Summary
माइकोबैक्टीरियम तपेदिक कम लोहे की स्थिति के जवाब में अतिरिक्त कोशिकीय vesicles के उत्पादन और रिहाई में वृद्धि से पता चलता है। यह काम कम लोहे की स्थिति और शोधन और लोहे की कमी के जवाब में जारी mycobactrial extracellular vesicles के लक्षण के लिए तरीकों के उत्पादन के लिए एक प्रोटोकॉल का विवरण.
Abstract
माइकोबैक्टीरियम तपेदिक (एमटीबी), मानव तपेदिक के कारक एजेंट सहित माइकोबैक्टीरिया, स्वाभाविक रूप से प्रतिरक्षा त्मक रूप से सक्रिय अणुओं वाले एक्स्ट्रासेल्यूलर वेसिकल (ईवीएस) को रिलीज करता है। vesicle जीवजनन के आणविक तंत्र के बारे में ज्ञान, vesicles की सामग्री, और रोगज़नक़-होस्ट इंटरफ़ेस पर उनके कार्य बहुत सीमित है। इन सवालों को संबोधित अलगाव, शुद्धि, और EVs के सत्यापन के लिए कठोर प्रक्रियाओं की आवश्यकता है. इससे पहले, vesicle उत्पादन बढ़ाया जा करने के लिए पाया गया था जब एम तपेदिक लोहे के प्रतिबंध के संपर्क में था, मेजबान वातावरण में Mtb द्वारा सामना करना पड़ा एक शर्त. यहाँ प्रस्तुत एक पूर्ण और विस्तृत प्रोटोकॉल को अलग करने और लोहे की कमी माइकोबैक्टीरिया से EVs शुद्ध है. मात्रात्मक और गुणात्मक तरीके शुद्ध EVs को मान्य करने के लिए लागू कर रहे हैं.
Introduction
माइकोबैक्टीरियल एक्स्ट्रासेलुलर vesicles (MEVs) झिल्ली से बंधे नैनोकणों, आकार में 60 डिग्री 300 एनएम, स्वाभाविक रूप से तेजी से और धीमी गति से बढ़ रही माइकोबैक्टीरिया1द्वारा जारी कर रहे हैं। रोगजनक माइकोबैक्टीरिया द्वारा जारी किए गए एमईवी एक तंत्र का गठन करते हैं जो इम्यूनोलॉजिकल रूप से सक्रिय प्रोटीन , लिपिड और ग्लाइकोलिपिड के माध्यम से मेजबान के साथ बातचीत करता है , जो एक केंद्रित और संरक्षित तरीके सेस्रावितहोता है 2,3,4. MEVs की विशेषता और उनके जीवजनन और कार्यों को समझने के लिए, vesicle शुद्धि और सत्यापन के सख्त और कुशल तरीके महत्वपूर्ण हैं. अब तक एमईवी को लौह समृद्ध माध्यम1,5,6,7,8में उगाए गए माइकोबैक्टीरिया की संस्कृति से अलग कर दिया गया है ।
हालांकि, पिछले काम का प्रदर्शन किया है कि लोहे की सीमा बहुत Mtb में vesicle रिहाई को उत्तेजित करता है, संभवतः mycobactin के माध्यम से लोहे पर कब्जा करने के लिए, एक siderophore MEVs9में स्रावित . हालांकि उच्च लौह माध्यम में संरक्षित Mtb से MEVs अलगाव के लिए प्रक्रियाओं का वर्णन किया गया है, कम लौह संस्कृतियों से MEVs प्राप्त करने के लिए एक कुशल पद्धति की सूचना नहीं दी गई है. इसलिए, इस विधि का लक्ष्य कम लौह संस्कृतियों से प्राप्त MEVs को अलग, शुद्ध, और परिमाणित करना है ताकि उनका उपयोग जैव रासायनिक और कार्यात्मक परख के लिए और माइकोबैक्टीरिया में vesicle उत्पादन के आनुवंशिक निर्धारकों के विश्लेषण के लिए किया जा सके।
