Summary
يصف هذا العمل بروتوكولا شبه عالي الانتاجيه يسمح بالتصوير المتزامن ثلاثي الابعاد لتولد الاجنه في الاجنه من 80 إلى 100 درجه مئوية في التشغيل الليلي الواحد. بالاضافه إلى ذلك ، يتم تضمين أدوات معالجه الصور والمرئيات لتبسيط تحليل البيانات. الجمع بين هذه الأساليب مع سلالات مراسل مخصص يتيح رصد مفصل لتولد الاجنه.
Abstract
C. اليجايليس هو النظام الرئيسي للتحليل المنهجي لمواصفات مصير الخلية والاحداث الوراثية اثناء النمو الجنيني. ويتمثل أحد التحديات في ان الاجنه تتكشف ديناميكيا علي مدي فتره تبلغ حوالي 13 ساعة ؛ وقد ادي هذا المقياس الزمني الذي دام نصف يوم إلى تقييد نطاق التجارب من خلال الحد من عدد الاجنه التي يمكن ان تكون غير محدده العمر. هنا ، ونحن وصف بروتوكول شبه عاليه الانتاجيه التي تسمح للتصوير في وقت واحد 3D الفاصل الزمني للتنمية في 80-100 الاجنه في وقت معتدل القرار ، من ما يصل إلى 14 حاله مختلفه ، في الشوط الواحد بين عشيه وضحيها. البروتوكول هو واضح ويمكن تنفيذها من قبل اي مختبر مع الوصول إلى المجهر مع نقطه القدرة علي الزيارة. ويتجلى الفائدة من هذا البروتوكول باستخدامه لصوره اثنين من السلالات التي بنيت خصيصا التعبير عن علامات الفلورسنت الأمثل لتصور الجوانب الرئيسية للمواصفات الجرثومية طبقه ونشاه المستنقعات. لتحليل البيانات ، تم بناء برنامج مخصص يقوم باقتصاص الاجنه الفردية من مجال عرض أوسع في جميع القناات ، والخطوات z ، والنقاط الزمنيه ، ويحفظ المتواليات لكل جنين في كومه tiff منفصلة. وهذا البرنامج ، الذي يتضمن واجهه مستخدم رسوميه سهله الاستخدام (GUI) ، يبسط معالجه البيانات عن طريق العزل ، والمعالجة المسبقة ، وتوجيه الاجنه الفردية بشكل موحد استعدادا للتصور أو التحليل الألى. كما يتم توفير ماكرو ImageJ الذي يقوم بتجميع بيانات الجنين الفردية في ملف متعدد اللوحات يعرض الحد الأقصى من الإسقاطات الفلورية وصور الحقول الساطعة لكل جنين في كل نقطه زمنيه. تم التحقق من صحة البروتوكولات والاداات الموصوفة هنا باستخدامها لتوصيف النمو الجنيني بعد ضرب 40 الجينات التنموية الموصوفة سابقا. هذا التحليل تصور الأنماط الظاهرية التنموية المشروحة سابقا وكشفت عن أخرى جديده. وباختصار ، فان هذا العمل يفصل طريقه التصوير شبه عاليه الانتاجيه إلى جانب برنامج الاقتصاص وأداه التصور ImageJ التي ، عندما يقترن مع سلالات التعبير عن علامات الفلورسنت المعلوماتية ، يسرع إلى حد كبير التجارب لتحليل النمو الجنيني.
Introduction
الجنين c. ايلينيسس هو نظام نموذجي مهم لبيولوجيا الخلية الميكانيكية وتحليل مواصفات مصير الخلية والاحداث مورفوجينيتيك قياده التنمية الجنينية1,2,3,4 ،5،6،7،8،9. حتى الآن ، تم تحقيق الكثير من توصيف كل من الاحداث علي المستوي الخلوي ومواصفات مصير الخلية في الجنين باستخدام الاستبانة الزمنيه عاليه نسبيا تجارب التصوير الواحد في الوقت (اي اقتناء كل 10-100 ثانيه) من الاجنه التعبير عن علامات الفلورسنت. وعلي الرغم من ان هذا النهج مناسب تماما للاحداث التي تقام علي ترتيب الثواني إلى عشرات الدقائق ، فانه يصبح مقيدا من الناحية التقنية لتوصيف العمليات الأطول ، علي حسب ترتيب الساعات والأيام. التنمية الجنينية من الانقسام الأول إلى نهاية استطاله يستغرق حوالي 10 ساعة. في هذا المقياس الزمني ، والطرق شبه عاليه الانتاجيه التي من شانها ان تسمح للتصوير في وقت واحد اقل دقه التصوير (اي الاستحواذ علي فترات زمنيه 5-20 دقيقه) من المجموعات الأكبر من الاجنه ، من ظروف مختلفه ، من شانه ان يفتح نطاقا جديدا من التجارب ؛ علي سبيل المثال ، تمكين جهود الفحص المنهجي علي نطاق واسع وتحليل اعداد كافيه من الاجنه للمقارنة بين عواقب الاضطرابات الجزيئية.
هنا ، ونحن وصف طريقه شبه عاليه الانتاجيه لرصد الاجنه c. التي تمكن في وقت واحد 3d التصوير الفاصل الزمني للتنمية في 80-100 الاجنه ، من ما يصل إلى 14 حاله مختلفه ، في الشوط الواحد بين عشيه وضحيها. والبروتوكول مباشر لتنفيذه ويمكن ان يقوم به اي مختبر مع امكانيه الوصول إلى المجهر مع قدرات زيارة نقطه. وترد الخطوات الرئيسية في هذا البروتوكول في الشكل 1. وباختصار ، يتم تشريح الاجنه من البالغين الذين يعبرون عن علامات الفلورسنت المثيرة للاهتمام ونقل الاجنه الشابة (2 – 8 خلايا المرحلة) إلى الآبار من لوحه 384 البئر للتصوير. وفي هذا الشكل ، فان حجم البئر الصغير نسبيا يدخل الاجنه في منطقه ضيقه ، مما يسهل تحديد الحقول التي تحتوي علي أجنه متعددة للتصوير بالفواصل الزمنيه. للحفاظ علي التطور متزامن تقريبا عبر مجموعه من الاجنه ، يتم تنفيذ التفكيك في وسائل الاعلام المبردة ويتم عقد لوحه علي الجليد ، والذي يمنع تطورا كبيرا خلال النافذة وقت التشريح ساعة طويلة. يتم نقل لوحه إلى المجهر ويتم تصوير الاجنه في غرفه التي تسيطر عليها درجه الحرارة بين عشيه وضحيها ، في 20 فتره زمنيه دقيقه ، وذلك باستخدام 60x الغمر النفط 1.35 NA عدسه ، لجمع الكامل z-المدى في 2 ميكرومتر الخطوات. 50 الحقول التي تحتوي علي ما بين 1 إلى 5 أجنه ، والتي يتم تصويرها في الشوط الواحد بين عشيه وضحيها. اعتمادا علي التجربة المطلوبة ، يمكن زيادة دقه الوقت (علي سبيل المثال ، التصوير بفواصل زمنيه تتراوح بين 5 و 10 دقائق) من خلال تقليل عدد الحقول التي لم يتم الحد منها بشكل تناسبي.
مع هذا البروتوكول ، حتى الشوط الواحد بين عشيه وضحيها يولد كميه كبيره من البيانات (80-100 الاجنه موزعه علي 50 الحقول) والتجارب الكبيرة يمكن ان تصبح بسرعة لا يمكن السيطرة عليها فيما يتعلق بتحليل البيانات. لتسهيل المعالجة والتصور وتبسيط تحليل هذه البيانات ، تم بناء برنامج لاقتصاص وتوجيه الاجنه وتنفيذ خطوات المعالجة المسبقة (اختياري) ، وماكرو ImageJ الذي يجمع البيانات لتبسيط العرض. ويمكن استخدام هذه البرامج لمعالجه الصور التي تم جمعها باستخدام النهج التقليدية ، لأنها مستقله عن طريقه التصوير ، وتتطلب فقط طائره واحده من الحقول الساطعة. البرنامج الأول ياخذ في حقل 4D التي تحتوي علي الاجنه متعددة (GUI الخيار أو رمز المصدر embryoCrop.py) أو حقول 4D متعددة تحتوي علي الاجنه متعددة (screenCrop.py) ، والمحاصيل باحكام الاجنه ويوجه لهم في التكوين الخلفي الامامي. كما تمنح هذه البرامج المستخدمين خيار اجراء الطرح الخلفي وتصحيح الانحراف وتصحيح التوهين. الملفات الناتجة هي بشكل موحد قبل المعالجة ، مكدسات tiff اقتصاص باحكام لكل جنين التي هي قابله للتعديل إلى تحليل الصور الألى. لجعله ابسط لعرض جميع الاجنه لكل شرط ، وقد كتب ماكرو ImageJ (OpenandCombine_embsV2) ، الذي يجمع كل الاجنه من حاله معينه في كومه tiff واحده والصور والمصفوفات برايت الحقل الأقصى الإسقاط كثافة اللون ( RGB) تراكبات ، جنبا إلى جنب ، لكل جنين. تم التحقق من صحة الأساليب باستخدامها لتوصيف التنمية الجنينية بعد ضرب من 40 الجينات التنموية الموصوفة سابقا في زوج من السلالات التي بنيت خصيصا التعبير عن علامات الفلورسنت الأمثل لتصور الجوانب الرئيسية للطبقة الجرثومية مواصفة و [مورفوجنسيس]10,11. ومعا ، فان بروتوكول تصوير الاجنه شبه العالية وأداات معالجه الصور ستمكن من اجراء التجارب علي عدد أكبر من العينات وجهود الفرز الواسعة النطاق الرامية إلى فهم العمليات التنموية. الاضافه إلى ذلك ، ستوفر هذه السلالات أيضا وسيله فعاله لفحص اثار الاضطرابات الجزيئية علي الاجنه.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1 . اعداد الاجنه الخاصة بالتصوير شبه العالي الانتاجيه
ملاحظه: والهدف من هذا الجزء من البروتوكول هو تحميل السكان من شبه متزامنة (2 إلى 8-خليه المرحلة) c. الاجنه ، تشريح من سلالات علامة مناسبه (الشكل 2) ، إلى أسفل الزجاج 384-بئر لوحه للتصوير. ويمكن أيضا ان تعمل اشكال اللوحات الأخرى ، ولكن يفضل لوحات البئر 384 لان حجم البئر الصغير يقيد انتشار الاجنه إلى منطقه صغيره نسبيا ، مما يسهل تحديد الحقول التي تحتوي علي أجنه متعددة للتصوير بالفواصل الزمنيه. ويضمن تزامن الاجنه تقريبا ان يتم التقاط المسار الكامل للتنمية لكل من الاجنه في الحقل.
