Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Developmental Biology
Click here for the English version

Developmental Biology

Полу-высокой пропускной способ визуализации и инструментвизуализации данных для анализа C. elegans эмбрионального развития

Published: October 29, 2019 doi: 10.3791/60362
Automatic Translation
1,2,3, 1,2, 1,2, 1,4,5, 1,6, 1,7, 1,2, 1,2, 1,2
1Ludwig Institute for Cancer Research, San Diego, 2Department of Cellular and Molecular Medicine, University of California, San Diego, 3Recursion Pharmaceuticals, 4Biomedical Sciences Graduate Program, University of California, San Diego, 5Cell Biology Section, National Institute of Dental and Craniofacial Research, National Institutes of Health, 6Department of Biology, San Diego State University, 7Developmental and Stem Cell Biology Graduate Program, University of California, San Francisco

Summary

Эта работа описывает полу-высокой пропускной протокол, который позволяет одновременное 3D замедленной визуализации эмбриогенеза в 80-100 C. elegans эмбрионов в одном ночном запуске. Кроме того, для оптимизации анализа данных включены инструменты обработки изображений и визуализации. Сочетание этих методов с пользовательскими штаммами репортера позволяет детально контролировать эмбриогенез.

Abstract

C. elegans является главным системой систематического анализа спецификации судьбы клеток и морфогенетических событий во время эмбрионального развития. Одна из проблем заключается в том, что эмбриогенез динамически разворачивается в течение примерно 13 ч; эта полудневная шкала времени ограничила масштабы экспериментов, ограничив количество эмбрионов, которые могут быть изображены. Здесь мы описываем полу-высокой пропускной протокол, который позволяет для одновременного 3D промежуток времени изображения развития в 80-100 эмбрионов при умеренном разрешении времени, от до 14 различных условиях, в одном ночном запуске. Протокол прост и может быть реализован любой лабораторией с доступом к микроскопу с возможностью посещения точки. Полезность этого протокола демонстрируется с помощью его изображения двух специально построенных штаммов, выражающих флуоресцентные маркеры, оптимизированные для визуализации ключевых аспектов спецификации зародышевого слоя и морфогенеза. Для анализа данных была создана пользовательская программа, которая выводит отдельные эмбрионы из более широкого поля зрения во всех каналах, z-шагах и тайм-пойнтах и сохраняет последовательности для каждого эмбриона в отдельный стек tiff. Программа, которая включает в себя удобный графический пользовательский интерфейс (GUI), упрощает обработку данных путем изоляции, предварительной обработки и равномерной ориентации отдельных эмбрионов в рамках подготовки к визуализации или автоматизированного анализа. Также поставляется макрос ImageJ, который собирает индивидуальные данные эмбриона в многопанельный файл, который отображает максимальную интенсивность флуоресценции проекции и яркие изображения поля для каждого эмбриона в каждый момент времени. Протоколы и инструменты, описанные в этом вопросе, были проверены с помощью их характеристики эмбрионального развития после стука 40 ранее описанных генов развития; этот анализ визуализировал ранее аннотированные фенотипы развития и выявил новые. Таким образом, эта работа детали полу-высокой пропускной способ визуализации в сочетании с программой обрезки и ImageJ визуализации инструмент, который, в сочетании с штаммами, выражающими информативные флуоресцентные маркеры, значительно ускоряет эксперименты для анализа эмбрионального развития.

Introduction

Эмбрион C. elegans является важной модельной системой для механистической клеточной биологии и анализа спецификации судьбы клеток и морфогенетических событий, движущих эмбриональное развитие1,2,3,4 ,5,6,7,8,9. На сегодняшний день большая часть характеристиккаки как клеточного уровня событий и клеточной судьбы спецификации в эмбрионе была достигнута с использованием относительно высокого временного разрешения один на время изображений экспериментов (т.е. приобретение каждые 10-100 с) эмбрионов выражения флуоресцентные маркеры. Хотя этот подход хорошо подходит для событий на срокотдок до десятков минут, он становится технически ограничивающим для характеристики более длительных процессов, на порядок часов до нескольких дней. Эмбриональное развитие от первого расщепления до конца удлинения занимает около 10 ч. В этом временном масштабе, полу-высокой пропускной связи методы, которые позволили бы одновременное снижение времени изображения (т.е. приобретение на 5-20 минут интервалов времени) больших когорты эмбрионов, из различных условий, откроет новый спектр экспериментов; например, проведение систематических крупномасштабных скрининговых усилий и анализ достаточного количества эмбрионов для сопоставления последствий молекулярных возмущений.