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Protocol
1. आयरन-डिक्लेड परिभाषित माध्यम की तैयारी
- न्यूनतम मध्यम (एमएम) के 1 एल को भंग करके 5 ग्राम KH2PO4, 5 ग्राम L-asparagine, 20 एमएल ग्लिकरॉल, और 2 ग्राम डेक्सट्रोज को प्लास्टिक के कंटेनर में 900 एमएल में deonized पानी में घोलकर तैयार करें। लोहे के संदूषण को रोकने के लिए कांच से बचें। 5 छ नाह तथा मात्रा 1 ल् को जल के साथ 6ण्8 में pH समायोजित करें।
- 50 ग्राम धातु chelating राल (एमसीआर) जोड़ें और धीरे 4 डिग्री सेल्सियस पर 24 एच के लिए एक चुंबकीय हलचल पट्टी का उपयोग कर उत्तेजित। स्टरलाइज़ करें और एक प्लास्टिक रिसीवर के साथ एक 0.22 डिग्री डिग्री फिल्टर इकाई के माध्यम से निस्पंदन द्वारा एमसीआर निकालें। निस्पंदन में तेजी लाने और फिल्टर clogging को रोकने के लिए, निस्पंदन से पहले के बारे में 30 मिनट के लिए राल तलछट करते हैं।
नोट: इस माध्यम में कम से कम 2 डिग्री सेल्सियस अवशिष्ट लोहा होता है, के रूप में परमाणु अवशोषण स्पेक्ट्रोस्कोपी द्वारा निर्धारित. - अनुपूरक एमएम के साथ 0ण्5 mg/L के nCl2, 40 mg/L के MgSO4, और 0.1 mg/L के MnSO4. अलग से, deionized पानी में धातु की खुराक में से प्रत्येक के केंद्रित स्टॉक (1,000x) तैयार करने और MM पूरकता से पहले निस्पंदन द्वारा बाँझ. आयरन depleted, धातु पूरक एमएम यहाँ कम लौह एमएम (LIMM) के रूप में भेजा जाएगा.
- FeCl3 के एक 50 मिमी स्टॉक से 10 मिमी एचसीएल में भंग, उच्च लौह एमएम (HIM) तैयार करने के लिए LIMM (50 डिग्री एम अंतिम एकाग्रता) के 1 एल करने के लिए 1 एमएल जोड़ें।
2. आयरन-सीमित स्थितियों में माइकोबैक्टीरिया बढ़ रहा है
- Mtb और लकीर एक agar प्लेट के एक जमे हुए 15% ग्लिसरॉल स्टॉक के 50 डिग्री एल बाहर फेंक 10% ADN संवर्धन (5 g/L albumin, 2 g/L डेक्सट्रोज, और 0.85 g/L सोडियम क्लोराइड, 0.2% ग्लिसरॉल और 0.05% Tween-80)10के साथ पूरक . प्लेट को 37 डिग्री सेल्सियस पर तब तक इन्क्यूबेट करें जब तक कि कॉलोनियां दिखाई न दे।
- माइकोबैक्टीरियल शोरबा माध्यम के 2 एमएल में Mtb10 की एक एकल कॉलोनी टीका (सामग्री की तालिका) एडीएन संवर्धन के साथ पूरक. 37 डिग्री सेल्सियस पर आंदोलन के साथ इनक्यूबेट।
- Mtb संस्कृति देर लघुगणकीय चरण के लिए विकसित करने दें (OD540 है $0.8). यह जाँच करने के लिए, OD540 एक स्पेक्ट्रोफोटोमीटर का उपयोग कर उपाय.