- اعداد 5-10 مل من 0.1 mg/mL محلول من هيدروكلوريد تيترايسوزول (TMHC) مخدر المذاب في الجليد الباردة مسنومكس المتوسطة (0.45 M Na2hpo4∙ 7h2O, 0.11 m KH2PO4, 0.04 m nacl, 0.09 m NH4Cl) لاستخدامها خلال تشريح والتصوير. وتشمل وسائل الاعلام هذه المخدرات للتاكد من ان اليرقات المتحركة التي فقست لا تعطل تصوير الاجنه في مراحل النمو المبكرة.
ملاحظه: إذا كنت تستخدم أدوات الاقتصاص والتصور لتحليل البيانات التي تم الحصول عليها باستخدام أساليب تركيب اللوحة القياسية ، فانتقل إلى القسم 3 أدناه. - Aliquot 70 μL من المحلول المعد في الآبار الفردية من الزجاج السفلي 384-بئر لوحه مع واحد جيدا لكل حاله ؛ تجنب الصفين الخارجيين من لوحه لمنع تاثيرات الحافة.
ملاحظه: فمن المفيد لإخفاء الآبار المحيطة بها باستخدام لاصق PCR لوحه إحباط (انظر المثال في الشكل 1د) وهذا يحفظ الآبار المجاورة للتجارب في المستقبل ويجعل من الأسهل لتحديد موقع الآبار المناسبة تحت المجهر تشريح. وبمجرد الاقتباس من الحل ، والحفاظ علي لوحه والحل المتبقي علي الجليد في جميع انحاء تشريح. - توليد الفم pipetsات أليفه لنقل الاجنه من الشريحة الاكتئاب (حيث يتم تشريح المخنثين البيض) إلى الآبار. سحب pipets الشعرية (25 μL الpipets معايره) علي لهب وكسر لتوليد نهاية مدببه غرامه (الشكل 1د). وهناك حاجه إلى ماصه pipet-x واحد لكل حاله لمنع التلوث المتبادل ؛ تجاهل ماصه pipet-x بعد الاستخدام.
- استخدام ملاقط غرامه لنقل ~ 10 البالغين البيض تحت نطاق تشريح في 150 μl من محلول الجليد tmhc الباردة المقتبسة علي شريحة الاكتئاب لكل حاله. باستخدام ملاقط ومشرط ، تشريح الديدان للإفراج عن الاجنه.
- قم بتحميل ماصه pipet-x الشعرية المسحوبة في ملحق الشفط المرفق مع الpipetsات أليفه ، و ماصه pipet-x الفم لنقل كل من 2 إلى 8-خليه مرحله الاجنه إلى بئر الفرد من لوحه أعدت (الشكل 1د). تجنب نقل أجنه المرحلة المتاخره وبقايا التشريح. فحص تحت نطاق تشريح وإذا المجاميع من الاجنه موجودة ، ماصه pipet-x الفم صعودا وهبوطا أو الاستفادة من كتل من الاجنه مع غيض ماصه pipet-x لتفريق.
ملاحظه: لمنع التلوث المتبادل ، ومعدات التشريح النظيفة واستخدام ماصه pipet-x الفم الطازجة في حين تتحرك بين الظروف. يخزن الطبق علي الثلج بين الأجزاء المتقطعة. - مره واحده وقد تم تشريح الديدان من جميع الظروف ووضع الاجنه في البئر المناسبة ، وتدور لوحه 384-بئر لمده 1 دقيقه في 600 x g لتسويه الاجنه.
- امسح الجزء السفلي من الطبق بمسحه من الايثانول المنقوع لأزاله اي بقايا ووضع الصفيحة علي مجهر كونبؤري مزود بحامل لوحه في بيئة تسيطر عليها درجه الحرارة.
ملاحظه: الخطوات التي تتبع التفاصيل هذا الأسلوب باستخدام اعداد المعمل; يرجى تعديل شروط الاقتناء لتلائم الاحتياجات والمعدات التجريبية. هنا ، مربع الماسح الضوئي المحورية مجهزه ميكرولنس-تعزيز المزدوج Nipkow الغزل القرص ، 512 x 512 الكاميرا المضادة لاتفاقيه مكافحه التصحر ، وعاليه الدقة السيارات XY المرحلة (القرار المعين 0.1 μm) والميكانيكية z-محور السيطرة (القرار المعين 0.1 μm) يستخدم. يتم الاحتفاظ بهذا النظام في غرفه 16 درجه مئوية ، والتي تحافظ علي درجه حرارة المجهر بين 21 و 23 درجه مئوية خلال التصوير بين عشيه وضحيها. - للتعرف علي الحقول التي تحتوي علي أجنه مناسبه ، قم باجراء فحص مسبق لكل بئر باستخدام هدف 10x 0.4 وبرنامج التصوير المناسب. ستحتوي الحقول الأكثر مثاليه علي أكثر من جنين في مرحله مبكرة في نفس المستوي البؤري مثل الاجنه الأخرى ، ومن الناحية المثالية سيكون لديك الحد الأدنى من الاتصال بين الاجنه المجاورة. وضع علامة علي مواقع المناطق المناسبة.
- لتحديد حقول التصوير ، قم بالتبديل إلى الهدف 60x واضبط المستوي البؤري عند زيارة كل نقطه لقسم الاجنه بشكل مناسب. 1 – 4 حقول لكل بئر يتم تصويرها ، لما مجموعه 50 حقلا عبر 14 بئرا ، ويمكن ان يحتوي كل حقل علي ما بين جنين واحد وخمسه أجنه. وبشكل عام ، يتم اختيار ما بين 4 إلى 15 أجنه من كل حاله للتصوير عالي الدقة.
ملاحظه: والمتغير الرئيسي في هذه الخطوة هو استخدام النفط الكافي ؛ وضع النفط علي الهدف ، وزيارة نقاط في كل بئر لنشر النفط حول سطح جميع الآبار ومن ثم تطبيق قطره اضافيه من النفط إلى الهدف قبل اختيار الحقول. - صوره الحقول المحددة باستخدام 60x 1.35 NA الهدف للحصول علي المقاطع 18 z في فواصل 2 μm كل 20 دقيقه ل 10 ح. ظروف التصوير باستخدام سلالات الجرثومية وطبقه الجراثيم والمراسلات هي كما يلي: برايت فيلد ، 90 ٪ السلطة ، 25 مللي ثانيه ، وزيادة 20 ٪ ؛ 488 nm ، 100% الطاقة ، 200 مللي ثانيه ، 60% كسب ؛ 568 نانومتر ، 45 ٪ الطاقة ، 150 مللي ، 60 ٪ كسب.
- بعد التصوير كامله ، وتقييم الفتك الجنينية من خلال أداء منخفضه التكبير (10x 0.4 NA الهدف) المسح الضوئي بشكل جيد كامل برايت فيلد ~ 20 – 24 ساعة بعد بدء التصوير بين عشيه وضحيها.
2. الفتك الجنيني التهديف
- باستخدام الحقول الممسوحة ضوئيا التي تم فحصها بعد 10 مرات ، يمكنك تقييم الفتك الجنيني وعيوب اليرقات من خلال عد الديدان الفقسه والاجنه غير المظللة لكل بئر.
- يسجل الاجنه غير المظللة كقاتله جنينيه. استبعاد الاجنه المقبوض عليها من واحد إلى أربعه خلايا من العد المميت ، لان الاجنه الصغيرة التي يتم تشريحها تفشل أحيانا في إكمال تكوين قشر البيض (إذا لم يكتمل الانقسام الثاني بعد) ويمكن ان تؤدي عيوب النفاذيه إلى مضاعفات الاسموزي خلال المرحلتين الأوليين الشعب.
- النقاط التي فقست جزئيا أو فقست تماما الديدان مع شكل الجسم أو العيوب السلوكية ، مثل دامبي أو مشلولة ، كما "اليرقة غير طبيعيه".
3-الاقتصاص الألى (الشكل 3ا)
ملاحظه: ويقع البرنامج في موقعين: (1) Zenodo المنازل نسخه سهله الاستخدام من البرنامج12 التي لا تتطلب اي خبره البرمجة. (2) جيثب يحتوي علي شفره المصدر لبرنامجنا embryoCropUI.py و screenCrop.py13، والتي تتطلب إتقان مع بيثون. ويمكن الاطلاع علي تعليمات مفصله لتحميل وتشغيل كلا الإصدارين من البرنامج أدناه.
- الاقتصاص الألى باستخدام الإصدار القابل للتنفيذ الخاص بالاجنه (الإصدار السهل للمستخدم)
- لاستخدام برنامج الاجنه ، قم أولا بتحميل البرنامج من Zenodo (https://zenodo.org/record/3235681#.XPAnn4hKg2w)12.
