Summary
Mycobacterium tuberkulose viser økt produksjon og frigjøring av ekstracellulære blemmer som svar på lave jern forhold. Dette arbeidet detaljer en protokoll for generering av lave jern forhold og metoder for rensing og karakterisering av mykobakterieinfeksjoner ekstracellulære blemmer utgitt som svar på jernmangel.
Abstract
Mykobakterier, inkludert Mycobacterium tuberkulose (MTB), den utløsende Agent for menneskelig tuberkulose, naturlig utgivelse ekstracellulære blemmer (EV) som inneholder immunologisk aktive molekyler. Kunnskap om molekylære mekanismer av vesicle kognitiv, innholdet av blemmer, og deres funksjoner på patogen-vert grensesnittet er svært begrenset. Å ta opp disse spørsmålene krever strenge prosedyrer for isolering, rensing og validering av EV ' r. Tidligere ble det funnet vesicle produksjon som ble forsterket da M. tuberkulose ble utsatt for jern begrensning, en tilstand som ble oppdaget av MTB i vertsmiljøet. Her presenteres en komplett og detaljert protokoll for å isolere og rense EV ' r fra jern mangelfull mykobakterier. Kvantitative og kvalitative metoder brukes for å validere renset EV ' r.
Introduction
Mykobakterieinfeksjoner ekstracellulære blemmer (Model) er membran bundne nanopartikler, 60 − 300 NM i størrelse, naturlig utgitt av hurtig-og sakte voksende mykobakterier1. Model utgitt av patogene mykobakterier utgjør en mekanisme for å samhandle med verten via immunologisk aktive proteiner, lipider, og glykolipider skilles ut i en konsentrert og beskyttet måte2,3,4. Å karakterisere Model og oppfatte deres kognitiv og funksjonene, streng og effektiv metoder av vesicle rensing og godkjenningen er avgjørende. Hittil har Model blitt isolert fra kulturen filtrates av mykobakterier vokst i en jern-rik medium1,5,6,7,8.
Men tidligere arbeid demonstrerte at jern begrensning sterkt stimulerer vesicle utgivelse i MTB, muligens for å fange jern via mycobactin, en siderophore utskilles i Model9. Selv om prosedyrer for Model isolasjon fra MTB kultivert i høyt jern medium har blitt beskrevet, en effektiv metodikk for å få Model fra lav jern kulturer har ikke blitt rapportert. Derfor er målet med denne metoden å isolere, rense og kvantifisere Model innhentet fra lav jern kulturer slik at de kan brukes til biokjemiske og funksjonelle analyser og for analyse av genetiske faktorer for vesicle produksjon i mykobakterier.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. utarbeidelse av jern-utarmet definert medium
- Forbered 1 L av minimal medium (MM) ved å oppløse 5 g av KH2PO4,5g av L-asparagin, 20 ml glyserol og 2 g druesukker i 900 ml deionisert vann i en plastbeholder. Unngå glass for å hindre jern forurensning. Juster pH til 6,8 med 5 N NaOH og volumet til 1 L med vann.
- Tilsett 50 g metall chelaterande harpiks (MCR) og forsiktig agitere ved hjelp av en magnetisk røre bar i 24 timer ved 4 ° c. Sterilisere og fjern MCR ved filtrering gjennom en 0,22 μm Filterenhet med en plast mottaker. For å akselerere filtrering og hindre filter tilstopping, la harpiks sediment i ca 30 min før filtrering.
Merk: Dette mediet inneholder mindre enn 2 μM rest jern, som bestemmes av Atomic absorpsjon spektroskopi. - Tillegg MM med 0,5 mg/L av ZnCl2, 40 mg/l av MgSO4og 0,1 mg/l av MnSO4. Separat, forberede konsentrert aksjer (000x) av hvert av metall tilskudd i deionisert vann og sterilisere ved filtrering før MM tilskudd. Jern-utarmet, metall supplert MM vil bli referert her som lav jern MM (LIMM).
- Fra et 50 mM lager av FeCl3 oppløst i 10 mm HCL, tilsett 1 ml til 1 L av LIMM (50 μM avsluttende konsentrasjon) for å forberede høy jern mm (bare).