- माइकोबैक्टीरियल एगार प्लेट्स (सामग्री की तालिका) पर देर से लघुगणकीय संस्कृति के 200 डिग्री एल बिखरा हुआ है , 0.2% ग्लिसरोल के साथ पूरक, 0.05% ट्वीन-80, और एडीएन। कम से कम 5 प्लेटें टीका. प्लेटों को 37 डिग्री सेल्सियस पर तब तक इन्क्यूबेट करें जब तक कि जीवाणु वृद्धि एक प्रवाही परत के रूप में दिखाई न दे। यह Mtb के लिए $ 1 सप्ताह लेता है.
- LIMM में एक बाँझ कपास झाड़ू गीला. इस झाड़ू का उपयोग आगर प्लेटों से बैक्टीरिया इकट्ठा करने के लिए और LIMM के 100 एमएल टीका करने के लिए एक OD540 के साथ एक केंद्रित जीवाणु निलंबन तैयार करने के लिए $1.0.
- इस निलंबन को 10 बार एल एल के साथ एल एम आई एम के साथ अलग करें और इसे दो, 2 एल बाँझ प्लास्टिक की बोतलों में विभाजित करें, प्रत्येक एक जिसमें 500 एमएल संस्कृति है।
- संस्कृति के 2 एमएल बाहर ले लो और यह एक 5 एमएल संस्कृति ट्यूब को स्थानांतरित. 10% vol/vol tyloxapol के 10 $L जोड़ें.
- 37 डिग्री सेल्सियस पर 14 दिनों के लिए खड़े संस्कृतियों इनक्यूबेट।
3. एमईवी का संग्रह
- संग्रह के समय 2 एमएल संस्कृति के OD540 को मापने। संस्कृति और प्लेट 100 डिग्री सेल्सियस के 1:10 धारावाहिक कमजोर पड़ने एडीएन और 0.05% ट्वीन-80 के साथ आगर प्लेटों पर कमजोर पड़ने के 1:10 डिग्री सेल्सियस बनाओ।
- संस्कृति को 225 एमएल शंकु अपकेंद्रित्र ट्यूबों और अपकेंद्रित्र को 20 डिग्री सेल्सियस पर 7 मिनट के लिए 2,850 x ग्राम पर स्थानांतरित करें।
- एक 50 एमएल पिपेट के साथ संस्कृति supernatant ले लीजिए और फिल्टर यह एक 0.22 डिग्री फिल्टर इकाई के माध्यम से बाँझ.
4. एमईवी का अलगाव
- संस्कृति निस्पंदन को 4 डिग्री सेल्सियस पर रखा गया एक हलचल वाले सेल अल्ट्राफिल्ट्रेशन सिस्टम में स्थानांतरित करें और 100 केडीए कटऑफ झिल्ली के माध्यम से $ 50 एमएल पर ध्यान केंद्रित को फ़िल्टर करें।
- 4 डिग्री सेल्सियस पर 15 मिनट के लिए 15,000 x ग्राम पर केंद्रित संस्कृति छानना और supernatant इकट्ठा.
