Et semi-High-gennemløb Imaging metode og data visualisering Toolkit til at analysere C. elegans embryonale udvikling

Summary

Dette arbejde beskriver en semi-High-gennemløb protokol, der tillader samtidige 3D time-lapse Imaging af embryogenese i 80 – 100 C. elegans embryoner i en enkelt overnight kørsel. Derudover er billedbehandling og visualiseringsværktøjer inkluderet for at strømline dataanalyse. Kombinationen af disse metoder med brugerdefinerede reporter stammer muliggør detaljeret monitorering af embryogenese.

Abstract

C. elegans er det førende system til systematisk analyse af celle skæbne specifikation og morfogenetiske hændelser under fosterudvikling. En udfordring er, at embryogenese dynamisk udfolder sig over en periode på omkring 13 h; denne halve dag lange tidshorisont har begrænset omfanget af eksperimenter ved at begrænse antallet af embryoner, der kan imaged. Her beskriver vi en protokol med halv højt gennemløb, der muliggør samtidig 3D-tidsforskudt billeddannelse af udvikling i 80 – 100 embryoner ved moderat tidsopløsning, fra op til 14 forskellige forhold, i en enkelt overnight kørsel. Protokollen er ligetil og kan gennemføres af ethvert laboratorium med adgang til et mikroskop med punkt besøgs kapacitet. Nytten af denne protokol er demonstreret ved at bruge den til at billedet to specialbyggede stammer udtrykker fluorescerende markører optimeret til at visualisere centrale aspekter af kimlag specifikation og morphogenesis. For at analysere data, et brugerdefineret program, der beskærer individuelle embryoner ud af et bredere synsfelt i alle kanaler, z-trin og tidspunkter og gemmer sekvenser for hvert embryo i en separat TIFF stak blev bygget. Programmet, som omfatter en brugervenlig grafisk brugergrænseflade (GUI), strømliner databehandling ved isolering, forbehandling, og ensartet orientere individuelle embryoner som forberedelse til visualisering eller automatiseret analyse. Leveres også er en ImageJ makro, der samler individuelle embryo data i en multi-panel fil, der viser maksimal intensitet fluorescens projektion og lysfelt billeder for hvert embryo på hvert tidspunkt. De protokoller og værktøjer, der er beskrevet heri, blev valideret ved at bruge dem til at karakterisere embryonale udvikling efter knock-down af 40 tidligere beskrevne udviklingsmæssige gener; denne analyse visualiserede tidligere annoterede udviklingsmæssige fænotyper og afslørede nye. Sammenfattende, dette arbejde detaljer en semi-High-gennemløb Imaging metode kombineret med en beskæring program og ImageJ visualisering værktøj, der, når det kombineres med stammer udtrykker informative fluorescerende markører, i høj grad accelererer eksperimenter til at analysere embryonale udvikling.

Introduction

C. elegans embryo er et vigtigt model system for mekanistisk cellebiologi og analyse af celle skæbne specifikation og morfogenetiske hændelser kørsel embryonale udvikling^{1,2,3,4 ,5,6,7,8,9}. Til dato, meget af karakteriseringen af både cellulære-niveau begivenheder og celle skæbne specifikation i embryonet er opnået ved hjælp af relativt høj tidsmæssig opløsning en-til-en-tid billeddannelse eksperimenter (dvs. erhvervelse hver 10 – 100 s) af embryoner, der udtrykker fluorescerende markører. Selv om det er velegnet til begivenheder på rækkefølgen af sekunder til snesevis af minutter, denne fremgangsmåde bliver teknisk begrænsende for karakterisering af længere processer, på rækkefølgen af timer til dage. Embryonale udvikling fra første spaltning til slutningen af forlængelse tager omkring 10 h. På denne tid-skala, semi-High-gennemløb metoder, der ville give mulighed for samtidige lavere tidsopløsning billeddannelse (dvs. erhvervelse på 5 – 20 minutters tidsintervaller) af større kohorter af embryoner, fra forskellige betingelser, ville åbne op for en ny række eksperimenter; f. eks. muliggøre systematiske, omfattende Screenings bestræbelser og analyse af et tilstrækkeligt antal embryoner til sammenligning af følgerne af molekylære forstyrrelser.

Her beskriver vi en semi-High-gennemløb metode til overvågning C. elegans embryo Genesis, der muliggør samtidig 3D time-lapse billeddannelse af udvikling i 80 – 100 embryoner, fra op til 14 forskellige betingelser, i en enkelt overnight køre. Protokollen er ligetil at gennemføre og kan udføres af ethvert laboratorium med adgang til et mikroskop med punkt besøgs muligheder. De vigtigste trin i denne protokol er skitseret i figur 1. Kort sagt dissekeret embryoner fra gravid voksne, der udtrykker fluorescerende markører af interesse og overfører unge embryoner (2 – 8 celle trin) til brønde af en 384-brønd plade til billeddannelse. I dette format tragter den relativt lille brønd størrelse embryoner ind i et snævert område, hvilket letter identifikationen af felter, der indeholder flere embryoner til tidsforskudt billeddannelse. For at opretholde nogenlunde synkrone udvikling på tværs af kohorten af embryoner udføres dissektioner i kølede medier, og pladen holdes på is, hvilket forhindrer en betydelig udvikling i det time lange dissektions tidsvindue. Pladen overføres til mikroskopet, og embryonerne optages i et temperaturkontrolleret rum om natten, med 20 minutters tidsintervaller, ved hjælp af en 60x olie fordybning 1,35 NA linse, for at indsamle hele z-området i 2 μm trin. 50 felter, der hver indeholder mellem 1 – 5 embryoner, er inddelt i en enkelt overnight kørsel. Afhængigt af det ønskede eksperiment kan tids opløsningen forøges (f. eks. med 5 – 10 minutters intervaller) ved proportionalt at formindske antallet af felter med afbildet.

Med denne protokol genererer selv en enkelt overnight kørsel en betydelig mængde data (80 – 100 embryoner spredt ud over 50 felter), og større eksperimenter kan hurtigt blive uoverskuelige med hensyn til dataanalyse. For at lette behandling, visualisering og strømlinet analyse af disse data blev et program bygget til at beskære og orientere embryoner og udføre forbehandlings trin (valgfrit) og en ImageJ makro, der samler dataene for at forenkle visningen. Disse programmer kan bruges til at behandle billeder indsamlet ved hjælp af konventionelle tilgange, da de er uafhængige af billedbehandlings metoden, der kun kræver et enkelt lysfelt-fly. Det første program tager i et 4d felt, der indeholder flere embryoner (GUI option eller kildekode embryoCrop.py) eller flere 4d felter, der indeholder flere embryoner (screenCrop.py), stramt afgrøder embryoner og orienterer dem i en anterior-posterior konfiguration. Disse programmer giver også brugerne mulighed for at udføre baggrunds subtraktion, drift korrektion og dæmpning korrektion. De resulterende filer er ensartet forbehandlet, stramt beskåret TIFF stakke for hvert embryo, der kan ændres til automatiseret billedanalyse. For at gøre det enklere at se alle embryoner for hver betingelse, en ImageJ makro (OpenandCombine_embsV2. IJM) blev skrevet, som samler alle embryoner fra en given betingelse i en enkelt TIFF stack og arrays lysfelt billeder og maksimal intensitet projektion farve ( RGB) overlejringer, side om side, for hvert embryo. Metoderne blev valideret ved at bruge dem til at karakterisere embryonale udvikling efter knock-down af 40 tidligere beskrevne udviklingsmæssige gener i et par specialbyggede stammer, der udtrykker fluorescerende markører optimeret til at visualisere centrale aspekter af kimlag specifikation og morfogenesis^10,11. Sammen, den semi-høj gennemløb embryo Imaging protokol og billedbehandling værktøjer vil muliggøre højere prøve antal eksperimenter og storstilet screening indsats med henblik på at forstå udviklingsmæssige processer. Desuden vil disse stammer også give et effektivt middel til at undersøge virkningerne af molekylære forstyrrelser på embryogenese.

