Summary
Mycobacterium tuberculosis visar ökad produktion och frisättning av extracellulära blåsor som svar på låga järn förhållanden. Detta arbete specificerar ett protokoll för att generera låga järn förhållanden och metoder för rening och karakterisering av mycobakteriell extracellulära blåsor som släppts som svar på järnbrist.
Abstract
Mykobakterier, inklusive Mycobacterium tuberculosis (MTB), smittämnen av mänsklig tuberkulos, naturligt frisättning extracellulära blåsor (EVS) som innehåller immunologiskt aktiva molekyler. Kunskap om de molekylära mekanismerna hos vesikler biogenes, innehållet i vesiklarna, och deras funktioner vid pathogen-Host-gränssnittet är mycket begränsad. Att ta itu med dessa frågor kräver rigorösa procedurer för isolering, rening och validering av EVs. Tidigare konstaterades att vesikelproduktionen förstärktes när M. tuberkulos utsattes för järn restriktion, ett tillstånd som MTB stötte på i värdmiljön. Presenteras här är ett komplett och detaljerat protokoll för att isolera och rena EVs från järn-bristfällig mykobakterier. Kvantitativa och kvalitativa metoder tillämpas för att validera renade EVs.
Introduction
Mykobakteriella extracellulära blåsor (MEVS) är membran-bundna nanopartiklar, 60 − 300 nm i storlek, naturligt frigörs genom snabb-och långsamt växande mykobakterier1. MEVS släpptes av patogena mykobakterier utgör en mekanism för att interagera med värden via immunologiskt aktiva proteiner, lipider, och glykolipider utsöndras i ett koncentrerat och skyddat sätt2,3,4. För att karakterisera MEVs och förstå deras biogenes och funktioner är strikta och effektiva metoder för vesikelrening och validering avgörande. Hittills har MEVS isolerats från kulturfiltrat av mykobakterier som odlas i ett järnrikt medium1,5,6,7,8.
Men tidigare arbete visat att järn begränsning kraftigt stimulerar vesikler release i MTB, möjligen för att fånga järn via mycobactin, en siderophore utsöndras i MEVs9. Även om förfaranden för MEVs isolering från MTB odlade i hög järn medium har beskrivits, en effektiv metod för att få MEVs från låga järn kulturer har inte rapporterats. Därför är målet med denna metod att isolera, rena och kvantifiera MEVs erhålls från låga järn kulturer så att de kan användas för biokemiska och funktionella analyser och för analys av genetiska bestämningsfaktorer för vesikelproduktion i mykobakterier.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. beredning av Järnutarmat definierat medium
- Bered 1 L minimalt medium (MM) genom att upplösa 5 g KH2Po4,5g L-asparagin, 20 ml glycerol och 2 g dextros i 900 ml avjoniserat vatten i en plastbehållare. Undvik glas för att förhindra järn förorening. Justera pH till 6,8 med 5 N NaOH och volymen till 1 L med vatten.
- Tillsätt 50 g metall kelaterande harts (MCR) och försiktigt agitera med hjälp av en magnetisk rör bar för 24 h vid 4 ° c. Sterilisera och ta bort MCR genom filtrering genom en 0,22 μm filterenhet med en plastmottagare. För att påskynda filtrering och förhindra filter igensättning, låt hartssediment för ca 30 min före filtrering.
Anmärkning: Detta medium innehåller mindre än 2 μM restjärn, vilket bestäms av atomabsorptionsspektroskopi. - Tillägg MM med 0,5 mg/L av ZnCl2, 40 mg/l av MgSO4, och 0,1 mg/l av mnso4. Separat, förbereda koncentrerade bestånd (1000X) av varje metall tillskott i avjoniserat vatten och sterilisera genom filtrering före MM tillskott. Järn-utarmat, metall kompletterad MM kommer att hänvisas här som låg järn MM (LIMM).
- Från ett 50 mM lager av FeCl3 upplöst i 10 mm HCl, tillsätt 1 ml till 1 L limm (50 μm slutlig koncentration) för att förbereda hög järn mm (Himm).