- 4 डिग्री सेल्सियस पर 2 एच के लिए 100,000 x ग्राम पर पॉलीकार्बोनेट अल्ट्रासेंट्रीफ्यूगेशन ट्यूबों में संस्कृति छानना।
- कोमल पाइपिंग द्वारा बाँझ फॉस्फेट बफर्ड नमकीन (पीबीएस) की कुल 1 एमएल में झिल्लीदार छर्रों को पुन: निलंबित करें।
- 60% iodixanol समाधान के 1.5 एमएल के साथ चरण 4.4 में प्राप्त गोली निलंबन के 0.5 एमएल मिलाएं, 45% wt/vol की एक अंतिम iodixanol एकाग्रता उपज. एक 13 मिमी x 51 मिमी polypropylene पतली दीवारों ultracentrifuge ट्यूब के तल पर इस मिश्रण का प्रसार।
- एमईवी-iodixanol 45% निलंबन 40%, 35%, 30%, 25%, और 20% (पीबीएस में vol/vol) iodixanol समाधान और शीर्ष पर पीबीएस के 1 एमएल के साथ ओवरले।
- 4 डिग्री सेल्सियस पर 18 ज के लिए 100,000 x ग्राम पर सेंट्रीफ्यूज।
- एक 1 एमएल हैमिल्टन सिरिंज का उपयोग कर शीर्ष से शुरू 1 एमएल घनत्व ग्रेडिएंट भिन्नले लीजिए।
- प्रत्येक एकत्र अंश को पीबीएस के साथ 20 एमएल और अपकेंद्रित्र के साथ 100,000 x ग्राम पर 4 डिग्री सेल्सियस पर 2 h के लिए एकत्र किया।
- सुपरनेंट निकालें और पीबीएस के 0.5 एमएल में गोली निलंबित. इस गोली को 4 डिग्री सेल्सियस पर स्टोर करें।
5. एमईवी का परिमाणीकरण
- निर्माता के दिशा निर्देशों का पालन करते हुए, एक ब्रैडफोर्ड परख(सामग्री की तालिका)द्वारा प्रत्येक अंश में प्रोटीन एकाग्रता को मापने।
-
झिल्ली लिपिड विश्लेषण प्रदर्शन.
- 96 में पीबीएस की अंतिम सांद्रता में 1 डिग्री सेल्सियस की अंतिम सांद्रता में 1 डिग्री सेल्सियस की अंतिम सांद्रता में 1-4-Trimethylammoniumphenyl)-6-Phenyl-1,3,5-Hexatriene p-Toluenesulfonet (TMA-DPH) की अंतिम सांद्रता में 1 डिग्री/ प्लेटें.
- 20 मिनट के लिए 33 डिग्री सेल्सियस पर प्लेटों को इनक्यूबेट करें।
- 360 एनएम उत्तेजना और 430 एनएम उत्सर्जन पर फ्लोरोसेंट को मापने।
6. एमईवी का गुणात्मक विश्लेषण
-
प्रोटीन इलेक्ट्रोफोरोसिस करें।
- मिश्रण लगभग 1 $ एमईवी नमूनों के 16 डिग्री एल के साथ 4 $L 5x नमूना लोड हो रहा है बफर (10% w/v एसडीएस, 10 m dithiothreitol, 20% v/v ग्लिसरॉल 0.2 एम Tris-HCl, पीएच 6.8 0.05% wv bromophenol नीले) और गर्मी के नमूने बफर सी 5 के लिए बफर सी 5 में नमूने।
- एक 10% Tris/Glycine SDS-polyacrylamide जेल11 में लोड और बफर (25 एमएम Tris आधार, 190 m ग्लिसिन, 0.1% एसडीएस) चलाने में 10 V/cm पर चलाने के लिए जब तक नीले रंग सामने जेल के नीचे तक पहुँचता है.
- एक अति संवेदी प्रोटीन धुंधला समाधान के साथ जेल दाग (सामग्री की तालिका).
-
डॉट दाग प्रदर्शन.
- लगभग 0.5 डिग्री सेल्सियस की एकाग्रता के साथ एक एमईवी निलंबन के 2 डिग्री सेल्सियस लोड करें, और निर्माता के निर्देशों के अनुसार एक डॉट ब्लॉट के लिए नाइट्रोसेलुलोस झिल्ली और प्रक्रिया पर दो गुना सीरियल कमजोर पड़ने।
- प्राथमिक एंटीबॉडी के रूप में 1:5,000 की एक कमजोर पड़ने पर MEVs की तैयारी के खिलाफ चूहों में उठाया एक antiserum का प्रयोग करें और एक बकरी विरोधी माउस के लिए जोड़ा horsadish peroxidase (HRP) पर एक 1:10,000 कमजोर पड़ने माध्यमिक एंटीबॉडी के रूप में. एक उपयुक्त एचआरपी सब्सट्रेट ब्लटिंग डिटेक्शन रिएजेंट और एक इमेजिंग सिस्टम के साथ एंटीजन-एंटीबॉडी परिसरों का पता लगाएं।
-
नकारात्मक धुंधला और इलेक्ट्रॉन माइक्रोस्कोपी प्रदर्शन.