2. økende mykobakterier i Iron-begrensede forhold
- Tin ut 50 μL av en frossen 15% glyserol lager av MTB og strek en agar plate supplert med 10% ADN berikelse (5 g/L albumin, 2 g/L druesukker, og 0,85 g/L natriumklorid, 0,2% glyserol og 0,05% mellom-80)10. Ruge platen ved 37 ° c til koloniene er synlige.
- Vaksinere en enkelt koloni av MTB10 i 2 ml mykobakterieinfeksjoner buljong medium (tabell av materialer) supplert med ADN berikelse. Ruge med omrøring ved 37 ° c.
- La MTB kulturen vokse til slutten logaritmisk fase (OD540 er ~ 0,8). Hvis du vil kontrollere dette, måler du OD540 ved hjelp av en spektrofotometer.
- Spre 200 μL av sen logaritmisk kultur på mykobakterieinfeksjoner agar platene (tabell av materialer) supplert med 0,2% glyserol, 0,05% mellom-80 og ADN. Vaksinere minst 5 tallerkener. Ruge platene ved 37 ° c til bakterie veksten er synlig som et confluent lag. Dette tar ~ 1 uke for MTB.
- Fukt en steril bomullspinne i LIMM. Bruk denne pinnen til å samle bakterier fra agar platene og vaksinere 100 mL LIMM for å forberede en konsentrert bakteriell suspensjon med en OD540 på ~ 1,0.
- Fortynne denne suspensjonen 10 ganger til 1 L med LIMM og dele den i to, 2 L sterile plastflasker, hver og en inneholder 500 mL kultur.
- Ta ut 2 mL kultur og overføre den til en 5 mL kultur tube. Tilsett 10 μL av 10% Vol/Vol-tyloksapol.
- Ruge kulturene ved 37 ° c stående i 14 dager.
3. innsamling av Model
- Mål OD540 av 2 ml kultur på tidspunktet for samlingen. Lag 1:10 serie fortynninger av kulturen og tallerkenen 100 μL av hver fortynning på agar plater med ADN og 0,05% mellom-80.
- Overfør kulturen til 5 225 mL koniske sentrifugerør og sentrifuger ved 2 850 x g i 7 min ved 20 ° c.
- Samle kulturen supernatanten med en 50 mL pipette og filter sterilisere det gjennom en 0,22 μm Filterenhet.
4. isolering av Model
- Overfør kultur Filtrer til en rørt celle ultrafiltrering system plassert ved 4 ° c og Filtrer konsentrat på < 50 PSI gjennom en 100 fra kDa-membran til ~ 50 mL.
- Sentrifuger den konsentrerte kulturen Filtrer ved 15 000 x g i 15 min ved 4 ° c og samle supernatanten.
- Sentrifuger kulturen Filtrer i polykarbonat ultracentrifugation rør ved 100 000 x g for 2 t ved 4 ° c.
- Resuspend den membranous pellets i totalt 1 mL sterilt fosfat bufret saltvann (PBS) ved milde pipettering.
- Bland 0,5 mL av pellet suspensjonen innhentet i trinn 4,4 med 1,5 mL 60% iodixanol oppløsning, noe som gir en endelig iodixanol konsentrasjon på 45% WT/Vol. dispensere denne blandingen på bunnen av en 13 mm x 51 mm polypropylen tynne vegger ultracentrifuge tube.
- Overlegg MEV-iodixanol 45% suspensjon med 1 mL 40%, 35%, 30%, 25% og 20% (Vol/Vol i PBS) iodixanol løsninger og 1 mL PBS på toppen.
- Sentrifuger ved 100 000 x g for 18 timer ved 4 ° c.
- Samle 1 mL tetthet gradient fraksjoner fra toppen ved hjelp av en 1 mL Hamilton sprøyte.
- Fortynne hver innsamlede brøk til 20 mL med PBS og sentrifuger ved 100 000 x g for 2 t ved 4 ° c.
- Fjern supernatanten og suspendere pellet i 0,5 mL av PBS. Oppbevar denne pellet ved 4 ° c.