2. växande mykobakterier i järn-begränsade förhållanden
- Tina ut 50 μL av en fryst 15% glycerol lager av MTB och strimma en agar plattan kompletteras med 10% ADN anrikning (5 g/L albumin, 2 g/L dextros, och 0,85 g/L natriumklorid, 0,2% glycerol och 0,05% Tween-80)10. Inkubera plattan vid 37 ° c tills kolonier är synliga.
- Inokulera en enda koloni av MTB10 i 2 ml av mycobakteriell buljong medium (tabell över material) kompletterat med ADN berikning. Inkubera med agitation vid 37 ° c.
- Låt MTB-kulturen växa till den sena logaritmiska fasen (OD540 är ~ 0,8). För att kontrollera detta, Mät OD540 med hjälp av en spektrofotometer.
- Sprid 200 μL av den sena logaritmiska kulturen på mycobakteriell agar-plattorna (tabell över material) kompletterat med 0,2% glycerol, 0,05% Tween-80 och ADN. Inokulera minst 5 plattor. Inkubera plattorna vid 37 ° c tills bakterietillväxt är synlig som ett konflytande skikt. Detta tar ~ 1 vecka för MTB.
- Blöt en steril bomullspinne i LIMM. Använd denna Svabb för att samla in bakterier från agarplattorna och Inokulera 100 mL LIMM för att bereda en koncentrerad bakteriesuspension med en OD540 på ~ 1,0.
- Späd denna suspension 10 gånger till 1 L med LIMM och dela upp den i två, 2 L sterila plastflaskor, var och en som innehåller 500 mL kultur.
- Ta ut 2 mL kultur och överför den till ett 5 mL odlings rör. Tillsätt 10 μL 10% Vol/Vol tyloxapol.
- Inkubera kulturerna vid 37 ° c stående i 14 dagar.
3. insamling av MEVs
- Mät OD540 för 2 ml-kulturen vid insamlingstillfället. Gör 1:10 seriella utspädningar av kulturen och plattan 100 μL av varje spädning på agar plattor med ADN och 0,05% Tween-80.
- Överför kulturen till 5 225 mL koniska centrifugrör och centrifugera vid 2 850 x g i 7 min vid 20 ° c.
- Samla kulturen supernatanten med en 50 mL pipett och filtrera sterilisera den genom en 0,22 μm filterenhet.
4. isolering av MEVs
- Överför kultur filtratet till en omrörd cell ultrafiltrerings system placerat vid 4 ° c och filtrera koncentratet på < 50 psi genom en 100 kDa cutoff membran till ~ 50 mL.
- Centrifugera det koncentrerade odlings filtratet vid 15 000 x g i 15 min vid 4 ° c och samla upp supernatanten.
- Centrifugera odlings filtratet i ultracentrifugering i polykarbonatrör vid 100 000 x g i 2 timmar vid 4 ° c.
- Omsuspendera membranös pellets i totalt 1 mL steril fosfatbuffrad saltlösning (PBS) genom skonsam pipettering.
- Blanda 0,5 ml av den pelletsuspension som erhållits i steg 4,4 med 1,5 ml av 60% iodixanol lösning, vilket ger en slutlig iodixanol koncentration på 45% WT/Vol. fördela denna blandning i botten av en 13 mm x 51 mm polypropylen tunnväggiga första tub.
- Överlagra MEV-iodixanol 45% suspension med 1 mL 40%, 35%, 30%, 25% och 20% (Vol/Vol i PBS) iodixanol lösningar och 1 mL PBS högst upp.
- Centrifugera vid 100 000 x g i 18 h vid 4 ° c.
- Samla 1 mL densitet gradienten fraktioner med början från toppen med en 1 mL Hamilton spruta.
- Späd varje insamlad fraktion till 20 mL med PBS och centrifugera vid 100 000 x g i 2 timmar vid 4 ° c.
- Avlägsna supernatanten och suspendera pelleten i 0,5 mL PBS. Förvara denna pellet vid 4 ° c.
5. kvantifiering av MEVs
- Mät protein koncentrationen i varje fraktion med en Bradford-analys (tabell över material), enligt tillverkarens riktlinjer.