Protocol

1. klargøring af C. elegans -embryoner til billedbehandling med halv højt gennemløb

Bemærk: Målet med denne del af protokollen er at indlæse en population af semi-synkroniseret (2 til 8-celle fase) C. elegans embryoner, dissekeret fra egnede markør stammer (figur 2), i en glas-bund 384-brønd plade til billeddannelse. Andre plade formater kan også fungere, men 384 brønd pladerne foretrækkes, fordi den lille brønd størrelse begrænser spredningen af embryoner til et relativt lille område, hvilket letter identifikationen af felter, der indeholder flere embryoner til tidsforskudt billeddannelse. Groft synkronisering af embryonerne sikrer, at hele forløbet af udviklingen er fanget for hver af embryonerne i et felt.

1. Forbered 5 – 10 mL 0,1 mg/mL opløsning af tetramisole hydrochlorid (TMHC) bedøvelsesmiddel opløst i iskold M9 medium (0,45 M na₂HPO₄∙ 7h₂O, 0,11 m KH₂PO₄, 0,04 m NaCl, 0,09 m NH₄CL) at bruge under dissektion og billeddannelse. Dette medie omfatter en bedøvelse for at sikre, at bevægelige udklækkede larve ikke forstyrrer billeddannelse af embryoner i tidligere udviklingsstadier.
   Bemærk: Hvis du bruger beskærings-og visualiserings værktøjerne til at analysere data, som er anskaffet ved hjælp af standard monteringsmetoder for agrose pad, skal du springe videre til afsnit 3
2. Alikvot 70 μL af den tilberedte opløsning i individuelle brønde af en glasbund 384-brønd plade med en brønd for hver betingelse; undgå de yderste to rækker af pladen for at forhindre kanteffekter.
   Bemærk: Det er nyttigt at maskere omgivende brønde ved hjælp af klæbende PCR plade folie (se eksempel i figur 1D) Dette bevarer tilstødende brønde til fremtidige eksperimenter og gør det lettere at finde passende brønde under dissektion mikroskop. Når opløsningen er aliciteret, skal du holde pladen og den resterende opløsning på isen i hele dissektion.
3. Generer mund pipetter til overførsel af embryoner fra depression slide (hvor gravid er er dissekeret) til brøndene. Træk kapillar pipetter (25 μL kalibrerede pipetter) over en flamme og bryd for at generere en fin tilspidset ende (figur 1D). Et pipet er nødvendigt pr. betingelse for at forhindre krydskontaminering; Kassér pipet efter brug.
4. Brug fine pincetter til at overføre ~ 10 gravid voksne under en dissektion-anvendelsesområde til 150 μl af iskold tmhc-opløsningen, der er aliciteret på en depression slide for hver betingelse. Ved hjælp af pincet og en skalpel, dissekere orme til at frigive embryonerne.
5. Ilæg et trukket kapillar-pipet ind i aspiratortilbehøret, der følger med pipetterne, og mund pipet til at overføre alle de 2 til 8-celleembryoer til en individuel brønd af den forberedte plade (figur 1D). Undgå at overføre sene stadier embryoner og dissektion snavs. Undersøg under et dissektions område, og hvis der er granulater af embryoner til stede, skal mund pipet op og ned eller tappe på klumper af embryoner med pipet spids for at sprede.
   Bemærk: For at forhindre krydskontaminering skal du rengøre dissektions udstyr og bruge et frisk mund pipet, mens du bevæger dig mellem forholdene. Opbevar pladen på is mellem dissektioner.
6. Når orme fra alle tilstande er blevet dissekeret og embryoner placeret i deres rette brønd, drej 384-brønd pladen i 1 min ved 600 x g for at udligne embryonerne.
7. Aftør bunden af pladen med en ethanol-gennemblødt serviet for at fjerne rester og Anbring pladen på et Konfokal mikroskop, der er udstyret med en plade holder i et temperaturkontrolleret miljø.
   Bemærk: De trin, der følger detaljer denne metode ved hjælp af Lab Setup; Rediger anskaffelses betingelserne, så de passer til eksperimentelle behov og udstyr. Her er en confokal scanner boks udstyret med en mikrolinse-forstærket Dual Nipkow spinning disk, et 512 x 512 EM-CCD kamera, en høj præcision Auto-XY-Stage (udpeget opløsning 0,1 μm) og motoriseret z-akse kontrol (udpeget opløsning 0,1 μm) anvendes. Dette system holdes i en 16 ° c rum, som bevarer mikroskopet temperatur mellem 21 og 23 °C under overnight Imaging.
8. For at identificere felter med egnede embryoner, udføre en præ-scanning af hver brønd ved hjælp af en 10x 0,4 NA objektiv og passende imaging software. De mest optimale felter vil indeholde mere end én tidlig fase embryo, der er i samme brændplan som andre embryoner og ideelt set vil have minimal kontakt mellem tilstødende embryoner. Markere positioner i egnede regioner.
9. Hvis du vil vælge billedbehandlings felter, skal du skifte til 60x-målsætningen og justere brændplanet ved hvert punkt besøg på passende afsnit embryonerne. 1 – 4 felter pr brønd er imaged, for i alt 50 felter på tværs af 14 brønde, og hvert felt kan indeholde mellem en og fem embryoner. Samlet set udvælges 4 til 15 embryoner fra hver betingelse for billeddannelse i høj opløsning.
   Bemærk: En nøgle variabel på dette trin er brugen af tilstrækkelig olie; Placer olie på målet, besøger punkter i hver brønd for at sprede olien omkring overfladen af alle brønde og derefter anvende en ekstra dråbe olie til målet forud for udvælgelse af marker.
10. Billede de valgte felter ved hjælp af en 60x 1,35 NA mål at erhverve 18 z sektioner med 2 μm intervaller hver 20 min for 10 h. De Imaging betingelser ved hjælp af kimlag og morfogenese reporter stammer er som følger: brightfield, 90% magt, 25 MS, 20% gevinst; 488 nm, 100% effekt, 200 MS, 60% gevinst; 568 nm, 45% effekt, 150 MS, 60% gevinst.
11. Efter Imaging er færdig, vurdere embryonale dødelighed ved at udføre en lav forstørrelse (10x 0,4 na mål) hele godt lysfelt scanning ~ 20 – 24 h efter starten af overnight Imaging.