5. kvantifisering av Model
- Mål proteinet konsentrasjon i hver brøkdel av en Bradford analysen (tabell over materialer), etter produsentens retningslinjer.
-
Utføre membran lipid analyse.
- Ruge 10 μL av hver gradient brøk med fluorescerende membran sonde 1-(4-Trimethylammoniumphenyl) -6-fenyl-1, 3, 5-Hexatriene p-TOLUENESULFONATE (TMA-DPH) ved en endelig konsentrasjon på 1 mikrogram/ml i et endelig 50 μL volum av PBS i 96 godt svart Plater.
- Ruge platene ved 33 ° c i 20 min.
- Mål fluorescens ved 360 NM eksitasjon og 430 NM utslipp.
6. kvalitativ analyse av Model
-
Utføre protein elektroforese.
- Bland ca 1 mikrogram MEV-prøver i 16 μL med 4 μL av 5x prøve laste buffer (10% w/v SDS, 10 mM dithiotreitol, 20% v/v glyserol 0,2 M Tris-HCl, pH 6,8 0,05% w/v bromophenol blå) og varm opp prøvene i prøve buffer ved 85 ° c i 5 minutter.
- Load i en 10% Tris/Glycine SDS-polyakrylamid gel11 og kjøre på 10 V/cm i løpende buffer (25 mm Tris base, 190 mm Glycine, 0,1% SDS) til den blå fargestoff fronten når bunnen av gelen.
- Stain gelen med en ultrasensitive protein farging løsning (tabell av materialer).
-
Utfør dot blot.
- Last 2 μL av en Model-suspensjon med en konsentrasjon på ca. 0,5 μg/μL, og todelt seriell fortynninger på en nitrocellulose membran og prosess for en prikk blot i henhold til produsentens instruksjoner.
- Bruk en antiserum som er oppvokst i mus mot en fremstilling av Model ved en fortynning på 1:5000 som primær antistoff og en geit anti-mus koblet til pepperrot peroksidase (HRP) på en 1:10000 fortynning som sekundær antistoff. Oppdage antigen-antistoff komplekser med en hensiktsmessig HRP substrat blotting Detection reagens og et bildesystem.
-
Utføre negative flekker og elektron mikroskopi.
- Fix 250 μL av Model med 2% glutaraldehyde i 0,1 M cacodylate ved romtemperatur for 2 h og ruge over natten i 4% formaldehyd, 1% glutaraldehyde, og 0,1% PBS.
- Stain de faste prøvene med 2% Osmium tetroxide for 90 min.
- Serielt tørke prøven i etanol og legge i Spurr ' s epoxy harpiks.
- Observer Model under et overførings elektronmikroskop.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Model ble renset ved differensial sedimentering i en tetthet gradient (figur 1, figur 2). Under forholdene beskrevet, Model separert det meste i gradient brøkdel 3 (F3), som tilsvarer 25% iodixanol. Denne konklusjonen er basert på påvisning av protein, membran lipid, mikroskopisk visualisering av intakt Model, nanopartikkel størrelsesfordeling, og positiv reaktivitet med en antivesicle antiserum (figur 2, Figur 3). Protein og lipid konsentrasjon normalisert til koloni-forming enheter (CFUs) viste en ca Eightfold økning på MEV yield i lavt jern forhold til høye jern forhold (50 μM FeCl3) (Figur 3). Selv om resultatene av ett representativt eksperiment presenteres, er dette et svært reproduserbar resultat basert på flere (> 10) isolasjoner av Model. Den rene MEV yield Hentet fra en 1 L lav jern kultur ved denne metoden var ca 500 mikrogram protein.