-
Utför membran lipid analys.
- Inkubera 10 μL av varje gradientfraktion med den fluorescerande membran sonden 1-(4-Trimethylammoniumphenyl) -6-fenyl-1, 3,5-Hexatriene p-toluenesulfonat (TMA-DPH) vid en slutlig koncentration på 1 μg/ml i en slutlig 50 μl volym PBS i 96 väl svart Plattor.
- Inkubera plattorna vid 33 ° c i 20 min.
- Mät fluorescensen vid 360 nm excitation och 430 nm emission.
6. kvalitativ analys av MEVs
-
Utföra proteinelektrofores.
- Blanda cirka 1 μg MEV-prov i 16 μL med 4 μL 5x provlastningsbuffert (10% w/v SDS, 10 mM Ditiotreitol, 20% v/v glycerol 0,2 M Tris-HCl, pH 6,8 0,05% w/v bromfenolblått) och värm proverna i provbuffert vid 85 ° c i 5 min.
- Fyll på med 10% Tris/Glycine SDS-polyakrylamid-gel11 och kör vid 10 V/cm i löpbuffert (25 mm Tris bas, 190 mm glycin, 0,1% SDS) tills den blå färgen framsidan når botten av gelen.
- Fläcken gelen med en ultraljud protein färgning lösning (tabell över material).
-
Utför dot blot.
- Fyll på 2 μL av en MEVs-suspension med en koncentration på cirka 0,5 μg/μL och dubbla seriella utspädningar på ett nitrocellulosamembran och en process för en punktblot enligt tillverkarens anvisningar.
- Använd ett antiserum som föds upp på möss mot en beredning av MEVs vid en spädning av 1:5000 som primär antikropp och en get-antimus kopplad till pepparrots peroxidas (HRP) vid en 1:10000 spädning som sekundär antikropp. Detektera antigen-antikroppskomplex med ett lämpligt HRP-substrat blotting Detection reagens och ett avbildningssystem.
-
Utför negativ färgning och elektronmikroskopi.
- Fix 250 μL MEVs med 2% glutaraldehyd i 0,1 M cacodylate vid rumstemperatur i 2 h och inkubera över natten i 4% formaldehyd, 1% glutaraldehyd och 0,1% PBS.
- Färga de fasta proverna med 2% osmium tetroxid för 90 min.
- Seriellt torka provet i etanol och bädda i Spurr s epoxiharts.
- Observera MEVs under ett transmissionselektronmikroskop.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
MEVs renas genom differential sedimentering i en densitetsgradient (figur 1, figur 2). Enligt de beskrivna villkoren separeras MEVs mestadels i gradientfraktion 3 (F3), vilket motsvarar 25% iodixanol. Denna slutsats är baserad på detektion av protein, membran lipid, mikroskopisk visualisering av intakt MEVs, nanopartikel storleksfördelning, och positiv reaktivitet med ett antivesicle antiserum (figur 2, figur 3). Protein och lipid koncentration normaliserade till kolonibildande enheter (CFUs) visade en cirka åttafaldig ökning av MEV avkastning i låg järn i förhållande till höga järn förhållanden (50 μM FeCl3) (figur 3). Även om resultaten av ett representativt experiment presenteras, är detta ett mycket reproducerbart resultat baserat på flera (> 10) isoleringar av MEVs. Den rena MEV-avkastningen från en 1 L låg järn odling med denna metod var cirka 500 μg protein.