- 2.1 एम कोडिऐलेट में 2% glutaraldehyde के साथ एमईवी के 250 डिग्री सेल्सियस को ठीक करें 2 एच के लिए कमरे के तापमान पर और 4% फॉर्मेल्डिहाइड, 1% ग्लूटारैल्डिहाइड, और 0.1% पीबीएस में रात भर इनक्यूबेट करें।
- 90 मिनट के लिए 2% ऑस्मियम टेट्रिक्साइड के साथ निश्चित नमूनों को दागें।
- क्रमिक रूप से इथेनॉल में नमूना निर्जलित और Spurr के epoxy राल में एम्बेड.
- एमईवी को संचरण इलेक्ट्रॉन सूक्ष्मदर्शी के अंतर्गत प्रेक्षण कीजिए।
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Representative Results
एमईवी घनत्व प्रवणता में विभेदक अवसादन द्वारा शुद्ध किए गए थे (चित्र 1, चित्र 2) . वर्णित शर्तों के तहत, MEVs ज्यादातर ढाल अंश 3 (F3) में अलग है, जो 25% iodixanol से मेल खाती है. यह निष्कर्ष प्रोटीन का पता लगाने पर आधारित है, झिल्ली लिपिड, बरकरार MEVs के सूक्ष्म दृश्य, नैनोकण आकार वितरण, और एक antivesicle antiserum के साथ सकारात्मक प्रतिक्रिया (चित्र 2, चित्र 3). प्रोटीन और लिपिड सांद्रता को उपनिवेश बनाने वाली इकाइयों (सीएफयू) में उच्च लौह स्थितियों (50 डिग्री एम फेसीएल 3 ) (चित्र3) के सापेक्ष कम लौह में एमईवी उपज की लगभग आठ गुना वृद्धि दिखाई दी । हालांकि एक प्रतिनिधि प्रयोग के परिणाम प्रस्तुत किया है, यह एक अत्यधिक reprod्य परिणाम के आधार पर कई (gt; 10) MEVs के isolations है. शुद्ध MEV इस विधि द्वारा एक 1 एल कम लोहे की संस्कृति से प्राप्त उपज प्रोटीन के लगभग 500 डिग्री था.
चित्र 1: एमईवी शोधन और परिमाणीकरण के लिए प्रयुक्त पद्धति का आरेखीय निरूपण। आगर प्लेटों में उगाए गए माइकोबैक्टीरिया का उपयोग लोहे से भरे न्यूनतम माध्यम को टीका लगाने और ईवी अलगाव के लिए Mtb विकसित करने के लिए किया जाता था। MEVs सेल मुक्त संस्कृति छानत से एक discontinuous घनत्व ढाल द्वारा शुद्ध किया गया. झिल्ली लिपिड और vesicle प्रोटीन दृढ़ संकल्प, माइक्रोस्कोपी, और नैनोकण विश्लेषण का एक संयोजन शुद्ध MEVs की विशेषता के लिए लागू किया गया था. कृपया इस चित्र का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.
चित्र 2: शुद्ध MEVs की विशेषता. (क)दिखाया गया है कच्चे तेल MEVs के एक वास्तविक घनत्व ढाल जुदाई और ढाल अंश 3 (F3) के ultracentrifugation द्वारा एकत्र शुद्ध MEVs की गोली की तस्वीरें हैं. (ख)एसडीएस-जेल ने विभिन्न घनत्व प्रवणता अंशों की प्रोटीन प्रोफाइल को प्रदर्शित किया है। (ग)डॉट ब्लॉट विश्लेषण जिसमें आशय-संबद्ध प्रोटीन F3 में केंद्रित हैं। (घ)एफ 3 में उपस्थित एमईवी नकारात्मक धुंधला द्वारा मनाया जाता है। (ई) एमईवी आकार वितरण नैनोकण विश्लेषण (एनटीए) के अनुसार। कृपया इस चित्र का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.