Figur 1: diagrammatisk representasjon av metodikken som brukes for MEV rensing og kvantifisering. Mykobakterier dyrket i agar plater ble brukt til å vaksinere jern-utarmet minimalt medium og vokse MTB for EV isolasjon. Model ble renset ved en usammenhengende tetthet gradient fra cellen-fri kultur Filtrer. En kombinasjon av membran lipid og vesicle protein bestemmelse, mikroskopi, og nanopartikkel analyse ble iverksatt for å karakterisere renset Model. Vennligst klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 2: karakterisering av renset Model. (A) vises er fotografier av en faktisk tetthet gradient separasjon av råolje Model og pellet av renset Model samlet inn av ultracentrifugation av gradient brøkdel 3 (F3). (B) SDS-gel beiset viser protein profilen til de ulike tettheten gradient fraksjoner. (C) dot blot-analyse som viser vesicle-tilknyttede proteiner konsentrert i F3. (D) Model tilstede i F3 observert ved negative flekker. (E) MEV størrelsesfordeling i henhold til nanopartikkel analyse (nTa). Vennligst klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 3: komparativ analyse av MEV yield i lave og høye jern kulturer. Et representativt resultat av (A) protein og lipid kvantifisering og (B) dot blot analyse av renset Model isolert fra jern-begrenset og jern tilstrekkelig MTB kulturer. Vennligst klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Flere metoder for å rense eukaryote celle-avledet exosomes har blitt utviklet12. I kontrast er det begrenset informasjon om effektive metoder for å rense bakterier-avledet EV7. Effektiv isolering av MTB-avledet EV ' r må vurdere de iboende vanskelighetene med å dyrke denne patogene Mycobacterium. MTB har en lang divisjon tid (~ 24 h) og bør håndteres i biosafety nivå tre (BSL-3) forhold. Derfor er det viktig å optimalisere effektiviteten av MEV isolasjons metoder. Fordi mykobakterier frigjør glykolipider og andre hydrofobe molekyler som samlet og lett forurenser rå MEV preparater inn i mediet, er det viktig å rense og validere Model før du gjennomfører biokjemiske og funksjonelle studier. Basert på tidligere observasjoner som demonstrerte at MTB forbedrer utgivelsen av Model under forhold av jern begrensning, ble en protokoll etablert for EV rensing av jern begrenset mykobakterier. Det har også blitt bekreftet at ikke-ondartet M. smegmatis også øker utslipp av EV ' r som respons på lave jern forhold (data ikke vist). Derfor kan den samme protokollen brukes til å rense EV-er fra denne bakterien i BSL-2 forhold.
Et kritisk trinn i denne prosedyren er utarbeidelse av lav jern medium. Dette mediet bør være forberedt som beskrevet her og lagres i en plastbeholder, ikke i glass, for å hindre jern forurensning. Kosttilskudd som vanligvis brukes i MTB vekstmedium for å stimulere bakteriell vekst og hindre karakteristiske mykobakterieinfeksjoner klumper, slik som storfe serum albumin, mellom-80, eller tyloksapol, må unngås. Disse tilsetningsstoffene føre til lipoprotein komplekse gjenstander som copurify med blemmer og redusere vesicle yield. For CFU bestemmelse, en liten kultur i medium supplert med vaskemiddel (mellom-80 eller tyloksapol) kan settes parallelt med vaskemiddel-fri stor kultur. Model i kultur Filtrer er stabile ved 4 ° c i flere dager. Derfor, hvis ikke behandles umiddelbart, kan kulturen Filtrer oppbevares nedkjølt.
Den totale avkastningen av renset MEV fra 1 L kultur var rundt 500 μg/L protein, som er tilstrekkelig til å utføre flere analyser som Proteomikk, lipidomics og funksjonelle analyser. Avhengig av typen av analysen, kan tilstrekkelig Model isoleres fra mindre volumer (dvs. 250 mL). Dette forenkler sammenlignende analyse av forhold og faktorer som påvirker MEV utgivelse.
Dette er en effektiv metode for å rense Model, men det har begrensninger. Det er en lang prosedyre med flere ultracentrifugation trinn. I fremtiden vil denne metoden bli sammenlignet med gel filtrering kromatografi, og som molekylære markører for Model oppdages, kan affinitet fangstmetoder implementeres. Vertsmiljøet er jern begrenset, derfor Model produsert av MTB i et lavt jern medium er trolig tettere knyttet til Model produsert under infeksjon og kunne gi relevant innsikt om rollen som Model i tuberkulose patogenesen.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne har ingen interessekonflikter.
