C. elegans 배아 개발을 분석하는 세미 고처리량 이미징 방법 및 데이터 시각화 툴킷
Summary
이 작품은 한 번의 하룻밤 실행에 80-100 C. 예쁜 꼬마 배아에서 배아의 동시 3D 시간 경과 영상을 허용하는 반 높은 처리량 프로토콜을 설명합니다. 또한 데이터 분석을 간소화하기 위해 이미지 처리 및 시각화 도구가 포함되어 있습니다. 사용자 정의 리포터 균주와 이러한 방법의 조합은 배아 발생의 상세한 모니터링을 가능하게.
Abstract
C. 예쁜꼬마선충은 배아 발달 중 세포 운명 명세서 및 형태유전학적 사건을 체계적으로 분석하기 위한 최고의 시스템입니다. 한 가지 과제는 배아 발생이 약 13시간 동안 동적으로 전개된다는 것입니다. 이 반나절 긴 기간 척도는 이미지화 할 수있는 배아의 수를 제한하여 실험의 범위를 제한했습니다. 여기에서는 중간 시간 해상도에서 최대 14개의 다른 조건에서 단일 하룻밤 실행에서 80-100개의 배아에서 동시에 3D 시간 경과 이미징을 허용하는 반 고처리량 프로토콜을 설명합니다. 이 프로토콜은 간단하며 지점 방문 용량을 갖춘 현미경에 액세스 할 수있는 모든 실험실에서 구현 할 수 있습니다. 이 프로토콜의 유용성은 세균 층 명세서 및 형태 형성의 주요 측면을 시각화하기 위해 최적화 된 형광 마커를 표현하는 두 개의 맞춤형 균주를 이미지화하는 데 사용함으로써 입증됩니다. 데이터를 분석하기 위해 모든 채널, z-스텝 및 타임포인트에서 개별 배아를 더 넓은 시야에서 자르는 사용자 지정 프로그램을 구축하고 각 배아에 대한 서열을 별도의 티프 스택으로 저장합니다. 사용자 친화적인 그래픽 사용자 인터페이스(GUI)를 포함하는 이 프로그램은 시각화 또는 자동화된 분석을 준비하기 위해 개별 배아를 분리, 전처리 및 균일하게 방향을 지정하여 데이터 처리를 간소화합니다. 또한 각 배아의 최대 강도 형광 투영 및 각 배아의 밝은 필드 이미지를 표시하는 다중 패널 파일로 개별 배아 데이터를 컴파일하는 ImageJ 매크로가 제공됩니다. 본 원에 기재된 프로토콜 및 도구는 이전에 기술된 40개의 발달 유전자의 노크다운 에 따른 배아 발달을 특성화하기 위해 이를 사용하여 검증되었다; 이 분석은 이전에 추가된 발달 표현형을 시각화하고 새로운 표현형을 밝혔습니다. 요약하면, 이 작품은 유익한 형광 마커를 표현하는 균주와 결합될 때, 분석하기 위한 실험을 크게 가속화하는 자르기 프로그램 및 ImageJ 시각화 도구와 결합된 반고처리량 이미징 방법을 자세히 설명합니다. 배아 발달.
Introduction
상기 C. elegans 배아는 기계론적 세포 생물학 및 세포 운명 명세서 및 형태유전학적 사건의 분석을 위한 중요한 모델 시스템으로 배아발달을 유도하는 1,2,3,4 ,5,6,7,8,9. 현재까지, 배아에서 세포 수준 사건 및 세포 운명 명세둘 다의 특성의 다량은 상대적으로 높은 시간 별 화상 진찰 실험을 사용하여 달성되었습니다 (즉, 10-100 s마다 취득) 배아발 발현 형광 마커. 초에서 수십 분의 순서로 이벤트에 적합하지만 이 방법은 기술적으로 더 긴 프로세스의 특성화에 대해 몇 시간에서 며칠로 제한됩니다. 연신장의 끝에 첫번째 절단에서 배아 발달은 대략 10 시간 걸립니다. 이 시점에서, 동시 낮은 시간 해상도 이미징을 허용 하는 반 높은 처리량 방법 (즉, 5-20 분 시간 간격에서 취득) 배아의 더 큰 코호트, 다른 조건에서, 실험의 새로운 범위를 열 것 이다; 예를 들면, 체계적인 대규모 검열 노력을 가능하게 하고 분자 섭란의 결과의 비교를 위한 태아의 충분한 수의 분석.