2. fosterdødelighed scoring

1. Ved hjælp af post-Run 10x scannede felter, vurdere embryonale dødelighed og larve defekter ved at tælle udklækkede orme og uklækket embryoner for hver brønd.
2. Score udklækkede embryoner som embryonale dødelige. Udelukke arresterede en-til fire-celle-fase embryoner fra dødelighed, da unge dissekeret embryoner undertiden undlader at fuldføre ægge dannelse (hvis meiose II er endnu ikke komplet) og permeabilitet defekter kan føre til osmotiske komplikationer i de første to Divisioner.
3. Partielt udklækkede eller fuldt udklækkede orme med krops morfologi eller adfærdsmæssige defekter, såsom dumpy eller paralyseret, som "unormal larve".

3. automatiseret beskæring (figur 3A)

Bemærk: Softwaren er anbragt to steder: (1) Zenodo huser en brugervenlig version af softwaren¹² , der ikke kræver nogen programmerings ekspertise. (2) GitHub indeholder kildekoden til vores embryoCropUI.py og screenCrop.py software¹³, som kræver færdigheder med Python. Detaljerede instruktioner til download og drift af begge versioner af programmet kan findes nedenfor.

1. Automatiseret beskæring ved hjælp af embryo Ocropui eksekverbar version (brugervenlig version)
   1. For at bruge embryoCropUI programmet, skal du først downloade programmet fra Zenodo (https://zenodo.org/record/3235681#.XPAnn4hKg2w)¹².
      1. Download MacOS-eller Windows-format versionen af programmet (Bemærk, at MacOS-versionen kræver MacOS X 10.11 eller nyere).
      2. Download instruktionsfil (GUI_Instructions_zenodo_repoV2. docx), som giver trin for trin instruktion til afprøvning og brug af embryo Ocropui programmet.
      3. Hent test_files. zip for at teste, om programmet fungerer korrekt på platformen (Se vejledning).
   2. Når du har hentet, unzip og navigere for at finde den Embryokropui eksekverbare (... \Embryocropui\_windows\embryo Ocropui\embryocropui.exe) eller (... \embryo Ocropui\_macos\embryo ocropui\embryocropui.exe). Dobbeltklik for at starte (eller vælg ' Åbn med ' Terminal) og køre den Embryokropui eksekverbare.
   3. Den GUI eksekverbare afgrøder en 4D synsfelt ad gangen. I øverste venstre hjørne skal du vælge knappen Åbn for at indlæse det specifikke felt til beskæring (multi-TIFF). Hvis beskæring af en TIFF-serie med flere dimensioner (dvs. z, tid, kanal), indlæses kun det første billede i serien i mappen (en TIFF-serie pr. mappe).
   4. Når billederne er indlæst, skal du angive følgende oplysninger: antal z-skiver, (z), antal tidspunkter (T), antal kanaler (C), den kanal, der svarer til dic eller lysfelt (første = 1, sekund = 2 osv.).
   5. Vælg yderligere behandling for at køre på billederne. Programmet tilbyder afdrift korrektion, baggrund subtraktion, og dæmpning korrektion.
   6. Angiv parametre for baggrunds subtraktion og dæmpnings korrektion for at styre behandlingsindsatsen i GUI-prompten. For baggrunds træk skal du definere den største funktions størrelse for at afspejle størrelsen af et meningsfuldt signal. denne funktions størrelse bør ikke betragtes som baggrund og skal være en ulige talværdi. Indtast en værdi fra 0-1 for dæmpnings korrektion. Værdien for dæmpnings korrektion afspejler den procentdel af den oprindelige intensitet, der forbliver i den fjerneste dybde af det objekt, der imældes.
      Bemærk: Baggrunds subtraktion og dæmpnings korrektion skal køres sammen.
   7. Angiv billed indsamlings rækkefølgen (f. eks. kanal-z-tid (CZT) eller z-kanal-tid (ZCT)).
   8. Angiv mikron pr. pixel for de billeder, der er baseret på det anvendte kamera.
      Bemærk: Dårlig billedbeskæring vil opstå, hvis pixelstørrelsen ikke er korrekt defineret.
   9. Vælg Kør i nederste venstre hjørne. En ny undermappe mærket "Crop" vil blive oprettet i samme sti som den ubeskåret mappe; beskårne versioner vil blive gemt på denne placering. Afhængigt af filstørrelsen skal beskæringen fuldføres inden for sekunder til minutter.
2. Automatiseret beskæring ved hjælp af screenCrop.py (batch version alternativ til embryoCrop GUI beskrevet ovenfor;Kun Python savvy-brugere)^10,13
   1. Hvis du vil bruge screenCrop.py, Python-softwareversionen til beskæring af større datasæt i et batch format, skal du klone eller downloade kildekoden fra GitHub (GitHub.com/renatkh/embryo_crop.git).
   2. Læs instruktionerne til konfiguration af et korrekt virtuelt miljø, og følg det beskrevne filnavngivnings system. begge er detaljeret i Readme -filen i GitHub repository: https://github.com/renatkh/embryo_crop/blob/Master/README.MD.
   3. Når miljøvariabler og navngivning konventioner er blevet korrekt etableret, åbne Parameters.py og screenCrop.py i en redaktør af valg.
   4. Hvis du vil ændre justerbare parametre uden at berøre kildekoden, skal du redigere Parameters.py -filen.
      Bemærk: det er også muligt at ændre parametrene direkte i headeren på screenCrop.py.
      1. Hvis du bruger parameters.py-konfigurationsfilen, skal du ændre indstillingen use_configure til true. Hvis du bruger direkte redigering inden for screenCrop.py, skal du lade indstillingen use_configure være falsk.
      2. Find følgende oplysninger i parameters.py-filen, og foretag ændringer, så de passer til de ønskede billedbehandlings parametre og filstrukturen:
         1. loadFolder (linje 9): Skift til det drev, hvor filerne er gemt (f. eks. Z:/, D://osv.)
         2. dato (linje 7): Skift til den mappe, der indeholder filer til billedbehandlings sessionen. Dette kaldes "eksperiment mappenavn" i CSV-sporingsfilen (Se vejledning).
         3. trackingFile (linje 11): Skift til stien til den CSV-fil, hvor eksperiment oplysninger gemmes.
         4. z (linje 13): indstilles som antallet af z-fly.
         5. nT (line14): angives som antallet af tidspunkter.
         6. nWells (linje 19): indstilles som antallet af anvendte brønde.
         7. Pointbesøg (linje 20): Angiv som det maksimale antal point besøg (pr. brønd).
         8. I linje 10 finde den placering i øjeblikket besat af ' CV1000/' og indtaste den ydre mappe, der anvendes i filsti. For at undgå problemer skal du bruge følgende konvention: ' XXXXXXX/'.
         9. I linje 12 indtaster du en gyldig filsti til lagring af data om størrelsesforhold for beskårne data.
         10. I linje 15, 16, 17 og 18 input true/false for, om billederne går gennem følgende behandling:
             1. Input true eller false for drift korrektion på linje 15.
             2. Input true eller false for baggrunds træk på linje 16. Funktions størrelsen skal empirisk bestemmes for forskellige markør stammer og pixelstørrelser. I konfigurationen her, feature størrelse blev defineret som 41 for kimlag stamme og 201 for Morphogenesis stamme. Baggrunds træk skal udføres sammen med dæmpnings korrektion.
             3. Indgang true eller false for dæmpning korrektion på linje 17.
             4. Indgang true eller false for forreste posterior rotation på linje 18.
   5. Når alle ændringer er foretaget, kan beskæring begynde. For at gøre dette skal du skifte til screenCrop.py og vælge afspilningsikonet på værktøjslinjen, vælge Kør som > Python Runi rullemenuen.
   6. Da beskæring kan tage flere timer at fuldføre for et stort datasæt (50 punkt besøger 18 z trin, 3 kanaler, 31 tidspunkter), spore status for beskæring i konsolvinduet. Når beskæringen er fuldført, vil et lille vindue vise eksempler på de beskårne billeder, før de gemmes. For hvert billede er der 3 muligheder:
      1. Gem: Tryk på mellemrums tasten for at gemme billedet, hvis billedet er beskåret korrekt, uden at områder af interesse bliver afskåret.
      2. X: Tryk på X , hvis billedet ser ud til at have områder af interesse afskåret; billedet vil blive gemt med et X foran navnet for at adskille det fra de andre billeder.
      3. Slet: Tryk på D for at slette det beskårne billede, hvis billedet ikke er beskåret korrekt, eller hvis embryonet ikke er tilfredsstillende.
         Bemærk: billederne vil blive gemt i en undermappe med navnet "beskåret" i mappen Load (defineret i linje 9 i programmet).