चित्र 3: निम्न और उच्च लौह संस्कृतियों में एमईवी उपज का तुलनात्मक विश्लेषण। (ए) प्रोटीन और लिपिड परिमाणीकरण और (बी) का एक प्रतिनिधि परिणाम, लौह-सीमित और लौह पर्याप्त Mtb संस्कृतियों से अलग शुद्ध MEVs के डॉट ब्लॉट विश्लेषण. कृपया इस चित्र का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.
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Discussion
यूकैरियोटिक कोशिका व्युत्पन्न एक्सोसोम को शुद्ध करने के लिए अनेक विधियों काविकास कियागया है। इसके विपरीत, बैक्टीरिया व्युत्पन्न EVs7को शुद्ध करने के लिए प्रभावी तरीकों पर सीमित जानकारी है। Mtb व्युत्पन्न EVs के कुशल अलगाव इस रोगजनक माइकोबैक्टीरियम बढ़ने में आंतरिक कठिनाइयों पर विचार करने की जरूरत है. Mtb एक लंबा विभाजन समय है ($ 24 एच) और जैव सुरक्षा स्तर तीन (BSL-3) शर्तों में नियंत्रित किया जाना चाहिए. इसलिए, यह MEV अलगाव विधियों की दक्षता का अनुकूलन करने के लिए महत्वपूर्ण है। क्योंकि माइकोबैक्टीरिया ग्लाइकोलिपिड और अन्य हाइड्रोफोबिक अणुओं को रिलीज करते हैं जो मध्यम में कच्चे एमईवी की तैयारी को एकीकृत और आसानी से दूषित करते हैं, जैव रासायनिक और कार्यात्मक अध्ययन करने से पहले एमईवी को शुद्ध और मान्य करना महत्वपूर्ण है। पिछले टिप्पणियों है कि प्रदर्शन किया है कि Mtb लोहे की सीमा की शर्तों के तहत MEVs की रिहाई को बढ़ाता है के आधार पर, एक प्रोटोकॉल लोहे से EV शुद्धि के लिए स्थापित किया गया था सीमित माइकोबैक्टीरिया. यह भी पुष्टि की गई है कि गैर-विषम एम smegmatis भी कम लोहे की स्थिति के जवाब में EVs की रिहाई बढ़ जाती है (डेटा नहीं दिखाया). इसलिए, एक ही प्रोटोकॉल बीएसएल-2 शर्तों में इस जीवाणु से EVs शुद्ध करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है।
इस प्रक्रिया का एक महत्वपूर्ण कदम कम लौह माध्यम की तैयारी है। इस माध्यम के रूप में यहाँ वर्णित तैयार किया जाना चाहिए और एक प्लास्टिक कंटेनर में संग्रहीत, कांच में नहीं, लोहे के संदूषण को रोकने के लिए. आमतौर पर Mtb विकास के माध्यम में इस्तेमाल की खुराक जीवाणु विकास को प्रोत्साहित करने और इस तरह के गोजातीय सीरम एल्बुमिन, ट्वीन-80, या tyloxapol के रूप में विशेषता माइकोबैक्टीरियल clumping को रोकने के लिए, से बचा जाना चाहिए। इन additives लिपोप्रोटीन जटिल कलाकृतियों है कि vesicles के साथ copurify और vesicle उपज को कम करने के लिए नेतृत्व. CFU दृढ़ संकल्प के लिए, मध्यम में एक छोटी सी संस्कृति डिटर्जेंट के साथ पूरक (Tween-80 या tyloxapol) डिटर्जेंट मुक्त बड़ी संस्कृति के समानांतर में स्थापित किया जा सकता है. संस्कृति छानना में MEVs कई दिनों के लिए 4 डिग्री सेल्सियस पर स्थिर हैं. इसलिए, यदि तुरंत संसाधित नहीं किया जाता है, तो संस्कृति निस्यंदक को फ्रिज में रखा जा सकता है।