- قم بتنزيل إصدار تنسيق MacOS أو Windows الخاص بالبرنامج (لاحظ ان إصدار MacOS يتطلب MacOS X 10-11 أو اعلي).
- تحميل ملف التعليمات (GUI_Instructions_zenodo_repoV2) ، الذي يوفر تعليمات خطوه بخطوه للاختبار واستخدام برنامج الاجنه.
- قم بتنزيل test_files لاختبار إذا كان البرنامج يعمل بشكل صحيح علي النظام الأساسي (انظر التعليمات).
- مره واحده تحميلها ، بفك وانتقل إلى العثور علي القابلة للتنفيذ الجنينية (... \ الاجنهالجنينية) أو (... \الاجنهالجنينية) (.................. انقر نقرا مزدوجا لإطلاق (أو اختار ' فتح مع ' الطرفية) وتشغيل القابلة للتنفيذ الجنينية.
- القابل للتنفيذ GUI المحاصيل حقل 4D واحد من طريقه العرض في كل مره. في الزاوية العلوية اليسرى ، حدد الزر فتح لتحميل الحقل المحدد لاقتصاص (متعدد الtiff). في حاله اقتصاص سلسله tiff ، مع ابعاد متعددة (اي ، z ، الوقت ، القناة) ، قم بتحميل الصورة الاولي فقط في السلسلة ضمن المجلد (سلسله tiff واحده لكل مجلد).
- بمجرد تحميل الصور ، حدد المعلومات التالية: عدد الشرائح z ، (Z) ، عدد النقاط الزمنيه (T) ، عدد القناات (C) ، القناة التي تتوافق مع DIC أو الحقل الساطع (الأول = 1 ، الثاني = 2 ، الخ).
- حدد معالجه اضافيه لتشغيلها علي الصور. ويقدم البرنامج تصحيح الانجراف ، والطرح الخلفي ، وتصحيح التوهين.
- تحديد معلمات لطرح الخلفية وتصحيح التوهين لتوجيه جهود المعالجة في موجه واجهه المستخدم الرسوميه. للحصول علي الخلفية طرح ، تعريف أكبر حجم الميزة لتعكس حجم اشاره ذات مغزى; لا يجب اعتبار حجم هذه الميزة كخلفيه ويجب ان تكون قيمه رقم فردي. إدخال قيمه من 0-1 لتصحيح التوهين. تعكس قيمه تصحيح التوهين نسبه الكثافة الاصليه التي تبقي عند العمق الأبعد للكائن قيد التصوير.
ملاحظه: يجب تشغيل الطرح الخلفي وتصحيح التوهين معا. - حدد أمر مجموعه الصور (اي ، القناة-z-الوقت (czt) ، أو z-قناه-الوقت (zct)).
- تحديد ميكرون لكل بكسل للصور استنادا إلى الكاميرا المستخدمة.
ملاحظه: سيحدث اقتصاص الصورة الضعيف إذا لم يتم تعريف حجم البكسل بشكل صحيح. - حدد تشغيل في الزاوية اليسرى السفلية. سيتم إنشاء مجلد فرعي جديد يسمي "اقتصاص" في نفس مسار المجلد غير الاقتصاص; سيتم حفظ الإصدارات التي تم اقتصاصها في هذا الموقع. اعتمادا علي حجم الملف ، يجب إكمال الاقتصاص في غضون ثوان إلى دقائق.
- لاستخدام برنامج الاجنه ، قم أولا بتحميل البرنامج من Zenodo (https://zenodo.org/record/3235681#.XPAnn4hKg2w)12.
- الاقتصاص الألى باستخدام screenCrop.py (النسخة الدفعة بديلا لواجهه المستخدم الرسوميه المذكورة أعلاه.المستخدمين الدهاء بيثون فقط)10,13
- لاستخدام screenCrop.py ، إصدار برنامج بايثون لاقتصاص مجموعات البيانات الكبيرة بتنسيق دفعي ، استنساخ أو تحميل شفره المصدر من جيثب (github.com/renatkh/embryo_crop.git).
- قراءه الإرشادات لتكوين بيئة افتراضيه صحيحه واتبع نظام تسميه الملفات الموصوفة; كل منها مفصله في الملف التمهيدي في مستودع جيثب: https://github.com/renatkh/embryo_crop/blob/master/README.md.
- وبمجرد ان يتم إنشاء المتغيرات البيئية واصطلاحات التسمية بشكل صحيح ، افتح parameters.py و screenCrop.py في محرر الاختيار.
- لتعديل المعلمات القابلة للتعديل بدون لمس الشفرة المصدرية ، حرر ملف parameters.py .
ملاحظه: من الممكن أيضا تغيير المعلمات مباشره داخل راس screenCrop.py.- في حاله استخدام ملف التكوين parameters.py تغيير اعداد use_configure إلى True. إذا كنت تستخدم التحرير المباشر داخل screenCrop.py ، اترك الاعداد use_configure في False.
- حدد موقع المعلومات التالية داخل ملف parameters.py وقم باجراء تعديلات لتلائم معلمات التصوير المطلوبة وبنيه الملف:
- loadFolder (خط 9): تغيير إلى محرك الاقراص الذي يتم تخزين الملفات (علي سبيل المثال ، Z:/، D://، الخ)
- التاريخ (السطر 7): التغيير إلى المجلد الذي يحتوي علي ملفات لجلسة التصوير. يشار إلى هذا ب "اسم المجلد التجربة" في ملف تتبع CSV (انظر التعليمات).
- trackingFile (السطر 11): تغيير إلى المسار إلى ملف CSV الذي يتم تخزين معلومات التجربة.
- z (الخط 13): تعيين عدد الطائرات z.
- nT (line14): تعيين عدد النقاط الزمنيه.
- nWells (الخط 19): تعيين عدد الآبار المستخدمة.
- نقطه الزيارات (السطر 20): تعيين الحد الأقصى لعدد زيارات النقاط (لكل بئر).
- في السطر 10 العثور علي الموقع الذي يشغله حاليا ' CV1000/' وإدخال المجلد الخارجي المستخدم في مسار الملف. لتجنب المشاكل ، استخدم الاصطلاح التالي: ' XXXXXXX/'.
- في السطر 12 ، ادخل مسار ملف صالح لتخزين بيانات نسبه الارتفاع للبيانات التي تم اقتصاصها.
- في خطوط 15 و 16 و 17 و 18 إدخال صواب/False لمعرفه ما إذا كانت الصور تمر من خلال المعالجة التالية:
- إدخال صواب أو خطا لتصحيح الانحراف علي خط 15.
- الإدخال True أو False للحصول علي الخلفية طرح علي السطر 16. يجب تحديد حجم الميزة تجريبيا لسلالات علامة مختلفه واحجام بكسل. في التكوين هنا ، تم تعريف حجم الميزة كما 41 لسلاله جرثومه طبقه و 201 لسلاله Morphogenesis. ويجب ان يتم طرح المعلومات الاساسيه بالاقتران مع تصحيح التوهين.
- إدخال صواب أو خطا لتصحيح التوهين علي السطر 17.
- إدخال True أو False للدوران الخلفي الامامي علي السطر 18.
- وبمجرد اجراء جميع التغييرات ، يمكن ان يبدا الاقتصاص. للقيام بذلك ، قم بالتبديل إلى screenCrop.py وحدد رمز التشغيل في شريط الاداات ، في القائمة المنسدلة حدد تشغيل ك > بيثون تشغيل.
- كما يمكن ان يستغرق الاقتصاص عده ساعات لإكمال لمجموعه بيانات كبيره (50 نقطه الزيارات 18 z الخطوات ، 3 قنوات ، 31 نقطه زمنيه) ، تتبع تقدم الاقتصاص في اطار وحده التحكم. بمجرد اكتمال عمليه الاقتصاص ، ستظهر نافذه صغيره معاينات للصور التي تم اقتصاصها قبل الحفظ. لكل صوره هناك 3 خيارات:
- حفظ: اضغط علي شريط المسافة لحفظ الصورة إذا تم اقتصاص الصورة بشكل صحيح مع عدم قطع المجالات ذات الاهتمام.
- X: اضغط X إذا كانت الصورة تظهر ان مناطق الفائدة مقطوعة ؛ سيتم حفظ الصورة بعلامة X امام الاسم لفصلها عن الصور الأخرى.
-
حذف: اضغط D لحذف الصورة التي تم اقتصاصها إذا لم يتم اقتصاص الصورة بشكل صحيح أو إذا كان الجنين غير مرض.
ملاحظه: سيتم حفظ الصور إلى مجلد فرعي باسم "اقتصاص" في "مجلد التحميل" (المعرفة في السطر 9 من البرنامج).
4-التصور (الشكل 4)
ملاحظه: OpenandCombine_embsV210،12 هو ماكرو imagej من شانها ان بناء سهله لعرض ملف tiff من جميع الصور لسلاله محدده وشرط. مطلوب تركيب فيجي/imagej14،15 . يعمل هذا الماكرو وفقا لهيكل الملف الخاص بنا; وسوف تحتاج إلى تعديل للعمل مع هياكل الملفات الأخرى. يمكن العثور علي دليل للهيكل الصحيح للملفات ووصف مفصل للاعتبارات الهامه في نهاية الملف GUI_Instructions_zenodo_repoV2 علي مستودع zenodo. يرجى قراءه من خلال هذه التعليمات تماما قبل التصوير لاسم بشكل صحيح وهيكل الملفات إلى واجهه أفضل مع هذا الماكرو. للرجوع اليها ، هيكل موقع الملف لدينا يبدو مثل هذا:
المعرف الفريد _W # #F # _T # #_Z # #_C # .tif # \Taterpbb\tett\strin\sdd& #
اي Z:\cropped\embd0001\glorb1\embd0001_m1_20140327t135219_w02f1_t01_zcyp1.ec
- تحميل OpenandCombine_embsV2 و GUI_Instructions_zenodo_repoV2 من zenodo (https://zenodo.org/record/3235681#.XPAnn4hKg2w).