4. visualisering (figur 4)

Bemærk: OpenandCombine_embsV2. IJM^10,12 er en ImageJ makro, der vil konstruere en let at se TIFF-fil fra alle billederne for en bestemt stamme og betingelse. Installation af Fiji/ImageJ^14,15 er påkrævet. Denne makro kører i henhold til vores filstruktur. Det skal ændres for at arbejde med andre filstrukturer. En guide til korrekt filstruktur og detaljeret beskrivelse af vigtige overvejelser kan findes i slutningen af GUI_Instructions_zenodo_repoV2. docx fil på zenodo repository. Læs venligst disse instruktioner helt før billeddannelse til korrekt navn og struktur filer til grænsefladen bedst med denne makro. For reference, vores fil placering struktur ser sådan ud:
Z:\cropped\Target\Strain\Emb # \Target_Emb # _15 cifret entydigt id _W # #F # _T # #_Z # #_C #. tif
dvs. Z:\cropped\EMBD0001\GLS\Emb1\EMBD0001_Emb1_20140327T135219_W02F1_T01_Z01_C1.tif

1. Hent OpenandCombine_embsV2 og GUI_Instructions_zenodo_repoV2. docx fra zenodo (https://zenodo.org/record/3235681#.XPAnn4hKg2w).
2. Forbered følgende oplysninger:
   -Den placering, hvor billed mapperne er gemt (efter beskæring).
   -Billed mappens navn (e) for den eller de specifikke betingelser, der skal behandles (dvs. EMBD0002). Dette kaldes "target" i eksemplet ovenfor
   -En 15-cifret Alpha-numerisk entydig identifikator, der er specifik for et givet overnight eksperiment-dette id er navnet på dataindsamlings mappen (dvs. 20140402T140154), og det entydige id er integreret i det enkelte TIFF-filnavn (EMBD0002_Emb1_ 20140402t140154_w06f2_t01_z01_c1) for hvert embryo, der er afbildet den dag. Makroen bruger dette id til at kontrollere, om embryoner er erhvervet på samme dato, og kan samle gentagne betingelser med separate datoer i separate ImageJ-filer.
3. Åbn ImageJ, og træk og slip makro filen, OpenandCombine_embsV2. IJM, til ImageJ-linjen, eller Åbn makroen direkte.
4. Når makroen er åben, finder du linje 3 og 4. Indtast de indsamlede oplysninger i (afsnit 4,2) i henhold til følgende trin:
   1. Indtast målnavnet for de billeder, der skal behandles, i linje 3 (RNAL). Indtast hvert mål i følgende struktur newArray ("XXXXXXXX/"); Medtag tilbud. Hvis du vil køre flere betingelser på én gang, skal du adskille dem med et komma og holde alle målnavne inden for parentesen (dvs. Newarray ("EMBD0000/", "EMBD0001/", "EMBD0002/").
   2. I linje 4 (dato) indtastes det 15-cifrede alfanumeriske entydige id i citater, for eksempel Newarray ("20140402t140154").
5. Tryk på Kør nederst til venstre i makrovinduet. Der vises et vindue, som vil starte en prompt for at navigere til den ydre mappe, der indeholder de beskårne billedmapper (angivet i 4.4.1).
6. Når først udsøgt, en anden rude vil ser ud, hvilke vil indrømme angivelse i billeddannelse parametre.
   1. Angiv antallet af kanaler, antallet af Z-udsnit, skriftstørrelsen for den tekst, der bruges i mærkningen af de kompilerede billeder, og farven for hver af kanalerne.
   2. Check on/off Auto kontrasterende i alle kanaler.
7. Når alle parametre er angivet, skal du klikke på OK nederst i vinduet. Den sammensatte fil vil begynde at samle; Dette vil tage flere minutter, pr. betingelse, at fuldføre.
8. Når du er færdig, gennemgå de filer, der efterlades åbne, hvis det ønskes. De kan lukkes uden at gemme, som makroen allerede har gemt filerne til en nyoprettede mappe, som er navngivet på følgende måde: ydre mappe Name (angivet i prompt af afsnit 4,5) + "-Fiji-forarbejdet-output" (dvs., Z:\ cropped-fiji-processed-output\EMBD0002_GLS_20140402T140154.tif).

Representative Results

En betydelig udfordring i at karakterisere virkningen af molekylære forstyrrelser på C. elegans embryonale udvikling er, at det tager omkring 10 h for embryoner til at gøre fremskridt fra første kavalergang til slutningen af forlængelse ved 20 °¹⁶. En metode med halv høj gennemløb, hvor store kohorter af embryoner kan afbildes samtidigt, er nyttig for begivenheder på denne tidsskala, fordi den muliggør billeddannelse af flere forhold parallelt med en tilstrækkelig ensemble størrelse for hver betingelse for at muliggøre kvantitativ analyse (figur 1A).