Figur 1: schematisk representation av den metod som används för rening och kvantifiering av MEV. Mykobakterier som odlas i agar plattor användes för att Inokulera järn-utarmat minimal medium och växa MTB för EV isolering. MEVs renas genom en diskontinuerlig densitetsgradient från det cell fria kulturfiltratet. En kombination av membran lipid-och vesikelproteinbestämning, mikroskopi och nanopartikelanalys genomfördes för att karakterisera renade MEVs. Vänligen klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 2: karakterisering av renad MEVs. (A) visas är fotografier av en faktisk densitet gradient separation av rå MEVS och pelleten av renad MEVS samlats in av ultracentrifugering av gradient fraktion 3 (F3). B) SDS-gel färgade som visar protein profilen för de olika densitetsgradienten fraktioner. Canalys av prickblot som visar vesikelassocierade proteiner koncentrerade till F3. D) MEVS som förekommer i F3, observerad av negativ färgning. E) MeV-storleksfördelning enligt nanopartikelanalys (NTA). Vänligen klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 3: jämförande analys av MEV-avkastning i låga och höga järn kulturer. Ett representativt resultat av (a) beräkning av protein och lipid och (B) dot blot-analys av renad MEVS isolerad från järnbegränsad och järn tillräcklig MTB kulturer. Vänligen klicka här för att se en större version av denna siffra.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Flera metoder för att rena eukaryota cell-härledda exosomer har utvecklats12. Däremot finns det begränsad information om effektiva metoder för att rena bakterier som härrör EVs7. Effektiv isolering av MTB-derived EVs måste beakta de inneboende svårigheterna att odla denna patogena Mycobacterium. MTB har en lång Division tid (~ 24 h) och bör hanteras i biosäkerhet nivå tre (BSL-3) villkor. Därför är det viktigt att optimera effektiviteten hos MEV-isoleringsmetoder. Eftersom mykobakterier release glykolipider och andra hydrofoba molekyler som aggregera och lätt förorena rå MeV preparat i mediet, är det viktigt att rena och validera MEVS innan du utför biokemiska och funktionella studier. Baserat på tidigare observationer som visade att MTB förbättrar frisättningen av MEVs under förhållanden av järn begränsning, ett protokoll inrättades för EV rening från järnbegränsade mykobakterier. Det har också bekräftats att icke-virulent M. smegmatis också ökar frisättning av EVS som svar på låga järn förhållanden (data som inte visas). Därför skulle samma protokoll kunna användas för att rena EVs från denna bakterie i BSL-2 villkor.
Ett kritiskt steg i detta förfarande är förberedelserna av det låga järn mediet. Detta medium bör förberedas enligt beskrivningen här och lagras i en plastbehållare, inte i glas, för att förhindra järn förorening. Kosttillskott som vanligen används i MTB odlingssubstrat för att stimulera bakterietillväxt och förhindra karakteristiska mycobakteriell clumping, såsom bovint serum albumin, Tween-80, eller tyloxapol, måste undvikas. Dessa tillsatser leder till lipoprotein komplexa artefakter som copurify med blåsor och minska vesikler avkastning. Vid CFU-bestämning kan en liten kultur i medelstort kompletterat med rengöringsmedel (Tween-80 eller tyloxapol) ställas in parallellt med den tvättmedels fria stora kulturen. MEVs i kulturfiltratet är stabilt vid 4 ° c i flera dagar. Därför, om det inte behandlas omedelbart, kan kulturen filtratet förvaras kylda.
Den totala avkastningen av renad MEV från 1 L kultur var cirka 500 μg/L protein, vilket är tillräckligt för att genomföra flera analyser såsom proteomik, lipidomik, och funktionella analyser. Beroende på vilken typ av analys, tillräckligt MEVs kan isoleras från mindre volymer (dvs., 250 mL). Detta underlättar jämförande analys av villkor och faktorer som påverkar MEV release.
Detta är en effektiv metod för att rena MEVs, men det har begränsningar. Det är en lång procedur med flera ultracentrifugering steg. I framtiden kommer denna metod att jämföras med gelfiltrering kromatografi, och som molekylära markörer för MEVs upptäcks, kan tillhörighet fångstmetoder genomföras. Värdmiljön är järnbegränsad, därför MEVs produceras av MTB i ett lågt järn medium är förmodligen närmare släkt med MEVs produceras under infektion och kan ge relevanta insikter om rollen av MEVs i tuberkulos patogenes.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Författarna har inga intressekonflikter.