Здесь мы описываем полувысокой пропускной способ мониторинга c. elegans embryogenesis, который позволяет одновременно еженедельную 3D-временную визуализацию развития в 80-100 эмбрионах, от до 14 различных условий, в одном ночном запуске. Протокол прост в реализации и может быть выполнен любой лабораторией с доступом к микроскопу с возможностями посещения точек. Основные шаги в этом протоколе изложены на рисунке 1. Короче говоря, эмбрионы вскрыты от gravid взрослых, выражающих флуоресцентные маркеры интереса и передачи молодых эмбрионов (2-8 клеточной стадии) в колодцы 384-хорошо пластины для визуализации. В этом формате относительно небольшой размер воронки эмбрионов в узкую область, что облегчает идентификацию полей, содержащих несколько эмбрионов для замедленной визуализации. Для поддержания примерно синхронного развития в когорте эмбрионов, вскрытия выполняются в охлажденных носителях и пластина удерживается на льду, что предотвращает значительное развитие в течение часового времени вскрытия. Пластина передается в микроскоп и эмбрионы снимаются в температурно-контролируемой комнате на ночь, с интервалом в 20 минут, используя 60x погружение маслом 1.35 NA объектив, чтобы собрать полный z-диапазон в 2 мкм шагов. Пятьдесят полей, каждый из которых содержит от 1 до 5 эмбрионов, изображены в одном ночном запуске. В зависимости от желаемого эксперимента, разрешение времени может быть увеличено (например, изображение с интервалом 5-10 минут) за счет пропорционального уменьшения количества изображенных полей.

С помощью этого протокола даже один ночной запуск генерирует значительный объем данных (80–100 эмбрионов, разбросанных по 50 полям), и более крупные эксперименты могут быстро стать неуправляемыми в отношении анализа данных. Для облегчения обработки, визуализации и оптимизации анализа этих данных была создана программа для обрезки и ориентации эмбрионов и выполнения предобработки (необязательно), а также макрос ImageJ, который собирает данные для упрощения просмотра. Эти программы могут быть использованы для обработки изображений, собранных с помощью обычных подходов, так как они не зависят от метода визуализации, требующего только одной плоскости яркого поля. Первая программа использует 4D-поле, содержащее несколько эмбрионов (опция GUI или исходный код embryoCrop.py) или несколько 4D полей, содержащих несколько эмбрионов (screenCrop.py), плотно выращивают эмбрионы и ориентируют их в передне-задней конфигурации. Эти программы также дают пользователям возможность выполнять фоновое вычитание, коррекцию дрейфа и коррекцию затухания. Полученные файлы равномерно предварительно обработаны, плотно обрезанные стеки tiff для каждого эмбриона, которые поддаются изменению автоматизированного анализа изображений. Чтобы сделать его проще для просмотра всех эмбрионов для каждого состояния, ImageJ макрос (OpenandCombine'embsV2.ijm) был написан, который собирает все эмбрионы из данного состояния в один стек тифф и массивы яркие изображения поля и максимальной интенсивности проекции цвета ( RGB) накладки, бок о бок, для каждого эмбриона. Методы были проверены с помощью их для характеристики эмбрионального развития после нокдауна 40 ранее описанных генов развития в паре специально построенных штаммов, выражающих флуоресцентные маркеры, оптимизированные для визуализации ключевых аспектов зародышевого слоя спецификации и морфогенеза10,11. В совокупности полувысокой пропускной процесс обработки эмбрионов и инструменты обработки изображений позволят проводить эксперименты с более высоким числом образцов и проводить крупномасштабные скрининговые усилия, направленные на понимание процессов развития. Кроме того, эти штаммы также обеспечат эффективное средство для изучения влияния молекулярных возмущений на эмбриогенез.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1. Подготовка C. elegans Эмбрионы для полу-высокой пропускной записи изображений

ПРИМЕЧАНИЕ: Цель этой части протокола заключается в загрузке популяции полусинхронизированных (от 2 до 8-клеточной стадии) C. elegans эмбрионов, расчлененных из подходящих штаммов маркера(рисунок 2), в стеклянно-нижней 384-коловидной пластины для визуализации. Другие форматы пластин также могут работать, но 384 пластины скважины являются предпочтительными, поскольку небольшой размер скважины ограничивает распространение эмбрионов на относительно небольшой площади, что облегчает идентификацию полей, содержащих несколько эмбрионов для визуализации замедленного действия. Грубо синхронизация эмбрионов гарантирует, что полный ход развития будет захвачен для каждого из эмбрионов в поле.