Acknowledgments
Vi er takknemlige for Rafael Prados-Rosales for å dele anti-MEV antisera og Navneet Dogra for å utføre nanopartikkel sporings analyse.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Amicon stirred cell Model 108 | EMD Milipore | UFSC40001 | Cell Ultrafiltration system |
| BD Polypropilene 225 mL conical tubes | Fisher | 05-538-61 | Conical centrifuge tubes |
| Biomax 100 kDa cut-off ultrafiltration membrane | EMD Milipore | PBHK07610 | Ultrafiltration membrane |
| Chelex-100 resin | Bio-Rad | 142-2842 | Metal chelating resin |
| Middlebrook 7H10 Agar | BD Difco | 262710 | Mycobacterial Agar plates |
| Middlebrook 7H9 Broth | BD Difco | 271310 | Mycobacterial broth medium |
| Nitro cellulose blotting membrane | GE Healthcare | 10600001 | Blotting Membrane |
| Optiprep | Sigma | D1556 | Iodixanol |
| Polycarbonate ultra centrifugation tubes 25 mm x 89 mm | Beckman Coulter | 355618 | Polycarbonate ultra centrifugation tubes 25 mm x 89 mm |
| Polypropylene thin walled centrifuge tube 13 mm x 15 mm | Beckman Coulter | 344059 | Polypropylene thin walled centrifuge tube 13 mm x 15 mm |
| Protein Assay dye | BioRad | 5000006 | Bradford Protein Staining |
| SYPRO Ruby | Molecular Probes | S12000 | Ultrasensitive protein stain |
| TMA-DPH | Molecular Probes | T204 | 1-(4-Trimethylammoniumphenyl)-6-Phenyl-1,3,5-Hexatriene p-Toluenesulfonate |
| Vacuum filtration flasks | CellPro | V50022 | Filter Unit |
References
- Prados-Rosales, R., et al. Mycobacteria release active membrane vesicles that modulate immune responses in a TLR2-dependent manner in mice. Journal of Clinical Investigation. 121, 1471-1483 (2011).
- Gupta, S., Rodriguez, G. M. Mycobacterial extracellular vesicles and host pathogen interactions. Pathogens and Disease. 76 (4), (2018).
- Athman, J. J., et al. Bacterial Membrane Vesicles Mediate the Release of Mycobacterium tuberculosis Lipoglycans and Lipoproteins from Infected Macrophages. Journal of Immunology. 195, 1044-1053 (2015).
- Athman, J. J., et al. Mycobacterium tuberculosis Membrane Vesicles Inhibit T Cell Activation. Journal of Immunology. 198, 2028-2037 (2017).
- Rath, P., et al. Genetic regulation of vesiculogenesis and immunomodulation in Mycobacterium tuberculosis. Proceedings of the National Academy of Science U.S.A. 110, E4790-E4797 (2013).
- White, D. W., Elliott, S. R., Odean, E., Bemis, L. T., Tischler, A. D. Mycobacterium tuberculosis Pst/SenX3-RegX3 Regulates Membrane Vesicle Production Independently of ESX-5 Activity. mBio. 9, pii 00778 (2018).
- Dauros Singorenko, P., et al. Isolation of membrane vesicles from prokaryotes: a technical and biological comparison reveals heterogeneity. Journal of Extracellular Vesicles. 6, 1324731 (2017).
- Prados-Rosales, R., Brown, L., Casadevall, A., Montalvo-Quiros, S., Luque-Garcia, J. L. Isolation and identification of membrane vesicle-associated proteins in Gram-positive bacteria and mycobacteria. MethodsX. 1, 124-129 (2014).
- Prados-Rosales, R., et al. Role for Mycobacterium tuberculosis membrane vesicles in iron acquistion. Journal of Bacteriology. 196, 1250-1256 (2014).
- Sanders, E. Aseptic Laboratory Techniques: Plating Methods. Journal of Visualized Experiments. 63, e3064 (2012).
- Harlow, E., Lane, L. Antibodies. A laboratory manual. , Cold Spring Harbor Laboratory. (1988).
- Lotvall, J., et al. Minimal experimental requirements for definition of extracellular vesicles and their functions: a position statement from the International Society for Extracellular Vesicles. Journal of Extracellular Vesicles. 3, 26913 (2014).