- اعداد المعلومات التالية:
-الموقع حيث يتم تخزين مجلدات الصورة (بعد الاقتصاص).
-اسم (أسماء) مجلد الصورة للشرط (الشروط) المحددة التي ستتم معالجتها (اي EMBD0002). ويشار إلى هذا باسم "الهدف" في المثال أعلاه
-معرف فريد رقمي مكون من 15 رقما خاصا بتجربة ليليه معينه — هذا المعرف هو اسم مجلد الحصول علي البيانات (اي ، 20140402T140154) والمعرف الفريد مضمن في اسم ملف tiff الفردي (EMBD0002_Emb1_ 20140402T140154_W06F2_T01_Z01_C1) لكل جنين في ذلك اليوم. يستخدم الماكرو هذا المعرف للتحقق من الاجنه المكتسبة في نفس التاريخ ويمكن تجميع الشروط المتكررة ، مع تواريخ منفصلة ، في ملفات ImageJ منفصلة. - افتح ImageJ ، واسحب وأسقط ملف الماكرو ، OpenandCombine_embsV2، إلى الشريط imagej ، أو افتح الماكرو بشكل مباشر.
-
بمجرد فتح الماكرو ، حدد موقع الأسطر 3 و 4. إدخال المعلومات التي تم جمعها في (القسم 4.2) وفقا للخطوات التالية:
- في السطر الثالث (RNAL) ، ادخل اسم الهدف للصور التي ستتم معالجتها. إدخال كل هدف في البنية التالية نيوصفيف ("XXXXXXXX/"); تتضمن عروض الأسعار. لتشغيل شروط متعددة في نفس الوقت ، افصل بفاصله واحتفظ بكافة الأسماء المستهدفة ضمن الأقواس (اي ، Newarray ("EMBD0000/" ، "EMBD0001/" ، "EMBD0002/").
- في السطر الرابع (التاريخ) ، ادخل المعرف الفريد الرقمي المكون من 15 رقما في عروض الأسعار ، علي سبيل المثال Newarray ("20140402t140154").
- اضغط تشغيل في الجزء السفلي الأيسر من اطار الماكرو. ستظهر نافذه ، والتي ستقوم بتشغيل موجه للانتقال إلى المجلد الخارجي الذي يحتوي علي مجلدات الصور التي تم اقتصاصها (المحددة في 4.4.1).
-
مره واحده محدده ، سوف تظهر نافذه أخرى ، والتي سوف تسمح مواصفات المعلمات التصوير.
- ادخل عدد القناات ، وعدد شرائح Z ، وحجم الخط للنص المستخدم في وضع العلامات علي الصور المترجمة ، واللون لكل قناه.
- تحقق علي/قباله السيارات المتناقضة في جميع القناات.
- بمجرد تحديد كافة المعلمات ، انقر فوق "موافق " في الجزء السفلي من الإطار. سيبدا الملف المركب في التجميع; وهذا سوف يستغرق عده دقائق ، لكل حاله ، لإكمال.
- بمجرد الانتهاء ، قم بمراجعه الملفات التي تم تركها مفتوحة إذا رغبت في ذلك. يمكن ان تكون مغلقه بدون حفظ ، كما الماكرو بالفعل حفظ الملفات إلى مجلد تم إنشاؤه حديثا يسمي بالطريقة التالية: اسم المجلد الخارجي (المحدد في موجه القسم 4.5) + "-فيجي-معالجه-الإخراج" (اي ، Z:\ cropped-fiji-processed-output\EMBD0002_GLS_20140402T140154.tif).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
تحديا كبيرا في توصيف تاثير الاضطرابات الجزيئية علي التنمية الجنينية c. هو ان يستغرق حوالي 10 ساعة للجنين للتقدم من الانقسام الأول إلى نهاية استطاله في 20 °16. والطريقة شبه العالية الانتاجيه التي يمكن فيها لمجموعات كبيره من الاجنه ان تكون في نفس الوقت مفيده للاحداث علي هذا النطاق الزمني لأنها تسمح بتصوير حالات متعددة بالتوازي مع حجم الفرقة الكافية لكل شرط لتمكين التحليل الكمي (الشكل 1ا).
طريقه تصوير شبه عاليه الانتاجيه وسلالات متعددة العلامات
وتستخدم طريقه التصوير شبه العالية الانتاجيه الموصوفة هنا (المبينة في الشكل 1ب) لوحه سفليه من الزجاج ال384 بشكل جيد. ويسمح الشكل المتعدد الآبار بوضع ما يصل إلى 14 شرطا بالتوازي ويحد الحجم الصغير للحرار من منطقه البحث ، مما يبسط تحديد الحقول التي تحتوي علي أجنه للتصوير بدقه عاليه. هنا ، تم استخدام مربع الماسح الضوئي المحوري ، ومجهزه ميكرولنس-تعزيز المزدوج Nipkow الغزل القرص ، 512 x 512 الكاميرا المضادة لاتفاقيه مكافحه التصحر ، وعاليه الدقة السيارات XY المرحلة (القرار المعين 0.1 μm) والميكانيكية z-محور السيطرة (القرار المعين 0.1 μm). ومع ذلك ، يمكن تكييف البروتوكول لأي المجهر البؤري مع قدرات نقطه الزيارة الدقة ومحول المرحلة التي يمكن ان تستوعب لوحه متعددة الآبار. ويتمثل أحد التحديات الكبيرة في تطوير هذه الطريقة في استنباط وسيله لتوليد طبق من الاجنه في نفس المرحلة التنموية بحيث يمكن الحصول علي التنمية بأكملها لجميع الاجنه في كل مجال. هذا هو التحدي لان الاجنه التي وضعت علي لوحه التصوير أولا سوف تستمر في التطور بينما يتم تشريح عينات في وقت لاحق ، مما ادي إلى الانحدار من التدريج عبر الآبار. للالتفاف علي هذه المسالة ، يتم اختيار الاجنه في مرحله مبكرة (2-8 مرحله الخلية) والحفاظ علي وسائل الاعلام تشريح ولوحه التصوير علي الجليد. هذا الأكشاك الاجنه لأجنه تشريح حتى تم التهاوي جميع الظروف دون التاثير بشكل كبير علي القدرة الجنينية10. للحد من الوقت الذي الاجنه الجلوس علي الجليد إلى 1 ساعة ، اثنين من الباحثين أداء التفكيك في وقت واحد ، والذي يسمح لإنشاء 14 ظروف مختلفه في حوالي 50 دقيقه. بعد تشريح ، ونسج لوحه في 600 x g لمده 1 دقيقه إلى الرواسب الاجنه والآبار يتم فحصها مسبقا في التكبير منخفضه لتحديد الحقول مع مجموعات من الاجنه مناسبه للتصوير عاليه التكبير ؛ يتم وضع علامة مواقع زيارة نقطه. يتم تصوير الاجنه في غرفه التي تسيطر عليها درجه الحرارة بين عشيه وضحيها باستخدام 60x الغمر النفط 1.35 NA عدسه. يتم تكوين العينات في 4 جيدا من 4 جيدا المنطقة بحيث المساحة السطحية للوحه التي يتم استخدامها في تجربه قابله للمقارنة إلى 22 × 22 ملم2 coverslip القياسية ، والذي يسمح لاستخدام هدف النفط 60x. الانتشار الموحد للنفط عبر هذه المنطقة قبل بدء التصوير أمر بالغ الاهميه للنجاح في اكتساب الصور علي المدى الطويل. يتم وضع الاجنه النامية في محلول يحتوي علي مخدر. وهذا يضمن انه عندما الاجنه القديمة داخل البئر يفقس ، حركتهم لا يعطل موقف الاجنه الأصغر سنا المجاورة التي يجري الشيخوخة. نظرا للطبيعة المنيعة لقشره البيض ، لا يؤثر التخدير علي الحركة قبل الفقس. وفي ظل هذه الظروف ، يتم جمع بيانات الفاصل الزمني ثلاثي الابعاد في 3 قنوات لما مجموعه 80-100 من الاجنه في تجربه واحده بين عشيه وضحيها (نوقشت أكثر أدناه).