Billed metode med halv høj dataoverførselshastighed og multi markør stammer
Den semi-High-gennemløb Imaging metode, der er beskrevet her (beskrevet i figur 1B), beskæftiger en 384-brønd glasbund plade; multi-Well format giver mulighed for op til 14 betingelser, der skal klædt parallelt og den lille størrelse af brøndene begrænser søgeområdet, forenkle identifikationen af felter, der indeholder embryoner til høj opløsning billeddannelse. Her blev en confokal scanner boks brugt, udstyret med en mikrolinse-forstærket Dual Nipkow spinning disk, et 512 x 512 EM-CCD kamera, en høj præcision Auto-XY-Stage (udpeget opløsning 0,1 μm) og motoriseret z-akse kontrol (udpeget opløsning 0,1 μm). Men, protokollen kan tilpasses til enhver confokale mikroskop med præcision punkt-besøg kapaciteter og en etape adapter, der kan rumme en multi-brønd plade. En betydelig udfordring i udviklingen af denne metode var at udtænke et middel til at generere en plade af embryoner på samme udviklingsmæssige stadium, således at hele udviklingen kan blive fanget for alle embryonerne i hvert felt. Dette er en udfordring, fordi embryonerne, der er anbragt på billedpladen, først vil fortsætte med at udvikle sig, mens senere prøver dissekeres, hvilket resulterer i en gradient af iscenesættelse på tværs af brøndene. For at omgå dette problem, er tidligt stadie embryoner (2-8 celle fase) valgt og holde dissektion medier og billedplade på is; denne boder embryogenese for dissekeret embryoner, indtil alle betingelser er blevet klædt uden signifikant påvirker embryonale levedygtighed¹⁰. For at begrænse den tid, som embryonerne sidder på is til 1 time, udfører to forskere dissektionerne samtidigt, hvilket giver mulighed for opsætning af 14 forskellige forhold i ca. 50 min. Efter dissektion er pladen spundet ved 600 x g i 1 min til sediment embryonerne og brøndene er forscannet ved lav forstørrelse for at lokalisere felter med grupper af egnede embryoner til billeddannelse med høj forstørrelse; punkt besøg steder er markeret. Embryoner er filmet i et temperaturkontrolleret rum natten over ved hjælp af en 60x olie fordybelse 1,35 NA linse. Prøverne er konfigureret i en 4 godt ved 4 brønd region, således at arealet af pladen, der anvendes i et eksperiment er sammenlignelig med en 22 x 22 mm² standard Cover slip, som giver mulighed for brug af en 60x olie mål. Ensartet spredning af olie i hele denne region forud for påbegyndelsen af Imaging er afgørende for en vellykket langsigtet image erhvervelse. Embryonerne i udvikling er afbildet i en opløsning, der indeholder bedøvelsesmiddel; Dette sikrer, at når de ældre embryoner i brønden luge, deres bevægelse ikke forstyrrer placeringen af tilstødende yngre embryoner, der bliver imaged. På grund af den uigennemtrængelige natur af æggeskallen, anæstetika påvirker ikke bevægelse forud for klækning. Under disse betingelser indsamles der 3D-tidsforskudt data i 3-kanaler for i alt 80-100 embryoner i et enkelt overnight eksperiment (diskuteret mere nedenfor).

C. elegans embryonale udvikling sker i to faser. Første, 10 runder af celle division koblet til celle skæbne specifikation generere de tre kimlag (ectoderm, mesoderm, og endoderm) over en 6 timers periode¹⁷. I de følgende 7 h, morfogenetiske hændelser drive dannelsen af differentierede væv^8,16. For at fange disse to aspekter af udvikling, vi byggede et par brugerdefinerede stammer, kimlag og Morphogenesis stammer¹⁰ (figur 2a), og brugte semi-High-gennemløb protokol til billed embryoner fra begge stammer. Kimlag stammen udtrykker transgen-kodede fluorescerende proteiner, der markerer kerner i ectoderm, mesoderm og endoderm i rød, gul og grøn. Denne stamme indeholder tre reporter-transgener: (1) et Trans gen, der udtrykker Pha-4:: gfp, som markerer kerner i tarmen og svælgen (grøn endoderm)^10,18,19, (2) en transgene udtrykker en mCherry-Histon fusion i epidermis og i ~ 1/3 af neuroner (rød ectoderm; Figur 2a) og (3) et transgen, der samtidig udtrykker mcherry og gfp-mærkede histoner i kropsvæg muskler (gul mesoderm). Morphogenesis stammen har to transgener, der udtrykker: (1) en grøn epitelial Junction markør (DLG-1:: GFP) i epidermis, og (2) en mCherry-Tagged plasma membran markør, i ~ 1/3 af neuroner (PCND-1 promotor; Figur 2A). For at øge effektiviteten af RNAi, begge stammer blev også konstrueret til at indeholde et par RNAi-sensibiliserende mutationer (NRE-1 (HD20) Lin-15b (hd126)²⁰. Disse blev konstrueret med det formål at udføre en storstilet RNAi-baseret skærm af ~ 2.000 gener, der kræves for embryonale udvikling. Dette par stammer vil dog også udgøre en generelt nyttig standardiseret platform til vurdering af udviklingsmæssige defekter i mutanter og til mere detaljerede analyser af rollerne for forskellige proteiner i udvikling.

Til dataindsamling i dette semi-høje gennemløb format, med disse stammer, grøn, rød og lyse-felt z-serien (18 x 2 μm² intervaller) indsamles, hver ~ 20 min, for en periode på 10 h i en 16 °c temperaturkontrolleret rum; Dette bevarer mikroskopet mellem 21-23 °C under kørslen. Den 20 min tidsinterval giver os mulighed for at billede 50 felter af embryoner (punkt besøg) pr eksperiment. Brugere kan skræddersy anskaffelser til kortere intervaller med færre point besøg eller længere intervaller med flere point besøg, så de passer bedst til deres eksperimentelle mål. For disse stammer, de tidlige udviklingsmæssige tidspunkter er ikke afbildet fordi vævsspecifikke journalister kørsel markør udtryk ikke begynder at udtrykke indtil midten-til-sen gastrulation. I denne tidlige fase blev brønde scannet ved lav forstørrelse (10x), og der er valgt felter til billeddannelse med høj forstørrelse. Udvælgelse af felter, der indeholder mere end én tidlig fase embryo anbefales, men undgå felter, hvor embryoner er delvist overlappende, overdrevent overfyldt, eller findes på den yderste kant af brønden. Efter overnatning 60x Imaging, en lav forstørrelse (10x) hel brønd scanning udføres for at afgøre, om embryoner luge med normal udseende (WT), luge med synlige abnormaliteter (larval unormal), eller er embryonale dødelige for hver betingelse vurderet ( Figur 1B). Dette trin tjener som et let alternativ til at oprette plader parallelt for at vurdere dødelighed på tværs af en større befolkning; hele godt 10x post-Scan giver embryonale dødelighed data på 50-80 embryoner per tilstand. Ved hjælp af denne foranstaltning til at sammenligne befolkningen embryonale dødelighed data for kontrol mellem kørsler er en nyttig kontrol, der sikrer konsistens med hensyn til sundhed af stammerne og de miljømæssige betingelser og forarbejdning trin. Når de er afbildet i kombination, giver de to brugerdefinerede reporter stammer informative udlæsninger for de fleste større udviklingsmæssige hændelser, herunder celle skæbne specifikation, dorsale interkalation, epidermal kabinet, forlængelse og neurogenese (repræsentativ kontrol billeder er vist i figur 2B, se også Wang et al.¹⁰).

Data behandling: automatiseret embryo beskæring og-orientering
Med vores billedbehandlings protokol indeholder hvert billedfelt med høj opløsning mellem 1 og 5 embryoner. disse embryoner er tilfældigt orienterede og er ofte placeret umiddelbart støder op til hinanden. Data indsamlet ved hjælp af konventionelle embryon monterings teknikker lider under de samme udfordringer. For at forberede data til efterfølgende visualisering og analyse er der behov for betydelig hands-on manipulation for at beskære og orientere embryonerne sekvenser, samt at pre-behandle dem til at trække baggrund, korrekt for drift, og kompensere for signal dæmpning med dybde. For at strømline denne proces blev der bygget et brugerdefineret embryo beskærings program, som isolerer og orienterer hvert embryo fra det bredere felt (figur 1C, figur 3). Dette program er blevet pakket som en brugervenlig, stand-alone program med grafisk brugergrænseflade (GUI, kompatibel med data fra de fleste Imaging platforme), der kan tage i en 3D time-lapse sekvens af et område af embryoner, og behandle det i individuelle TIFF-serien for hvert embryo i marken (figur 3B, tilgængelig på https://zenodo.org/record/3235681#.XPAnn4hKg2w)^10,12. Python-kildekoden til GUI (embryoCropUI.py) og en batch version af dette program (screenCrop.py) er også tilgængelig for erfarne Python-brugere på GitHub (https://github.com/renatkh/embryo_crop.git)^10,13. Kernen funktionalitet af dette program er at lokalisere, beskære, og orientere embryonet langs den forreste-posterior akse. Samtidig kan subtraktion af baggrund, dæmpning korrektion og drift korrektion udføres på datasættet ved hjælp af valgfrie justerbare indstillinger.