여기에서, 우리는 C. elegans 배아 발생을 감시하기 위한 반 높은 처리량 방법을 기술합니다 80-100배아에 있는 발달의 동시 3D 시간 경과 화상 진찰을 가능하게 하는, 14개의 다른 조건까지, 단 하나 밤새 실행에서. 이 프로토콜은 구현이 간단하며 포인트 방문 기능이있는 현미경에 액세스 할 수있는 모든 실험실에서 수행 할 수 있습니다. 이 프로토콜의 주요 단계는 그림 1에설명되어 있습니다. 간단히 말해서, 배아는 관심의 형광 마커를 발현하고 젊은 배아 (2-8 세포 단계)를 화상 진찰을 위한 384 웰 판의 우물로 옮기는 gravid 성인에게서 해부됩니다. 이 형식에서는, 상대적으로 작은 잘 크기는 시간 경과 화상 진찰을 위한 다중 배아를 포함하는 필드의 확인을 용이하게 하는 좁은 지역으로 배영을 깔때기. 배아 의 코호트에 걸쳐 대략 동기 발달을 유지하기 위해, 해부는 차가운 매체에서 수행되고 플레이트는 1 시간 긴 해부 시간 기간 동안 중요한 발달을 방지 얼음에 개최됩니다. 플레이트는 현미경으로 이송되고 배아는 60x 오일 침지 1.35 NA 렌즈를 사용하여 20 분 간격으로 밤새 온도 제어 실에서 촬영되어 2 μm 단계에서 전체 z 범위를 수집합니다. 1-5개의 배아를 포함하는 각각 50개의 필드는, 한 번의 하룻밤 실행에서 심상됩니다. 원하는 실험에 따라 이미지 필드 수를 비례적으로 줄임으로써 시간 해상도(예: 5-10분 간격으로 이미징)를 늘릴 수 있습니다.
이 프로토콜을 사용하면 하룻밤 동안 실행해도 상당한 양의 데이터(50개 필드에 분산된 80~100개의 배아)를 생성하며, 더 큰 실험은 데이터 분석과 관련하여 빠르게 관리하기 가 불가능해질 수 있습니다. 이 데이터의 처리, 시각화 및 분석을 용이하게 하기 위해 배아를 자르고 방향을 조정하고 전처리 단계(선택 사항)를 수행하고 데이터를 컴파일하여 보기를 단순화하는 ImageJ 매크로를 수행하는 프로그램이 구축되었습니다. 이러한 프로그램은 이미징 방법과 무관하므로 단일 브라이트필드 평면만 필요로 하기 때문에 기존의 접근 방식을 사용하여 수집된 이미지를 처리하는 데 사용할 수 있습니다. 첫 번째 프로그램은 여러 배아 (GUI 옵션 또는 소스 코드 embryoCrop.py) 또는 여러 배아 (screenCrop.py)를 포함하는 여러 4D 필드를 포함하는 4D 필드에서, 단단히 배아를 작물과 전방 후방 구성에서 방향을 지정합니다. 또한 이러한 프로그램은 사용자에게 배경 감속, 드리프트 보정 및 감쇠 보정을 수행할 수 있는 옵션을 제공합니다. 결과 파일은 자동화된 이미지 분석으로 수정가능한 각 배아에 대해 균일하게 사전 처리되고 단단히 잘려진 티프 스택입니다. 각 조건에 대한 모든 배아를 더 간단하게 볼 수 있도록 ImageJ 매크로(OpenandCombine_embsV2.ijm)가 작성되어 주어진 상태의 모든 배아를 단일 티프 스택으로 조립하고 밝은 필드 이미지와 최대 강도 프로젝션 색상을 배열합니다. RGB) 각 배아에 대해 나란히 오버레이합니다. 이 방법은 배아 층의 주요 측면을 시각화하기 위해 최적화 된 형광 마커를 발현하는 한 쌍의 사용자 정의 내장 균주에서 40 개의 이전에 설명 된 발달 유전자를 노크 한 후 배아 발달을 특성화하는 데 사용함으로써 검증되었습니다. 사양 및 형태 형성10,11. 함께, 세미 높은 처리량 배아 이미징 프로토콜 및 이미지 처리 도구는 개발 프로세스를 이해하기위한 더 높은 샘플 수 실험및 대규모 선별 노력을 가능하게 할 것이다. 또한, 이러한 균주는 또한 배아 발생에 대한 분자 교란의 효과를 검사하기위한 효율적인 수단을 제공 할 것입니다.