جيم- النمو الجنيني البدائي يحدث علي مرحلتين. أولا ، 10 جولات من انقسام الخلايا إلى جانب مواصفات مصير الخلية توليد الطبقات الجرثومية الثلاث (الأديم الإحيائي ، الأديم الوسطي ، والأديم الباطن) علي مدي 6 ساعة الفترة17. في التالي 7 [ه], [مورفوجيني] حادثات محرك التشكيل من انسجه متمايزة8,16. للتقاط هذين الجانبين من التنمية ، قمنا ببناء زوج من سلالات مخصصه ، طبقه الجرثومية وسلالات Morphogenesis10 (الشكل 2ا)، واستخدمت بروتوكول شبه عاليه الانتاجيه لصوره الاجنه من كلا السلالتين. وتعبر سلاله الطبقة الجرثومية عن البروتينات الفلورية المرمزة عبر الجينات التي تحتفل بالنوى في الأديم المتوسط والأديم الوسطي والأديم الباطن باللون الأحمر والأصفر والأخضر. هذه السلالة تحتوي علي ثلاثه مراسلين الجينات: (1) عبر الجينات التعبير عن فا-4:: gfp ان علامات نوى في الأمعاء والبلعوم (الأخضر اندوديرم)10،18،19، (2) عبر الجينات التعبير عن ميكرز-histone الانصهار في البشرة وفي ~ 1/3 من الخلايا العصبية (الأحمر ectoderm; الشكل 2ا) ، و (3) الجينات التي تعبر في وقت واحد عن mcherry و gfp-الموسومة histones في العضلات جدار الجسم (الأصفر الأديم المتوسط). سلاله Morphogenesis لديه اثنين من الجينات التي تعبر عن: (1) علامة تقاطع الظهاريه الخضراء (DLG-1:: GFP) في البشرة ، و (2) علامة غشاء البلازما mCherry-الموسومة ، في ~ 1/3 من الخلايا العصبية (Pالمروج 1 ؛ الشكل 2(ا). لتعزيز فعاليه RNAi ، تم تصميم كلا السلالتين أيضا لاحتواء زوج من طفرات التوعية (nre-1 (hd20) lin-15 b (hd126)20. وقد شيدت هذه بهدف أداء الشاشة المستندة إلى RNAi علي نطاق واسع من الجينات ~ 2,000 المطلوبة للتنمية الجنينية. ومع ذلك ، فان هذا الزوج من السلالات سوف تشكل أيضا منصة موحده مفيده علي نطاق واسع لتقييم العيوب التنموية في المسوخ ، وتحليلات أكثر تفصيلا لادوار مختلف البروتينات في التنمية.
لجمع البيانات في هذا الشكل شبه عاليه الانتاجيه ، مع هذه السلالات ، والأخضر والأحمر ومشرق-الميدان سلسله z (18 × 2 μm2 فواصل) يتم جمعها ، كل ~ 20 دقيقه ، لمده 10 ساعة في 16 درجه مئوية درجه حرارة الغرفة التي تسيطر عليها ؛ هذا يحافظ المجهر بين 21-23 [ك] اثناء الشوط. الفاصل الزمني 20 دقيقه يسمح لنا لصوره 50 حقول الاجنه (زيارة نقطه) لكل تجربه. يمكن للمستخدمين خياط المقتنيات إلى فترات أقصر مع عدد اقل من الزيارات نقطه ، أو فترات أطول مع المزيد من الزيارات نقطه لتناسب أهدافهم التجريبية علي أفضل وجه. النسبة لهذه السلالات ، فان النقاط الزمنيه التنموية المبكرة لا يتم تصويرها لان الانسجه المحددة للصحفيين الذين يقودون تعبير العلامة لا تبدا في الاعراب عنها حتى الوصول إلى الذواقة من المنتصف إلى المتاخر. خلال هذه المرحلة المبكرة ، تم فحص الآبار بمعدل تكبير منخفض (10x) وتم اختيار الحقول لتصوير التكبير العالي. ويوصي باختيار الحقول التي تحتوي علي أكثر من جنين في مرحله مبكرة ، ولكن تجنب الحقول التي تتداخل فيها الاجنه جزئيا ، أو المزدحمة بشكل مفرط ، أو التي توجد في الحافة المتطرفة لبئر. بعد التصوير الليلي 60x ، يتم اجراء فحص جيد للتكبير المنخفض (10x) لتحديد ما إذا كانت الاجنه مع المظهر الطبيعي (WT) ، أو يفقس مع تشوات مرئية (اليرقات غير طبيعيه) ، أو تكون مميته لكل حاله تقييمها ( الشكل 1(ب). وهذه الخطوة هي بمثابه بديل سهل لوضع لوحات بالتوازي لتقييم الفتك عبر عدد أكبر من السكان ؛ البئر كله 10x المسح الضوئي يوفر بيانات الفتك الجنينية علي 50-80 الاجنه لكل حاله. واستخدام هذا التدبير لمقارنه بيانات الفتك الجنينية السكانية للضوابط بين الأشواط هو عنصر تحكم مفيد يضمن الاتساق فيما يتعلق بصحة السلالات والظروف البيئية وخطوات المعالجة. عند التصوير في تركيبه ، فان سلالات المراسلين المخصصة توفر القراءة الاعلاميه لمعظم الاحداث التنموية الرئيسية ، بما في ذلك مواصفات قدر الخلية ، والتشابك الظهري ، والضميمه البشرة ، والاستطالة ، والتكوين العصبي (ممثل يتم عرض صور التحكم في الشكل 2ب، انظر وانغ وآخرون10).
معالجه البيانات: زراعه الاجنه اليه وتوجيهها
مع بروتوكول التصوير لدينا ، يحتوي كل حقل تصوير عالي الدقة علي ما بين 1 و 5 أجنه. هذه الاجنه هي عشوائية المنحى وغالبا ما توضع علي الفور المتاخمة لبعضها البعض. وتعاني البيانات المجمعة باستخدام تقنيات تركيب الاجنه التقليدية من نفس التحديات. ولاعداد البيانات المتعلقة بالتصور والتحليل اللاحقين ، يلزم التلاعب العملي الكبير لاقتصاص وتوجيه متواليات الاجنه ، وكذلك لتجهيزها مسبقا لطرح الخلفية ، وتصحيح الانحراف ، والتعويض عن توهين الاشاره مع العمق. ولتبسيط هذه العملية ، تم بناء برنامج زراعه الاجنه المخصصة الذي يعزل ويوجه كل جنين من الحقل الأوسع (الشكل 1ج ، الشكل 3). وقد تم حزم هذا البرنامج باعتباره سهل الاستعمال ، وهو برنامج قائم بذاته مع واجهه المستخدم الرسوميه (GUI ، متوافق مع البيانات من معظم منصات التصوير) التي يمكن ان تاخذ في تسلسل الفاصل الزمني 3D من حقل من الاجنه ، ومعالجته في سلسله tiff الفردية بالنسبة لكل جنين في الميدان (الشكل 3ب ، متاح في الhttps://zenodo.org/record/3235681#.XPAnn4hKg2w)10،12. شفره المصدر بيثون لواجهه المستخدم الرسوميه (embryoCropUI.py) ، وإصدار دفعه من هذا البرنامج (screenCrop.py) متاحه أيضا للمستخدمين ذوي الخبرة بيثون علي جيثب (https://github.com/renatkh/embryo_crop.git)10،13. الوظيفة الاساسيه لهذا البرنامج هي تحديد موقع الجنين واقتصاصه وتوجيهه علي طول المحور الامامي الخلفي. وفي الوقت نفسه ، يمكن اجراء عمليه طرح الخلفية وتصحيح التوهين وتصحيح الانحراف علي مجموعه البيانات باستخدام إعدادات اختياريه قابله للضبط.
وباختصار ، يكتشف برنامج الاقتصاص الألى بشكل متكرر الاجنه الفردية في قناع ثنائي تم الحصول عليه من صور الحقول الساطعة والمحاصيل بالتتابع الاجنه من جميع القناات ويوجه الصور علي طول المحور الامامي الخلفي (الشكل 3 B ، وصفت لأول مره في وانغ وآخرون10). قبل الاقتصاص ، يصحح البرنامج للانجراف ، والخلفيات الفرعية وينفذ تصحيح التوهين العمق في كل قناه مضان (اختياري). للحصول علي قناع ثنائي ، والبرنامج ينطبق الكشف عن الحافة Canny21 إلى الصور الميدانية الساطعة ، ويؤدي الإسقاط كثافة الحد الأقصى من الطائرات المركزية الثلاثة ويملا في ثقوب صغيره. تكتشف الخوارزميه الاجنه الفردية من خلال تركيب شكل بيضاوي كاسيني علي مقطع من مخطط القناع الثنائي (انظر الشكل 3B, 3c). بعد محاذاة البيضاوي علي طول محورها الرئيسي ، يقيس البرنامج كثافة الفلورية الحمراء في كل نصف الجنين معزولة ويدور الجنين بحيث يتم توجيه كثافة حمراء نحو اليسار ، مما يضع الجنين الامامي علي اليسار لكلا من سلالات المراسلات المستخدمة في هذا العمل (الشكل 3د). وكشف تجريب هذا البرنامج ان معظم الاجنه تم اقتصاصها بكفاءة كما كان متوقعا. ولا تؤدي مشاكل التصوير البسيطة ، مثل انجراف الاجنه ، أو فقدان المستوي البؤري المؤقت (بسبب فقاعات في الزيت) ، أو الحقول المزدحمة من الاجنه إلى عرقله الزراعة الناجحة عاده. ومع ذلك ، بالنسبة للحقول التي كانت فيها كتل كبيره من الاجنه (تتداخل إلى حد ما في z) ، والاجنه التي كانت مائله إلى حد كبير داخل الطائرة التصوير (في Z) ، وفقدان المستوي البؤري علي المدى الطويل ، أو الاجنه التي قطعت جزئيا ، لم يكن دائما المحاصيل تحقيق. ويمكن التحايل علي هذه المسائل بسهوله عن طريق اختيار أفضل للميدان اثناء مرحله الحصول علي البيانات. وعموما ، فان المعالجة المسبقة للبيانات التي تجمع مع هذه الطريقة شبه العالية الانتاجيه أو باستخدام أساليب التركيب التقليدية هي خطوه اولي مفيده لتصور وتحليل مجموعات البيانات الجنينية.