Kort sagt, den automatiserede beskæring software iterativt detekterer individuelle embryoner i en binær maske opnået fra de lyse-feltbilleder og sekventielt afgrøder embryoner fra alle kanaler og orienterer billederne langs den forreste-posterior akse (figur 3 B, først beskrevet i Wang et al.¹⁰). Før beskæring, softwaren korrigerer for drift, trækker baggrund og udfører dybde dæmpning korrektion i hver fluorescens kanal (valgfrit). For at opnå den binære maske anvender softwaren Canny Edge Detection²¹ til de lyse feltbilleder, udfører maksimal intensitet projektion af de tre centrale planer og fylder små huller. Algoritmen registrerer individuelle embryoner ved at montere en Cassini oval til en del af den binære maske kontur (Se figur 3B, 3c). Efter at have tilpasset den ovale langs hovedaksen, måler softwaren rød fluorescens intensitet i hver halvdel af det isolerede embryon og roterer embryonet, således at den røde intensitet vender mod venstre, hvilket sætter embryonet forreste til venstre for begge reporter stammer, der anvendes i dette arbejde (figur 3D). Pilotering af denne software afslørede, at de fleste embryoner blev effektivt beskåret som forventet. Mindre billeddannelse spørgsmål, såsom embryo drift, midlertidigt fokale fly tab (på grund af bobler i olie), eller overfyldte områder af embryoner ikke typisk forstyrre vellykket beskæring. Men for felter, hvor der var store klumper af embryoner (overlappende noget i z), embryoner, der var signifikant vippes inden for billedplanet (i Z), langsigtede fokale fly tab, eller embryoner, der var delvist cutoff, vellykket beskæring var ikke altid Opnåede. Disse problemer kan let omgås ved bedre felt udvælgelse i løbet af data erhvervelses fasen. Samlet set er forbehandling af data, der indsamles med denne metode med halv høj gennemløb eller ved hjælp af konventionelle monteringsmetoder, et nyttigt første skridt til visualisering og analyse af embryonale datasæt.

Validering af billedindsamling og databehandlingsmetoder: Visualiser fosterudvikling efter knock-down af 40 tidligere beskrevne gener
At validere denne semi-High-gennemløb billedsamling metode og brugerdefinerede beskæring regime, en lille RNAi skærm blev udført i de brugerdefinerede stammer, rettet mod 40 gener med tidligere beskrevne funktioner i celle skæbne specifikation og morfogenese ( beskrevet af Wang, Ochoa, Khaliullin og kolleger^10,11). For at gøre dette, blev dsRNA genereret mod hvert mål, injiceres L4 dyr fra hver stamme, ventede 20-24 h, og derefter dissekeret ud og afbildet embryoner ved hjælp af den protokol, der er beskrevet ovenfor (for komplet datasæt^10,11). Opnåelse af udviklingsmæssige fænotyper af RNAi kræver hæmning af både maternel og zygotisk genekspression. Udviklingsmæssige gener kan udtrykkes Maternelt, idet de resulterende proteinprodukter indlæses i embryonerne eller zygotisk udtrykkes i embryonet, eller i mange tilfælde både^10,22,23. Tiden mellem injektion og embryo filme er den kritiske variabel til effektivt at målrette mod Maternelt og zygotisk udtrykte populationer; timing bestemmer både mængden af injiceret dsRNA, der er indlæst i embryonet for at forhindre zygotisk Expression²⁴ og omfanget af maternel protein udtømning. Efter dsRNA injektion, den maternelle mRNA svarende til det målrettede gen bliver forringet og ikke restitueres over i et relevant tidsinterval. Præ-eksisterende protein udtømning kræver embryo produktion, som skubber moder proteinet fra germlinvæv ved at indlæse det til at danne embryoner. 20-24 h ved 20 °C er den korteste inkubationstid, der muliggør konsekvent maternel nedbrydning; maternel udtømning bliver bedre på senere tidspunkter (dvs., 36-42 h efter injektion). Mængden af injiceret dsRNA, der er indlæst i embryonet dikterer, hvor effektiv forebyggelse af zygotisk Gen ekspression vil være. Mængden af indlæste RNA toppe omkring 5-10 h efter injektion, når embryoner med injiceret materiale først befrugtet, faldende derefter. I vores erfaring, 24 h efter injektion er et optimalt tidspunkt, hvor maternel protein udtømning og hæmning af zygotisk genekspression er begge effektive. Analyse af fænotyper i de brugerdefinerede reporter stammer, der anvendes i dette arbejde, på tværs af sættet af 40 test gener, viste, at vores kombinerede protokol gav særskilte, meget reproducerbare signatur fænotyper på tværs af et bredt spektrum af gener involveret i celle skæbne specifikation og morfogenesis (Se Wang et al.¹⁰); det komplette datasæt er tilgængeligt¹¹). Som et eksempel på disse data, stadig billeder af fire forskellige embryoner til kontrol, Pha-4 (RNAi), PAL-1 (RNAi), og Mex-3 (RNAi) i kimlag reporter stamme er vist i figur 4A. Se Wang et al.¹⁰ for en mere omfattende drøftelse af de fænotyper, der er observeret i 40-gene RNAi-skærmen.

ImageJ makro: kompilering og visualisering af alle data for en given betingelse
Visualisering af et stort antal embryoner fra individuelle TIFF-stakke kan være kedelig og tidskrævende at arbejde igennem. Fra vores indledende indsats, > 400 individuelle embryoner blev isoleret ved hjælp af Custom automatiseret beskæring program beskrevet ovenfor. For at fremskynde first-pass-analysen byggede vi en ImageJ makro, som genererer en matrix af alle embryoner, der er afbildet for en given RNAi-tilstand i en given stamme baggrund (figur 4B). For hvert embryon i matrixen vises et billede med et lysfelt og et projicerings billede med maksimal intensitet side om side for hvert tidspunkt for at generere en sammensat filmfil. Mens denne makro blev skrevet til at fungere med vores filstruktur, kan den redigeres for at imødekomme brugerens filstruktur. For de bedste resultater, dog, brugere bør følge navngivning og filstruktur konventioner, der er angivet i protokollen (Se Zenodo eller GitHub README filer for mere specifikke for Python og ImageJ Application navngivning konventioner). Se de data, der er deponeret i Dryad-databasen^10,11, for at se alle de ImageJ-behandlede data og få en mere dybtgående analyse af de fænotyper, der er observeret for 40-gentestsættet. Dette ImageJ visualisering format muliggør hurtig vurdering af den samlede fænotype og dens penetrans, og gør det nemt at markere datakvalitet spørgsmål, såsom tilstedeværelsen af snavs eller tab af brændfly. Samlet, kombinationen af semi-High-gennemløb data erhvervelse metode, beskæring program og ImageJ visualisering værktøj, kombineret med brugerdefinerede reporter stammer, i høj grad letter større skala bestræbelser på at studere embryonale udvikling.

