmunológicamente activas, lípidos y glucólidos secretados de manera concentrada y protegida2,3,4. Para caracterizar MEVs y comprender su biogénesis y funciones, son cruciales métodos estrictos y eficientes de purificación y validación de vesículas. Hasta ahora, los MEV se han aislado de los filtrados de cultivo de micobacterias cultivadas en un medio rico en hierro1,5,6,7,8.

Sin embargo, trabajos anteriores demostraron que la limitación del hierro estimula en gran medida la liberación de vesículas en Mtb, posiblemente para capturar hierro a través de mycobactin, un siderophore secretado en MEVs9. Aunque se han descrito procedimientos para el aislamiento de MEV de Mtb cultivadoen en medios de hierro alto, no se ha informado de una metodología eficiente para obtener MEV de cultivos de hierro bajos. Por lo tanto, el objetivo de este método es aislar, purificar y cuantificar los MEV obtenidos de cultivos de hierro bajos para que puedan ser utilizados para ensayos bioquímicos y funcionales y para el análisis de determinantes genéticos de la producción de vesículas en micobacterias.

Protocol

1. Preparación del medio definido agotado de hierro Preparar 1 L de medio mínimo (MM) disolviendo 5 g de KH2PO4, 5 g de L-asparagina, 20 ml de glicerol, y 2 g de dextrosa en 900 ml de agua desionizada en un recipiente de plástico. Evite el vidrio para evitar la contaminación del hierro. Ajuste el pH a 6,8 con 5 NaOH y el volumen a 1 L con agua. Añadir 50 g de resina quelante metálica (MCR) y agitar suavemente con una barra de agitación magnética durante 24 h a 4oC. Esteri…

Representative Results

Los MEV fueron purificados por sedimentación diferencial en un gradiente de densidad(Figura 1, Figura 2). En las condiciones descritas, los MEV se separaron principalmente en la fracción de gradiente 3 (F3), que corresponde al 25% de iodixanol. Esta conclusión se basa en la detección de proteínas, lípidos de membrana, visualización microscópica de MEV intactos, distribución del tamaño de nanopartículas y reactividad po…

Discussion

Múltiples métodos para purificar exosomas derivados de células eucariotas se han desarrollado12. Por el contrario, hay información limitada sobre métodos eficaces para purificar los vehículos eléctricos derivados de bacterias7. El aislamiento eficiente de los vehículos eléctricos derivados de Mtb debe tener en cuenta las dificultades intrínsecas en el crecimiento de esta micobacterium patógena. Mtb tiene un largo tiempo de división (24 h) y debe manejarse en con…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Agradecemos a Rafael Prados-Rosales por compartir el antisera anti-MEV y Navneet Dogra por realizar análisis de seguimiento de nanopartículas.

Materials

Amicon stirred cell Model 108 EMD Milipore UFSC40001 Cell Ultrafiltration system
BD Polypropilene 225 ml conical tubes Fisher 05-538-61 Conical centrifuge tubes
Biomax 100-kDa cut-off ultrafiltration membrane EMD Milipore PBHK07610 Ultrafiltration membrane
Chelex-100 resin Bio-Rad 142-2842 Metal chelating resin
Middlebrook 7H10 Agar BD Difco 262710 Mycobacterial Agar plates
Middlebrook 7H9 Broth BD Difco 271310 Mycobacterial broth medium
Nitro cellulose blotting membrane GE Healthcare 10600001 Blotting Membrane
Optiprep Sigma D1556 Iodixanol
Polycarbonate ultra centrifugation tubes 25 x 89 mm Beckman Coulter 355618 Polycarbonate ultra centrifugation tubes 25 x 89 mm
Polypropylene thin walled centrifuge tube 13×15 mm Beckman Coulter 344059 Polypropylene thin walled centrifuge tube 13×15 mm
Protein Assay dye BioRad 5000006 Bradford Protein Staining
SYPRO Ruby Molecular Probes S12000 Ultrasensitive protein stain
TMA-DPH Molecular Probes T204 1-(4-Trimethylammoniumphenyl)-6-Phenyl-1,3,5-Hexatriene p-Toluenesulfonate
Vacuum filtration flasks CellPro V50022 Filter Unit

References

  1. Prados-Rosales, R., et al. Mycobacteria release active membrane vesicles that modulate immune responses in a TLR2-dependent manner in mice. Journal of Clinical Investigation. 121, 1471-1483 (2011).
  2. Gupta, S., Rodriguez, G. M. Mycobacterial extracellular vesicles and host pathogen interactions. Pathogens and Disease. 76 (4), (2018).
  3. Athman, J. J., et al. Bacterial Membrane Vesicles Mediate the Release of Mycobacterium tuberculosis Lipoglycans and Lipoproteins from Infected Macrophages. Journal of Immunology. 195, 1044-1053 (2015).
  4. Athman, J. J., et al. Mycobacterium tuberculosis Membrane Vesicles Inhibit T Cell Activation. Journal of Immunology. 198, 2028-2037 (2017).
  5. Rath, P., et al. Genetic regulation of vesiculogenesis and immunomodulation in Mycobacterium tuberculosis. Proceedings of the National Academy of Science U.S.A. 110, E4790-E4797 (2013).
  6. White, D. W., Elliott, S. R., Odean, E., Bemis, L. T., Tischler, A. D. Mycobacterium tuberculosis Pst/SenX3-RegX3 Regulates Membrane Vesicle Production Independently of ESX-5 Activity. mBio. 9, pii 00778 (2018).
  7. Dauros Singorenko, P., et al. Isolation of membrane vesicles from prokaryotes: a technical and biological comparison reveals heterogeneity. Journal of Extracellular Vesicles. 6, 1324731 (2017).
  8. Prados-Rosales, R., Brown, L., Casadevall, A., Montalvo-Quiros, S., Luque-Garcia, J. L. Isolation and identification of membrane vesicle-associated proteins in Gram-positive bacteria and mycobacteria. MethodsX. 1, 124-129 (2014).
  9. Prados-Rosales, R., et al. Role for Mycobacterium tuberculosis membrane vesicles in iron acquistion. Journal of Bacteriology. 196, 1250-1256 (2014).
  10. Sanders, E. Aseptic Laboratory Techniques: Plating Methods. Journal of Visualized Experiments. 63, e3064 (2012).
  11. Harlow, E., Lane, L. . Antibodies. A laboratory manual. , (1988).
  12. Lotvall, J., et al. Minimal experimental requirements for definition of extracellular vesicles and their functions: a position statement from the International Society for Extracellular Vesicles. Journal of Extracellular Vesicles. 3, 26913 (2014).

Play Video

Cite This Article
Gupta, S., Marcela Rodriguez, G. Isolation and Characterization of Extracellular Vesicles Produced by Iron-limited Mycobacteria. J. Vis. Exp. (152), e60359, doi:10.3791/60359 (2019).

View Video