التحقق من صحة جمع الصور وطرق معالجه البيانات: تصور التنمية الجنينية بعد ضرب من 40 الجينات الموصوفة سابقا
للتحقق من صحة هذه الطريقة جمع الصور شبه عاليه الانتاجيه ونظام الاقتصاص المخصصة ، تم تنفيذ شاشه RNAi صغيره في سلالات مخصصه ، موجهه ضد 40 الجينات مع وظائف وصفت سابقا في مواصفات مصير الخلية ونشاه ( وصفها وانغ ، اوتشوا ، خلوللين وزملاءه10،11). للقيام بذلك ، تم توليد dsRNA ضد كل هدف ، وحقن L4 الحيوانية من كل سلاله ، انتظر 20-24 h ، ومن ثم تشريح والاجنه الذين هم باستخدام البروتوكول الموصوفة أعلاه (لكامل مجموعه البيانات10،11). يتطلب تحقيق الأنماط الظاهرية التنموية من قبل RNAi تثبيط كل من التعبير الجيني للأمهات والجينات الزغائيه. ويمكن التعبير عن الجينات التنموية ، مع المنتجات البروتينية الناتجة التي يتم تحميلها في الاجنه ، أو التي يتم التعبير عنها بشكل أمومي في الجنين ، أو ، في كثير من الحالات ، علي حد سواء10،22،23. الوقت بين الحقن وتصوير الاجنه هو المتغير الحاسم لاستهداف السكان الأموميين والمعبرين عنه بشكل فعال. يحدد التوقيت كلا من كميه dsRNA حقن التي يتم تحميلها في الجنين لمنع التعبير zygotic24 ومدي نضوب البروتين الأمهات. بعد حقن dsRNA ، والأمهات mRNA المقابلة لجين المستهدفة يحصل المتدهورة ولا يتعافى أكثر في الفترة الزمنيه ذات الصلة. يتطلب نضوب البروتين الموجود مسبقا إنتاج الاجنه ، الذي يحقن البروتين الأمومي من الانسجه الجرثومية عن طريق تحميله إلى تشكيل الاجنه. 20-24 ساعة في 20 درجه مئوية هي أقصر فتره حضانة تسمح بالاستنزاف المستمر للأمهات ؛ نضوب الام يحصل علي نحو أفضل في وقت لاحق النقاط (اي ، 36-42 h بعد الحقن). كميه الحقن dsRNA التي يتم تحميلها في الجنين يملي مدي فعاليه الوقاية من التعبير الجيني zygotic سيكون. كميه الذري التي تم تحميلها الحمض الريبي النيبالي حوالي 5-10 h بعد الحقن ، عندما يتم تخصيب الاجنه مع المواد المحقونة أولا ، وانخفاض بعد ذلك. في تجربتنا ، 24 ساعة بعد الحقن هو الوقت الأمثل ، حيث استنزاف البروتين الأمهات وتثبيط التعبير الجينات zygotic فعاله علي حد سواء. تحليل الأنماط الظاهرية في سلالات المراسل المخصصة المستخدمة في هذا العمل ، عبر مجموعه من الجينات اختبار 40 ، وأظهرت ان البروتوكول المشترك لدينا أسفرت عن المميزة ، والتي يمكن استنساخها للغاية الأنماط الظاهرية عبر طيف واسع من الجينات المشاركة في مصير الخلية مواصفات ونشاه المستنقعات (انظر وانغ وآخرون10) ؛ مجموعه البيانات الكاملة متوفرة11). وكمثال علي هذه البيانات ، تظهر في الشكل 4اصور ثابته لأربعه أجنه مختلفه للسيطرة ، و ( rnai) ، و pal-1 (rnai) ، و mex-3 (rnai) في سلاله مراسل الطبقة الجرثومية. لمزيد من المناقشة الشاملة حول الأنماط الظاهرية التي لوحظت في شاشه RNAi 40-جين ، انظر وانغ وآخرون.10
ماكرو ImageJ: التجميع والمرئيات لكافة البيانات الخاصة بحاله معينه
يمكن ان يكون التصور لاعداد كبيره من الاجنه من مداخن tiff الفردية مملة وتستغرق وقتا طويلا للعمل من خلال. من جهدنا الاولي ، تم عزل > 400 من الاجنه الفردية باستخدام برنامج الاقتصاص الألى المخصص الموصوف أعلاه. لتسريع تحليل التمريرة الاولي ، قمنا ببناء ماكرو ImageJ ، الذي يقوم بإنشاء صفيف من جميع الاجنه التي تم تصويرها لحاله RNAi معينه في خلفيه سلاله معينه (الشكل 4ب). بالنسبة لكل جنين في الصفيف ، يتم عرض صوره الحقل الساطع وصوره إسقاط الشدة القصوى جنبا إلى جنب ، لكل نقطه زمنيه ، لإنشاء ملف فيلم مركب. بينما تمت كتابه هذا الماكرو للعمل مع بنيه الملف الخاصة بنا ، يمكن تحريره ليلائم بنيه ملف المستخدم. للحصول علي أفضل النتائج ، ومع ذلك ، يجب علي المستخدمين اتباع اصطلاحات بنيه التسمية والملف المنصوص عليها في البروتوكول (راجع ملفات Zenodo أو جيثب التمهيدي للحصول علي مزيد من التفاصيل لاصطلاحات تسميه تطبيق بيثون و ImageJ). لعرض كافة البيانات المعالجة ImageJ والحصول علي تحليل أكثر تعمقا من الأنماط الظاهرية التي لوحظت لمجموعه اختبار 40-الجينات ، يرجى الاطلاع علي البيانات المودعة في قاعده البيانات Dryad10،11. ويمكن هذا الشكل المرئي من ImageJ من التقييم السريع للنمط الظاهري العام واختراقه ، ويجعل من السهل الإبلاغ عن مشكلات جوده البيانات ، مثل وجود الحطام أو فقدان المستوي البؤري. وبشكل عام ، فان الجمع بين طريقه الحصول علي البيانات شبه الانتاجيه ، وبرنامج الاقتصاص ، وأداه التصور ImageJ ، بالاضافه إلى سلالات المراسلات المخصصة ، تسهل إلى حد كبير جهود النطاق الأكبر لدراسة التطور الجنيني.
الشكل 1 نظره عامه علي طريقه التصوير عاليه المحتوي ، واجراء معالجه البيانات ، والاداات الاساسيه. (ا) مقارنه بين خصائص الطريقة المعيارية المستندة إلى الوسادة لتركيب أجنه من طراز c. ايليجنيس إلى نهج التصوير المتعدد المستويات العالي الانتاجيه الموصوف هنا. (ب) نظره عامه علي الطريقة شبه العالية الانتاجيه لرصد النمو الجنيني. راجع النص للحصول علي التفاصيل. (ج) نظره عامه علي أدوات معالجه البيانات والمرئيات ، التي يمكن استخدامها في البيانات التي يتم الحصول عليها باستخدام الاجراء المتصاعد التقليدي القائم علي الوسادة أو الطريقة شبه العالية الانتاجيه القائمة علي اللوحات المتعددة والموصوفة هنا. ويمكن معالجه سلسله واحده من الفواصل الزمنيه للجنين لمده 3 قنوات من حقل واحد (يسار) أو عده قنوات متعددة ، وحقول رباعيه الابعاد لبيانات الاجنه (علي اليمين) باستخدام برنامج الاقتصاص المخصص ، وهو متوافق مع البيانات الملتقطة علي معظم منصات التصوير. واجهه المستخدم الرسوميه (GUI) الإصدار من البرنامج هو المستخدم وديه ولا تتطلب اي خبره البرمجة. يتطلب تطبيق screenCrop.py الخبرة بيثون ، ولكنه قد أضاف قدرات-وهي انه يمكن ان المحاصيل في شكل دفعه. يتم اقتصاص الإخراج من هذه الخطوة باحكام ، مكدسات الجنين الموجهة الخلفية الاماميه. لتصور كافة البيانات من حاله واحده ، تم إنشاء ماكرو ImageJ الذي يقوم بتجميع مكدسات tiff التي تم اقتصاصها وتدويرها لإظهار صوره الحقل الساطع والإسقاط الأقصى لكثافة كل جنين في كل نقطه زمنيه. (د) يظهر الفريق الاداات الاساسيه اللازمة لتشريح واعداد شكل التصوير شبه العالي الانتاجيه. وقد استنسخ بعض المكونات الشخصية باذن من وانغ وآخرون10. يرجى النقر هنا لعرض نسخه أكبر من هذا الرقم.
الشكل 2 السلالات المخصصة التي تم إنشاؤها للتصوير عاليه المحتوي من الاجنه c. اليجس . (ا) توضح المخططات الجينات المستخدمة لبناء سلالات الطبقة الجرثومية (العلوية) وسلالات الموفوجينيسيس (السفلي). (ب) تظهر لوحات الإسقاط الشديدة الكثافة الدورة الزمنيه التطويرية في السلالات الموفوجينيسيس (العلوية) وسلالات الطبقة الجرثومية (السفلي). يظهر المنظر البطني ، كما هو موضح في المخططات (يسار). الوقت هو نسبه إلى مرحله فاصله (t = 0) ، والتي يمكن التعرف عليها بسهوله في كلا السلالتين. شريط مقياس = 10 μm. الشكل مستنسخ باذن من وانغ وآخرون10. يرجى النقر هنا لعرض نسخه أكبر من هذا الرقم.
الشكل 3 يعزل برنامج الاقتصاص المخصص ويوجه الاجنه الفردية من حقول التصوير. (ا) يوضح التخطيط ملامح برنامج زراعه الاجنه المخصصة ويسلط الضوء علي خيارين للوصول إلى هذا البرنامج: واجهه GUI سهله الاستخدام ، والتي لا تتطلب خبره في البرمجة وتتوفر علي zenodo (يسار) نسخه الاقتصاص دفعه من البرنامج ، والذي يتطلب تجربه بيثون وهو متاح علي جيثب (يمين). (ب) يلخص الرسم خوارزميه الاقتصاص المؤتمتة — يتم إنشاء قناع ثنائي من صور الحقول الساطعة 8 بت ويتم الكشف عن الاجنه الفردية واقتصاصها وتوجيهها علي طول المحور الامامي الخلفي. شريط مقياس هو 10 μm. (ج) تفاصيل المخططات الاجراء المستخدم للكشف المتكرر الاجنه في قناع ثنائي. (د) التخطيطي يوضح الطريقة المستخدمة لتوجيه الاجنه علي طول المحور الامامي الخلفي. واستنسخت الافرقه باء-دال باذن من وانغ وآخرون10. يرجى النقر هنا لعرض نسخه أكبر من هذا الرقم.