Figur 1. Oversigt over billeddannelses metode med høj indhold, databehandlings procedure og vigtige værktøjer. (A) en sammenligning af de karakteristiske træk ved den standard agrose pad-baserede metode til montering C. elegans embryoner til semi-High-gennemløb multi-Well Imaging tilgang beskrevet her. B) oversigt over metoden med halv højt gennemløb til overvågning af embryonal udvikling. Se teksten for at få flere oplysninger. (C) oversigt over databehandlings-og visualiserings værktøjerne, som kan anvendes på data, der er erhvervet ved hjælp af enten en konventionel agrose pad-baseret monteringsprocedure eller semi-High-gennemløb multi-brønd plade-baseret metode beskrevet heri. En enkelt 3-kanals tidsforskudt embryo sekvens fra et felt (til venstre) eller flere 3-kanals, 4-dimensionelle felter af embryo data (højre) kan behandles ved hjælp af det brugerdefinerede beskærings program, som er kompatibelt med data, der er hentet på de fleste billed platforme. Den grafiske brugergrænseflade (GUI) version af programmet er brugervenlig og kræver ikke nogen programmering ekspertise. Den screenCrop.py ansøgning kræver Python ekspertise, men det har tilføjet kapaciteter-nemlig at det kan beskære i batch-format. Produktionen af dette trin er tæt beskåret, anterior-posterior orienteret embryo TIFF stakke. Hvis du vil visualisere alle data fra en enkelt betingelse, er en ImageJ-makro opbygget, der samler beskårne, roterede TIFF-stakke for at vise et billede i lysfelt og maksimal intensitet for hvert embryo ved hvert tidspunkt. (D) panel viser væsentlige værktøjer, der er nødvendige for dissektion og opsætning af semi-High-gennemløb Imaging format. Nogle figur komponenter gengives med tilladelse fra Wang et al.¹⁰. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.

Figur 2. Brugerdefinerede stammer genereret for high-Content Imaging af C. elegans embryo Genesis. (A) skematik illustrerer de transgener, der anvendes til at konstruere kimlag (top) og morfogenesis (bund) stammer. B) maksimale intensitets projektions paneler viser udviklingsmæssige tidsforløb i Morfogenesis (top) og kimlag (bund) stammer. Ventral visning vises som illustreret i skematisk (venstre). Tiden er relativ i forhold til komma stadiet (t = 0), som let kunne identificeres i begge stammer. Scale bar = 10 μm. figur gengivet med tilladelse fra Wang et al.¹⁰. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.

Figur 3. Custom beskæring program isolerer og orienterer individuelle embryoner fra billeddannelse felter. (A) skematisk illustrerer funktionerne i den brugerdefinerede embryo beskæring program og fremhæver de to muligheder for at få adgang til dette program: en brugervenlig GUI interface, som kræver ingen programmering ekspertise og er tilgængelig på zenodo (venstre) og en batch Beskæring version af programmet, som kræver Python erfaring og er tilgængelig på GitHub (højre). (B) grafik opsummerer den automatiserede beskærings algoritme – der genereres en binær maske fra 8-bit lysfelt-billeder, og individuelle embryoner opdages, beskæres og orienteres langs den forreste-posterior akse. Scale bar er 10 μm. (C) skematiske detaljer den procedure, der anvendes til iterativt at detektere embryoner i den binære maske. D) skematisk illustrerer den metode, der anvendes til at orientere embryoner langs den forreste, bageste akse. Paneler B-D gengivet med tilladelse fra Wang et al.¹⁰. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.

Figur 4. Custom ImageJ Macro muliggør visualisering af RNAi-screeningsdata ved at generere sammensatte filer for hver betingelse. A) embryoner for tre eksempel RNAi-betingelser fra 40-gentestsættet (Se Wang et al.^10,11 for komplet datasæt) vises (højre), der fremhæver de særskilte signatur fænotyper, der opnås for hver og reproducerbarhed af fænotyperne inden for hver betingelse. Panel blev tilpasset med tilladelse fra Wang et al.¹⁰. (B) panel illustrerer, hvordan Custom ImageJ Macro (OpenandCombine_embsV2. IJM) arrays embryoner fra en given RNAi-tilstand i en sammensat ImageJ fil, der arrays lysfelt og maksimal intensitet fremskrivninger for hvert embryo på hvert tidspunkt. Mens kun ét eksempel er fremhævet, kan denne makro kompilere dataene for mange RNAi-betingelser på én gang. ImageJ Macro er tilgængelig på Zenodo¹². Scale bar = 10 μm. Klik her for at se en større version af dette tal.

Discussion

Dette arbejde beskriver en række værktøjer og metoder, der blev udviklet for at muliggøre større indsats for at profilere funktionen af gener i embryonale udvikling i C. elegans. Vores semi-High-gennemløb metode tillader 3D time-lapse billeddannelse af embryonale udvikling ved 20 min opløsning for 80 – 100 embryoner i et enkelt eksperiment. Mens denne protokol kan tilpasses til brug med enhver ønsket markør stamme (r), dette arbejde demonstrerer potentialet i metoden ved hjælp af to brugerdefinerede stammer udviklet til at overvåge hændelser under embryogenese: (1) en kimlag reporter stamme, hvor vævs specifik promotorer drive ekspression af fluorescerende histoner at markere endoderm, mesoderm og ectoderm kerner, og (2) en morfogenese reporter stamme, som bruger epidermal og neuronal initiativtagere til at drive ekspression af fluorescerende markører i celle-kryds og plasma membranen. Ved at afbilde de to stammer, kan konsekvenserne af molekylære forstyrrelser på celle skæbne specifikation og morfogenetiske hændelser fanges med bemærkelsesværdige detaljer. For at imødegå udfordringerne i forbindelse med den mængde data, der genereres af denne metode, er der udviklet brugerdefinerede værktøjer med det formål at strømline databehandling og visualisering. Det første værktøj afgrøder individuelle embryoner ud af et område af embryoner i 3D time-lapse-sekvenser, mens også rotere embryoner til en standard anterior-posterior orientering og udfører baggrunds subtraktion, drift korrektion, og dæmpning korrektion. Dette program blev pakket som en brugervenlig GUI (https://zenodo.org/record/3235681#.XPAnn4hKg2w) og kildekoden og en mere avanceret batching version af programmet for Python savvy brugere (GitHub.com/renatkh/embryo_crop.git) er forudsat^10,12,13. Endelig, at visualisere disse behandlede data i et meningsfuldt format, en ImageJ makro blev udtænkt; Dette gør det muligt for brugeren at visualisere alle embryoner fra en given RNAi-tilstand i en multi paneleret film, som viser en lysfelt og maksimal intensitet projektion for hvert embryo på hvert tidspunkt. Sammen, de stammer, protokol, og databehandling værktøjer, gøre en indsats for at studere C. elegans embryo Genesis i større skala en mere gennemførlig bestræbelse.