संस्कृति के 1 एल से शुद्ध एमईवी की कुल उपज लगभग 500 ग्राम/एल प्रोटीन थी, जो प्रोटीओमिक्स, लिपिडोमिक्स, और कार्यात्मक परख जैसे कई विश्लेषणों का संचालन करने के लिए पर्याप्त है। परख के प्रकार के आधार पर, पर्याप्त MEVs छोटे संस्करणों से अलग किया जा सकता (यानी, 250 एमएल). यह एमईवी रिलीज को प्रभावित करने वाली स्थितियों और कारकों के तुलनात्मक विश्लेषण की सुविधा प्रदान करता है।
यह MEVs को शुद्ध करने के लिए एक प्रभावी तरीका है, लेकिन यह सीमाएं हैं। यह कई ultracentrifugation कदम के साथ एक लंबी प्रक्रिया है. भविष्य में, इस विधि जेल निस्पंदन क्रोमैटोग्राफी की तुलना में किया जाएगा, और MEVs के आणविक मार्करों की खोज कर रहे हैं के रूप में, आत्मीयता पर कब्जा तरीकों को लागू किया जा सकता है. मेजबान पर्यावरण लोहा सीमित है, इसलिए एक कम लोहे के माध्यम में Mtb द्वारा उत्पादित MEVs शायद अधिक बारीकी से संक्रमण के दौरान उत्पादित MEVs से संबंधित हैं और तपेदिक रोगजनन में MEVs की भूमिका के बारे में प्रासंगिक अंतर्दृष्टि प्रदान कर सकता है.
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Disclosures
लेखकों के हितों का कोई टकराव नहीं है.
Acknowledgments
नैनोकण ट्रैकिंग विश्लेषण करने के लिए एंटी-एमईवी एंटीसेरा और नवनीत डोगरा को साझा करने के लिए हम राफेल Prados-Rosales के आभारी हैं।
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Amicon stirred cell Model 108 | EMD Milipore | UFSC40001 | Cell Ultrafiltration system |
| BD Polypropilene 225 mL conical tubes | Fisher | 05-538-61 | Conical centrifuge tubes |
| Biomax 100 kDa cut-off ultrafiltration membrane | EMD Milipore | PBHK07610 | Ultrafiltration membrane |
| Chelex-100 resin | Bio-Rad | 142-2842 | Metal chelating resin |
| Middlebrook 7H10 Agar | BD Difco | 262710 | Mycobacterial Agar plates |
| Middlebrook 7H9 Broth | BD Difco | 271310 | Mycobacterial broth medium |
| Nitro cellulose blotting membrane | GE Healthcare | 10600001 | Blotting Membrane |
| Optiprep | Sigma | D1556 | Iodixanol |
| Polycarbonate ultra centrifugation tubes 25 mm x 89 mm | Beckman Coulter | 355618 | Polycarbonate ultra centrifugation tubes 25 mm x 89 mm |
| Polypropylene thin walled centrifuge tube 13 mm x 15 mm | Beckman Coulter | 344059 | Polypropylene thin walled centrifuge tube 13 mm x 15 mm |
| Protein Assay dye | BioRad | 5000006 | Bradford Protein Staining |
| SYPRO Ruby | Molecular Probes | S12000 | Ultrasensitive protein stain |
| TMA-DPH | Molecular Probes | T204 | 1-(4-Trimethylammoniumphenyl)-6-Phenyl-1,3,5-Hexatriene p-Toluenesulfonate |
| Vacuum filtration flasks | CellPro | V50022 | Filter Unit |
References
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