الشكل 4 يتيح ماكرو ImageJ المخصص تصور بيانات فحص RNAi عن طريق إنشاء ملفات مركبه لكل شرط. (ا) الاجنه لثلاثه أمثله علي الشروط من مجموعه اختبار الجينات 40 (انظر وانغ وآخرون10،11 للحصول علي بيانات كامله) يتم عرض (اليمين) التي تسلط الضوء علي الأنماط الظاهرية المميزة التي يتم الحصول عليها لكل حاله واستنساخ الأنماط الظاهرية داخل كل حاله. وتم تكييف الفريق باذن من وانغ وآخرون10. (ب) الفريق يوضح كيف المخصصة imagej الماكرو (OpenandCombine_embsV2) الاجنه من شرط rnai معينه في ملف imagej المركب الذي صفائف المجال الساطع والحد الأقصى لتوقعات الكثافة لكل جنين في كل نقطه زمنيه. بينما يتم تمييز مثال واحد فقط ، يمكن تجميع هذا الماكرو البيانات للعديد من الشروط RNAi في نفس الوقت. يتوفر ماكرو ImageJ علي Zenodo12. شريط مقياس = 10 μm. الرجاء النقر هنا لعرض نسخه أكبر من هذا الرقم.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
يصف هذا العمل مجموعه من الاداات والأساليب التي تم تطويرها لتمكين الجهود علي نطاق أوسع لتوصيف وظيفة الجينات في التنمية الجنينية في c. اليجينات. طريقتنا شبه عاليه الانتاجيه تسمح بالتصوير بالفاصل الزمني ثلاثي الابعاد للتطوير الجنيني بدقه 20 دقيقه لأجنه 80 – 100 في تجربه واحده. في حين ان هذا البروتوكول يمكن تكييفها للاستخدام مع اي سلاله علامة المرجوة (ق) ، وهذا العمل يوضح إمكانات الأسلوب باستخدام اثنين من سلالات مخصصه وضعت لرصد الاحداث اثناء الاجنه: (1) سلاله الجرثومة الجرثومية الصحفي ، والتي الانسجه المحددة المروجين محرك التعبير عن histones الفلورسنت للاحتفال الأديم الباطن ، والأديم المتوسط ونوى أديم ، و (2) سلاله مراسل المورمون ، والذي يستخدم المروجين البشرة والخلايا العصبية لدفع التعبير عن علامات الفلورسنت في تقاطعات الخلية غشاء البلازما. من خلال تصوير السلالتين ، يمكن القبض علي عواقب الاضطرابات الجزيئية علي مواصفات مصير الخلية والاحداث المرفوجينيه مع التفاصيل الرائعة. ولمواجهه التحديات التي تطرحها كميه البيانات المتولدة عن هذه الطريقة ، استحدثت أدوات مخصصه لغرض تبسيط معالجه البيانات والتصور المرئي. الاداه الاولي المحاصيل الاجنه الفردية من حقل من الاجنه في تسلسل الفاصل الزمني 3D في حين تناوب أيضا الاجنه إلى الاتجاه الامامي الخلفي القياسية وأداء الطرح الخلفية ، وتصحيح الانحراف ، وتصحيح التوهين. تم حزم هذا البرنامج كواجهة مستخدم سهله الاستخدام (https://zenodo.org/record/3235681#.XPAnn4hKg2w) ويتم توفير التعليمات البرمجية المصدر وإصدار التجزئة أكثر تقدما من برنامج للمستخدمين الدهاء بيثون (github.com/renatkh/embryo_crop.git)10,12,13. وأخيرا ، لتصور هذه البيانات المعالجة في تنسيق ذي معني ، تم تصميم ماكرو ImageJ; وهذا يسمح للمستخدم لتصور جميع الاجنه من حاله RNAi معينه في فيلم متعدد ألواح ، والذي يظهر في المجال الساطع والإسقاط شده اقصي لكل جنين في كل نقطه زمنيه. معا ، والسلالات ، والبروتوكول ، وأداات معالجه البيانات ، وبذل الجهود لدراسة الاجنه c. ايلينجس في أوسع نطاق المسعى أكثر جدوى.
وفي حين ان طريقه الاقتناء شبه المرتفعة الموصوفة هنا واضحة التنفيذ علي العموم ، فانها تتطلب الاهتمام ببعض التفاصيل الهامه التي ترد مناقشتها أدناه. أولا ، يجب ان يكون المستخدمين الوصول إلى المجهر البؤري مع الدقة نقطه الزيارة القدرة التي يمكن تجهيزها مع حامل لوحه متعددة الآبار. الاعتبار الأكثر اهميه لهذا البروتوكول هو ان يتم الاحتفاظ المجهر في غرفه التي تسيطر عليها درجه الحرارة. في حين ان العديد من المجاهر لديها القدرة علي الحرارة ، ومعظم لا يمكن ان تبرد بشكل موثوق ، التالي فان درجه الحرارة البيئية يجب ان تتكيف للحفاظ علي درجه حرارة وديه الثابتة c. اليجس . لتحقيق ذلك ، يتم عقد غرفه التصوير في 16 درجه مئوية. يسخن المنطقة عينه من الاداه حتى 21-23 [ك] اثناء تصوير. التقلبات في درجه حرارة الغرفة يمكن ان تؤثر علي توقيت النمو وتغيير بمهارة دقه المستوي البؤري خلال زيارة نقطه وينبغي تجنب قدر الإمكان. لاحظ ان تشغيل في درجات حرارة فوق 23 درجه مئوية يمكن ان يؤدي إلى ارتفاع كبير في الفتك الجنيني لظروف السيطرة وليس من المستحسن. ومن الاعتبارات الرئيسية الأخرى اختيار الجنين والتشتت اثناء التشريح. وينبغي توخي الحذر لتجنب نقل الاجنه الأكبر سنا إلى ابار التصوير ، لأنه عند الفقس تميل الماشية إلى التخلص من الاجنه المجاورة ؛ ويقلل من حدوث ذلك من خلال ادراج مخدر في وسائل الاعلام. تشتت الاجنه ، لتجنب كتل كبيره من الاجنه ، هو أيضا متغير حرج. التكتل يميل إلى ان يحدث عندما يتم نقل الاجنه إلى الآبار في البيوت الشعرية التي يتم سحبها بشكل رقيق جدا ، أو عندما لا يتم تفريق الاجنه بشكل كاف اثناء التشريح. وهناك اعتبار آخر هو ان اختيار النقطة وضبط المستوي البؤري يستغرق وقتا. لا يتم عقد لوحه علي الجليد خلال هذه العملية ، التالي فان الاجنه تبدا النامية علي الفور. لسلالات علامة مخصصه المستخدمة في هذه الدراسة ، وهناك حوالي 90 دقيقه نافذه بعد أزاله لوحه من الجليد لإنجاز لوحه المسح وتحديد نقطه قبل ان تبدا علامات ليتم التعبير عنها. هذا هو الوقت الكافي لاعداد علي صك لدينا مع هذه السلالات ، ولكن المجاهر والسلالات الأخرى قد تقدم تحديات الوقت الاضافيه التي سوف تتطلب استكشاف الأخطاء وإصلاحها. وأخيرا ، فان الطريقة التي تصف تستخدم 60x النفط الهدف لجمع z-أكوام من حقول 50 في الفواصل الزمنيه 20 دقيقه. وكما نسلط الضوء علي ذلك ، يمكن زيادة الدقة الزمنيه عن طريق خفض عدد الحقول التي لم يتم تحديدها. علي سبيل المثال ، يمكن ان يتم تصوير 10 حقول في دقه الوقت 4 دقيقه. وهناك بديل ثان لزيادة الدقة الزمنيه هو استخدام التكبير اقل ، وارتفاع الهدف الرقمية الفتحة ؛ في هذه الحالة ، فان مجال الرؤية الأكبر يسمح بتصوير عدد كبير من الاجنه في وقت اعلي من الدقة مع انخفاض معتدل في الدقة المكانية.