Mens ligetil at gennemføre i det hele, den semi-High-gennemløb erhvervelse metode, der er beskrevet her kræver opmærksomhed på et par kritiske detaljer, som diskuteres nedenfor. For det første skal brugerne have adgang til et Konfokal mikroskop med præcisions punkt-besøgs kapacitet, der kan udstyres med en multi-brønd plade holder. Den mest kritiske overvejelse for denne protokol er, at mikroskopet opretholdes i et temperaturkontrolleret rum. Mens mange mikroskoper har kapacitet til at varme, kan de fleste ikke pålideligt afkøles, således at den miljømæssige temperatur skal tilpasses for at opretholde en konstant C. elegans venlig temperatur. For at opnå dette, billed lokalet holdes ved 16 °C. Prøvearealet af instrumentet opvarmer op til 21-23 °C under billeddannelse. Udsving i stuetemperatur kan påvirke udviklingsmæssige timing og subtilt ændre brændplanet nøjagtighed under punkt besøger og bør undgås så meget som muligt. Bemærk, at kørsel ved temperaturer over 23 ° c kan resultere i en betydelig stigning i embryonal dødelighed for kontrolbetingelser og er ikke tilrådeligt. En anden vigtig overvejelse er embryo udvælgelse og dispersion under dissektion. Der bør udvises forsigtighed for at undgå at overføre ældre embryoner til billedbehandlings brøndene, da de efter rugeæg har tendens til at skubbe tilstødende embryoner ud af betragtning; forekomsten af dette mindskes ved inddragelse af bedøvelsesmiddel i medierne. Spredningen af embryoner, for at undgå store klumper af embryoner, er også en kritisk variabel. Clumping tendens til at forekomme, når embryoner overføres til brøndene i kapillar pipetter, der er for tyndt trukket ud, eller når embryoner ikke er tilstrækkeligt spredt under dissektion. En anden overvejelse er, at punkt udvælgelse og fokus plan tuning tager tid. Pladen holdes ikke på isen under denne proces, så embryonerne begynder at udvikle sig med det samme. For de brugerdefinerede markør stammer anvendes i denne undersøgelse, der er omkring en 90 min vindue efter pladen er fjernet fra isen for at udføre plade scanning og punkt udvælgelse før markører begynder at blive udtrykt. Dette er tilstrækkelig tid til at sætte op på vores instrument med disse stammer, men andre mikroskoper og stammer kan tilbyde yderligere tid udfordringer, der vil kræve fejlfinding. Endelig, den metode, vi beskriver beskæftiger en 60x olie mål at indsamle z-stakke af 50 felter ved 20 minutters tidsintervaller. Som vi fremhæver, kan den tidsmæssige opløsning øges ved at reducere antallet af felter, der er inddelt. For eksempel, 10 felter kan afbildet ved 4 min tid opløsning. Et andet alternativ til stigende tidsmæssig opløsning er at bruge en lavere forstørrelse, høj numerisk blænde mål; i dette tilfælde tillader det større synsfelt billeddannelse af et stort antal embryoner ved højere tidsopløsning med kun en moderat reduktion i rumlig opløsning.

For at muliggøre databehandling og visualisering i større målestok byggede vi brugerdefinerede værktøjer og gjorde dem frit tilgængelige. Det mest generelt nyttige værktøj er Custom beskæring GUI, som kræver ingen programmering ekspertise til at operere. GUI kan bruges til at beskære og orientere embryoner i alle faser af udviklingen og er kompatibel med alle markører, hvilket gør det nyttigt ikke kun for udviklingsmæssige biologer, men også for forskere, der studerer processer i det tidlige embryon. Fordi output af GUI er præcist beskåret, orienteret, skaleret, drift-korrigeret data, kan dataene let kanaliseret ind i en automatiseret analyse pipeline, hvilket gør dette værktøj nyttigt til analyse af tidligere og fremtidige data; Hvis der anvendes passende stammer, kan resulterende datafiler bruges som input til eksisterende automatiserede analyse regimer, såsom embryogenese justeringsværktøjer²⁵. For at bruge programmet, er det vigtigt for brugerne at være opmærksom på, at beskæring algoritme kræver en lysfelt eller dic billede, der skal indsamles for hvert trin og tidspunkt. Desuden bør brugerne bemærke, at den anterior-posterior orientering algoritme er struktureret baseret på fordelingen af det røde signal i Kim-lag reporter og morfogenese rapport stammer, vist i dette arbejde. Nøjagtigheden af AP-orienteringen i andre markør stammer skal derfor evalueres fra sag til sag. Den GUI er blevet testet med data indsamlet på tre forskellige konfokale Imaging platforme og er kompatibel over hele linjen for multi-TIFF stakke og TIFF-serien. Ud over den brugervenlige version, kildekoden til GUI og en batch-version af dette program er også blevet gjort tilgængelige, med forbehold, at programmeringserfaring er påkrævet, og fil strukturer og navngivning konventioner skal følges. Endelig blev en ImageJ Processing Macro bygget til at tage RAW-billedstakke for alle embryoner, i hver RNAi-tilstand og kompilere et informativt array for at vise alle embryoner for denne betingelse i lysfelt og fluorescens maksimale intensitets projektion på hvert tidspunkt. Dette værktøj kan tilpasses brugerens specifikationer og er en nyttig makro til at gøre data udforskning og kvalitetskontrol vurdering enklere.

Sammen, den semi-High-gennemløb filme metode sammen med embryo beskæring og billedbehandling værktøjer beskrevet heri vil lette analysen af C. elegans embryonale udvikling ved hjælp af en række mutanter, perturbations, og markør stammer. I vores eget laboratorium, en storstilet skærm anvender disse metoder til at filme embryoner fra de to brugerdefinerede manipuleret stammer beskrevet her efter Knockdown af ~ 2.000 gener, der kræves for udvikling, er i øjeblikket i gang. Endelig vil dataene fra denne indsats tjene som en yderligere ressource til at øge bestræbelserne på at forstå celle skæbne specifikation og morfogenetiske hændelser under embryogenese.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Aspirator Tube Assembly	Drummond Scientific	2-000-000
Calibrated Pipette (25 mL)	Drummond Scientific	2-000-025
Cell Voyager Software	Yokogawa Electric Corp	Included with CV1000
Conical Tube (15 mL)	USA Scientific	1475-0501
CV1000 Microscope	Yokogawa Electric Corp	CV1000
Depression slide (3-well)	Erie Scientific	1520-006
Dissection Microscope	Nikon	SMZ-645
Eppendorf Centrifuge 5810R	Eppendorf	5811 07336
ImageJ/FIJI	Open Source	https://imagej.net/Fiji
M9 Buffer	Lab Prepared	https://openwetware.org/wiki/M9_salts
Microcentrifuge Tube (1.5 mL)	USA Scientific	1615-5500
Microseal F-foil Seal	Bio-Rad	MSF1001
NGM Plates	Lab Prepared	http://www.wormbook.org/chapters/www_strainmaintain/strainmaintain.html#d0e214
Scalpel #15	Bard Parker	REF 371615
Sensoplate Plus, 384 Well, F-bottom, Glass Bottom	Greiner Bio-One	781855
Tetramisole Hydrochloride	Sigma Aldirch	T1512-10G
Tweezers, Dumont #3	Electron Microscopy Sciences	0109-3-PO
U-PlanApo objective (10× 0.4 NA)	Olympus	1-U2B823
U-PlanApo objective (60× 1.35 NA)	Olympus	1-U2B832