Acknowledgments
Vi är tacksamma för att Rafael Prados-Rosales för att dela anti-MeV antiserum och Navneet dogra för att utföra nanopartiklar spårningsanalys.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Amicon stirred cell Model 108 | EMD Milipore | UFSC40001 | Cell Ultrafiltration system |
| BD Polypropilene 225 mL conical tubes | Fisher | 05-538-61 | Conical centrifuge tubes |
| Biomax 100 kDa cut-off ultrafiltration membrane | EMD Milipore | PBHK07610 | Ultrafiltration membrane |
| Chelex-100 resin | Bio-Rad | 142-2842 | Metal chelating resin |
| Middlebrook 7H10 Agar | BD Difco | 262710 | Mycobacterial Agar plates |
| Middlebrook 7H9 Broth | BD Difco | 271310 | Mycobacterial broth medium |
| Nitro cellulose blotting membrane | GE Healthcare | 10600001 | Blotting Membrane |
| Optiprep | Sigma | D1556 | Iodixanol |
| Polycarbonate ultra centrifugation tubes 25 mm x 89 mm | Beckman Coulter | 355618 | Polycarbonate ultra centrifugation tubes 25 mm x 89 mm |
| Polypropylene thin walled centrifuge tube 13 mm x 15 mm | Beckman Coulter | 344059 | Polypropylene thin walled centrifuge tube 13 mm x 15 mm |
| Protein Assay dye | BioRad | 5000006 | Bradford Protein Staining |
| SYPRO Ruby | Molecular Probes | S12000 | Ultrasensitive protein stain |
| TMA-DPH | Molecular Probes | T204 | 1-(4-Trimethylammoniumphenyl)-6-Phenyl-1,3,5-Hexatriene p-Toluenesulfonate |
| Vacuum filtration flasks | CellPro | V50022 | Filter Unit |
References
- Prados-Rosales, R., et al. Mycobacteria release active membrane vesicles that modulate immune responses in a TLR2-dependent manner in mice. Journal of Clinical Investigation. 121, 1471-1483 (2011).
- Gupta, S., Rodriguez, G. M. Mycobacterial extracellular vesicles and host pathogen interactions. Pathogens and Disease. 76 (4), (2018).
- Athman, J. J., et al. Bacterial Membrane Vesicles Mediate the Release of Mycobacterium tuberculosis Lipoglycans and Lipoproteins from Infected Macrophages. Journal of Immunology. 195, 1044-1053 (2015).
- Athman, J. J., et al. Mycobacterium tuberculosis Membrane Vesicles Inhibit T Cell Activation. Journal of Immunology. 198, 2028-2037 (2017).
- Rath, P., et al. Genetic regulation of vesiculogenesis and immunomodulation in Mycobacterium tuberculosis. Proceedings of the National Academy of Science U.S.A. 110, E4790-E4797 (2013).
- White, D. W., Elliott, S. R., Odean, E., Bemis, L. T., Tischler, A. D. Mycobacterium tuberculosis Pst/SenX3-RegX3 Regulates Membrane Vesicle Production Independently of ESX-5 Activity. mBio. 9, pii 00778 (2018).
- Dauros Singorenko, P., et al. Isolation of membrane vesicles from prokaryotes: a technical and biological comparison reveals heterogeneity. Journal of Extracellular Vesicles. 6, 1324731 (2017).
- Prados-Rosales, R., Brown, L., Casadevall, A., Montalvo-Quiros, S., Luque-Garcia, J. L. Isolation and identification of membrane vesicle-associated proteins in Gram-positive bacteria and mycobacteria. MethodsX. 1, 124-129 (2014).
- Prados-Rosales, R., et al. Role for Mycobacterium tuberculosis membrane vesicles in iron acquistion. Journal of Bacteriology. 196, 1250-1256 (2014).
- Sanders, E. Aseptic Laboratory Techniques: Plating Methods. Journal of Visualized Experiments. 63, e3064 (2012).
- Harlow, E., Lane, L. Antibodies. A laboratory manual. , Cold Spring Harbor Laboratory. (1988).
- Lotvall, J., et al. Minimal experimental requirements for definition of extracellular vesicles and their functions: a position statement from the International Society for Extracellular Vesicles. Journal of Extracellular Vesicles. 3, 26913 (2014).