لتمكين معالجه البيانات والتصور علي نطاق أوسع ، قمنا ببناء أدوات مخصصه وجعلها متاحه بحريه. الاداه الأكثر فائده علي نطاق واسع هو واجهه المستخدم الرسوميه المحاصيل المخصصة ، والتي لا تتطلب خبره البرمجة للعمل. ويمكن استخدام واجهه المستخدم الرسوميه لاقتصاص الاجنه وتوجيهها في جميع مراحل التطور ، وهي متوافقة مع جميع العلامات ، مما يجعلها مفيده ليس فقط لعلماء البيولوجيا التنموية ، ولكن أيضا للباحثين الذين يدرسون العمليات في الاجنه المبكرة. لان الناتج من واجهه المستخدم الرسوميه هو بالبالضبط اقتصاص ، المنحى ، تحجيم ، الانجراف التصحيح البيانات ، يمكن ان تكون البيانات بسهوله التسريب إلى خط أنابيب التحليل الألى ، مما يجعل هذه الاداه مفيده لتحليل البيانات الماضية والمستقبلية ؛ إذا تم استخدام السلالات المناسبة ، يمكن استخدام ملفات البيانات الناتجة كمدخلات لأنظمه التحليل المؤتمتة الموجودة ، مثل أدوات محاذاة تولد الاجنه25. من أجل استخدام البرنامج ، من المهم للمستخدمين ان يدركوا ان خوارزميه الاقتصاص تتطلب الحقل الساطع أو صوره DIC ليتم جمعها لكل خطوه ونقطه زمنيه. الاضافه إلى ذلك ، يجب علي المستخدمين ملاحظه ان خوارزميه التوجيه الخلفي الامامي يتم تنظيمها استنادا إلى توزيع الاشاره الحمراء في المراسلات الخاصة بالطبقة الجرثومية وسلالات تقرير النشاه التي تظهر في هذا العمل. التالي ، فان دقه التوجه AP في سلالات العلامات الأخرى ستحتاج إلى تقييم علي أساس كل حاله علي حده. وقد تم اختبار واجهه المستخدم الرسوميه مع البيانات التي تم جمعها علي ثلاث منصات التصوير البؤري المختلفة ومتوافقة في جميع انحاء المجلس لأكوام متعددة tiff وسلسله tiff. بالاضافه إلى الإصدار السهل الاستخدام ، تم أيضا توفير التعليمات البرمجية المصدرية لواجهه المستخدم الرسوميه والإصدار الدفعي من هذا البرنامج ، مع التحذير من ان تجربه البرمجة مطلوبه ، سيلزم اتباع هياكل الملفات واصطلاحات التسمية. وأخيرا ، تم إنشاء ماكرو معالجه ImageJ لأخذ مكدسات الصور الخام لجميع الاجنه ، في كل حاله RNAi ، وتجميع صفيف المعلومات لإظهار جميع الاجنه لهذا الشرط في برايمفيلد والإسقاط كثافة الحد الأقصى في كل نقطه زمنيه. يمكن تكييف هذه الاداه مع مواصفات المستخدم وهي ماكرو مفيد لجعل استكشاف البيانات وتقييم مراقبه الجودة ابسط.
معا ، فان طريقه التصوير شبه العالية الانتاجيه إلى جانب الاقتصاص من الاجنه وأداات معالجه الصور الموصوفة هنا ستسهل تحليل التطور الجنيني لل c. باستخدام مجموعه متنوعة من المسوخ والاضطرابات وسلالات العلامات. في المختبر الخاص بنا ، يتم حاليا تشغيل شاشه واسعه النطاق تستخدم هذه الأساليب لتصوير الاجنه من السلالتين المخصصتين المهندستين الموصوفتين هنا بعد ضربه قاضيه بالجينات ~ 2,000 المطلوبة للتطوير. وأخيرا ، فان البيانات المستمدة من هذا الجهد ستكون بمثابه مورد آخر لتعزيز الجهود الرامية إلى فهم مواصفات مصير الخلية والاحداث الوراثية اثناء تولد الاجنه.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
اي
Acknowledgments
وقد تم دعم S.D.O. من قبل المعهد الوطني للعلوم الطبية العامة برعاية جامعه كاليفورنيا سان دييغو البحوث المؤسسية وجائزه التطوير الوظيفي الاكاديميه (المعاهد القومية للصحة/IRACDA K12 GM068524). وقد تم دعم كو من قبل معهد لودفيغ لأبحاث السرطان ، والذي قدم لهم أيضا تمويل الأبحاث المستخدمة لدعم هذا العمل. ونحن ممتنون لأندرو Chisholm لنصيحته في المراحل المبكرة من هذا المشروع ، رونالد بيجز للمساهمات في هذا المشروع بعد مرحله تطوير الأسلوب الاولي ، وديف جينكينس واندي Shiau للحصول علي الدعم والوصول إلى اكتشاف جزيء صغير نظام التصوير عالي المحتوي الخاص بالمجموعة.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Aspirator Tube Assembly | Drummond Scientific | 2-000-000 | |
| Calibrated Pipette (25 mL) | Drummond Scientific | 2-000-025 | |
| Cell Voyager Software | Yokogawa Electric Corp | Included with CV1000 | |
| Conical Tube (15 mL) | USA Scientific | 1475-0501 | |
| CV1000 Microscope | Yokogawa Electric Corp | CV1000 | |
| Depression slide (3-well) | Erie Scientific | 1520-006 | |
| Dissection Microscope | Nikon | SMZ-645 | |
| Eppendorf Centrifuge 5810R | Eppendorf | 5811 07336 | |
| ImageJ/FIJI | Open Source | https://imagej.net/Fiji | |
| M9 Buffer | Lab Prepared | https://openwetware.org/wiki/M9_salts | |
| Microcentrifuge Tube (1.5 mL) | USA Scientific | 1615-5500 | |
| Microseal F-foil Seal | Bio-Rad | MSF1001 | |
| NGM Plates | Lab Prepared | http://www.wormbook.org/chapters/www_strainmaintain/strainmaintain.html#d0e214 | |
| Scalpel #15 | Bard Parker | REF 371615 | |
| Sensoplate Plus, 384 Well, F-bottom, Glass Bottom | Greiner Bio-One | 781855 | |
| Tetramisole Hydrochloride | Sigma Aldirch | T1512-10G | |
| Tweezers, Dumont #3 | Electron Microscopy Sciences | 0109-3-PO | |
| U-PlanApo objective (10× 0.4 NA) | Olympus | 1-U2B823 | |
| U-PlanApo objective (60× 1.35 NA) | Olympus | 1-U2B832 |
References
- Armenti, S. T., Nance, J. Adherens junctions in C. elegans embryonic morphogenesis. Sub-Cellular Biochemistry. 60, 279-299 (2012).
- Chisholm, A. D., Hsiao, T. I. The Caenorhabditis elegans epidermis as a model skin. I: development, patterning, and growth. Wiley Interdisciplinary Reviews Developmental Biology. 1 (6), 861-878 (2012).
- Jackson, B. M., Eisenmann, D. M. beta-catenin-dependent Wnt signaling in C. elegans: teaching an old dog a new trick. Cold Spring Harbor Perspectives In Biology. 4 (8), 007948 (2012).
- Lamkin, E. R., Heiman, M. G. Coordinated morphogenesis of neurons and glia. Current Opinion in Neurobiology. 47, 58-64 (2017).
- Loveless, T., Hardin, J. Cadherin complexity: recent insights into cadherin superfamily function in C. elegans. Current Opinion in Cell Biology. 24 (5), 695-701 (2012).
- Priess, J. R. Notch signaling in the C. elegans embryo. WormBook. , 1-16 (2005).
- Spickard, E. A., Joshi, P. M., Rothman, J. H. The multipotency-to-commitment transition in Caenorhabditis elegans-implications for reprogramming from cells to organs. FEBS Letters. 592 (6), 838-851 (2018).
- Vuong-Brender, T. T., Yang, X., Labouesse, M. C.
- Wang, J. T., Seydoux, G.
- Wang, S., et al. A high-content imaging approach to profile C. elegans embryonic development. Development. 146 (7), (2019).
- Wang, S., Ochoa, S., Khaliullin, R. N., Gerson-Gurwitz, A., Hendel, J. M., Zhao, Z., Biggs, R., Chisholm, A. D., Desai, A., Oegema, K., Green, R. A. Dryad Digital Repository. , (2019).
- Wang, S., Ochoa, S., Khaliullin, R., Gerson-Gurwitz, A., Hendel, J., Zhao, Z., Biggs, R., Chisholm, A., Desai, A., Oegema, K., Green, R. A. Zenodo. , (2018).
- Khaliullin, R. N. Software to crop C. elegans embryos from multi-channel microscopy images. , Available from: https://github.com/renatkh/embryo_crop (2018).
- Schindelin, J., et al. Fiji: an open-source platform for biological-image analysis. Nature Methods. 9 (7), 676-682 (2012).
- Schneider, C. A., Rasband, W. S., Eliceiri, K. W. NIH Image to ImageJ: 25 years of image analysis. Nature Methods. 9 (7), 671-675 (2012).
- Chisholm, A. D., Hardin, J.
- Sulston, J. E., Schierenberg, E., White, J. G., Thomson, J. N. The embryonic cell lineage of the nematode Caenorhabditis elegans. Developmental Biology. 100 (1), 64-119 (1983).
- Fakhouri, T. H., Stevenson, J., Chisholm, A. D., Mango, S. E. Dynamic chromatin organization during foregut development mediated by the organ selector gene PHA-4/FoxA. PLoS Genetics. 6 (8), (2010).
- Zhong, M., et al. Genome-wide identification of binding sites defines distinct functions for Caenorhabditis elegans PHA-4/FOXA in development and environmental response. PLoS Genetics. 6 (2), 1000848 (2010).
- Schmitz, C., Kinge, P., Hutter, H. Axon guidance genes identified in a large-scale RNAi screen using the RNAi-hypersensitive Caenorhabditis elegans strain nre-1(hd20) lin-15b(hd126). Proceedings of the National Academy of Sciences, USA. 104 (3), 834-839 (2007).
- Canny, J. A computational approach to edge detection. IEEE transactions on pattern analysis and machine intelligence. 8 (6), 679-698 (1986).
- Levin, M., Hashimshony, T., Wagner, F., Yanai, I. Developmental milestones punctuate gene expression in the Caenorhabditis embryo. Developmental Cell. 22 (5), 1101-1108 (2012).
- Packer, J. S., et al. A lineage-resolved molecular atlas of C. elegans embryogenesis at single cell resolution. BioRxiv. , (2019).
- Oegema, K., Hyman, A. A. Cell division. WormBook. , 1-40 (2006).
- Insley, P., Shaham, S. Automated C. elegans embryo alignments reveal brain neuropil position invariance despite lax cell body placement. PLoS One. 13 (3), 0194861 (2018).