Protocol
Representative Results
Discussion
이 작품은 C. elegans에있는 배아 발달에 있는 유전자의 기능을 프로파일링하기 위하여 더 큰 규모의 노력을 가능하게 하기 위하여 개발된 공구 및 방법의 제품군을 기술합니다. 우리의 반 높은 처리량 방법은 단일 실험에서 80-100 배아에 대한 20 분 해상도에서 배아 발달의 3D 시간 경과 이미징을 할 수 있습니다. 이 프로토콜은 원하는 마커 균주와 함께 사용하도록 적응 될 수 있지만,이 작품은…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
S.D.O.는 캘리포니아 샌디에이고 대학이 후원하는 국립 의학 연구소의 지원을 받았습니다 (NIH / IRACDA K12 GM068524). A.D.와 K.O.는 루드비히 암 연구소의 지원을 받았으며, 이 연구소는 이 연구를 지원하는 데 사용되는 연구 자금을 제공했습니다. 우리는이 프로젝트의 초기 단계에서 그의 조언에 대한 앤드류 Chisholm에 감사드립니다, 초기 방법 개발 단계 후이 프로젝트에 기여에 대한 로널드 빅스, 지원 및 소분자 발견에 대한 액세스 데이브 젠킨스와 앤디 시아우 고콘텐츠 이미징 시스템.
Materials
| Aspirator Tube Assembly | Drummond Scientific | 2-000-000 | |
| Calibrated Pipette (25mL) | Drummond Scientific | 2-000-025 | |
| Cell Voyager Software | Yokogawa Electric Corp | Included with CV1000 | |
| Conical Tube (15 mL ) | USA Scientific | 1475-0501 | |
| CV1000 Microscope | Yokogawa Electric Corp | CV1000 | |
| Depression slide (3-well) | Erie Scientific | 1520-006 | |
| Dissection Microscope | Nikon | SMZ-645 | |
| Eppendorf Centrifuge 5810R | Eppendorf | 5811 07336 | |
| ImageJ/FIJI | Open Source | https://imagej.net/Fiji | |
| M9 Buffer | Lab Prepared | https://openwetware.org/wiki/M9_salts | |
| Microcentrifuge Tube (1.5 mLl) | USA Scientific | 1615-5500 | |
| Microseal F-foil Seal | Bio-Rad | MSF1001 | |
| NGM Plates | Lab Prepared | http://www.wormbook.org/chapters/www_strainmaintain/strainmaintain.html#d0e214 | |
| Scalpel #15 | Bard Parker | REF 371615 | |
| Sensoplate Plus, 384 Well, F-bottom, Glass Bottom | Greiner Bio-One | 781855 | |
| Tetramisole Hydrochloride | Sigma Aldirch | T1512-10G | |
| Tweezers, Dumont #3 | Electron Microscopy Sciences | 0109-3-PO | |
| U-PlanApo objective (10× 0.4NA) | Olympus | 1-U2B823 | |
| U-PlanApo objective (60× 1.35 NA) | Olympus | 1-U2B832 |
References
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