  1. Подготовка 5-10 мл 0,1 мг/мл раствор атрамизолгидрорида (TMHC) анестезии, растворенного в ледяной среде M9 (0,45 М Na2HPO47H2O, 0.11 M KH2PO4, 0.04 M NaCl, 0.09 M NH4Cl) для использования во время использования во время использования во время рассечение и визуализация. Это носитель включает в себя анестезию, чтобы движущиеся вылупившихся личинок не нарушали визуализацию эмбрионов на более ранних стадиях развития.
    ПРИМЕЧАНИЕ: При использовании инструментов обрезки и визуализации для анализа данных, полученных с помощью стандартных методов монтажа агарозной площадки, перейдите вперед к разделу 3 ниже.
  2. Aliquot 70 л подготовленного раствора в отдельные скважины стеклянно-нижней 384-луковой пластины с одной скважиной для каждого состояния; избегать внешних двух рядов пластины, чтобы предотвратить эффекты края.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Полезно маскировать окружающие колодцы с помощью клейкой фольги ПЦР (см. пример на рисунке 1D),это сохраняет соседние скважины для будущих экспериментов и облегчает поиск соответствующих скважин под микроскопом вскрытия. После того, как раствор aliquoted, держать пластину и оставшийся раствор на льду во всем вскрытии.
  3. Создание рот pipets для переноса эмбрионов из депрессии слайд (где gravid гермафродиты вскрыты) в колодцы. Потяните капиллярные pipets (25 л откалиброванных pipets) над пламенем и перерыв для создания тонкой конической конца(рисунок 1D). Для предотвращения перекрестного загрязнения необходим один пайпет для предотвращения перекрестного загрязнения; отказаться от трубы после использования.
  4. Используйте тонкие пинцеты для передачи 10 gravid взрослых под рассечение сферы в 150 злиц ледяной TMHC решение aliquoted на депрессии слайд для каждого состояния. Используя пинцет и скальпель, вскрыть червей, чтобы освободить эмбрионы.
  5. Загрузите вытянутую трубу капилляра в крепление аспиратора, включенное в pipets, и рот пипетку для передачи всех 2 до 8-клеточной стадии эмбрионов в отдельный колодец подготовленной пластины(Рисунок 1D). Избегайте переноса эмбрионов поздней стадии и вскрытия мусора. Изучите под областью вскрытия и если агрегаты эмбрионов присутствуют, рот пипетка вверх и вниз или кран скопления эмбрионов с трубчатым кончиком разойтись.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Для предотвращения перекрестного загрязнения, чистое оборудование вскрытия и использовать свежий рот пипетка при перемещении между условиями. Храните тарелку на льду между вскрытиями.
  6. После того, как черви из всех условий были вскрыты и эмбрионы помещены в их соответствующие хорошо, спина 384-хорошо пластины в течение 1 мин на 600 х г, чтобы урегулировать эмбрионов.
  7. Протрите дно пластины с этанол пропитанной салфеткой, чтобы удалить любые остатки и поместить пластину на конфокальный микроскоп, оснащенный держателем пластины в температурно-контролируемой среде.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Шаги, которые следуют подробно этот метод с помощью лабораторной установки; пожалуйста, измените условия приобретения в соответствии с экспериментальными потребностями и оборудованием. Здесь используется конфокальная коробка сканера, оснащенная двойным вращающимся диском Nipkow с двойным спиннингом, 512 x 512 EM-CCD, высокоточной автоматической XY-Stage (специально еде есеное разрешение 0,1 мкм) и моторизованным управлением z-оси (специально еде 0,1 мкм). Эта система хранится в комнате 16 градусов по Цельсию, которая поддерживает температуру микроскопа между 21 и 23 градусами Цельсия во время ночной визуализации.
  8. Чтобы определить поля с подходящими эмбрионами, выполните предварительное сканирование каждой скважины с помощью объективного и подходящего программного обеспечения для визуализации 10x 0.4 NA. Наиболее оптимальные поля будут содержать более одного эмбриона ранней стадии, который находится в той же фокусной плоскости, что и другие эмбрионы, и в идеале будет иметь минимальный контакт между соседними эмбрионами. Отметьте позиции подходящих регионов.
  9. Чтобы выбрать поля изображений, переключитесь на цель 60x и отрегулируйте фокусную плоскость в каждом посещении точки, чтобы надлежащим образом снести эмбрионы. 1-4 поля на скважину изображены, в общей сложности 50 полей в 14 скважинах, и каждое поле может содержать от одного до пяти эмбрионов. В целом, от 4 до 15 эмбрионов выбираются из каждого состояния для визуализации с высоким разрешением.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Ключевой переменной на этом этапе является использование достаточного количества нефти; поместите нефть на цель, посещая точки в каждой скважине, чтобы распределить нефть вокруг поверхности всех скважин, а затем применить дополнительное падение нефти к цели до выбора месторождений.
  10. Изображение выбранных полей с помощью 60x 1.35 NA цель приобрести 18 z разделов с интервалом 2 мкм каждые 20 минут в течение 10 ч. Условия визуализации с использованием зародышевого слоя и морфогенеза репортер штаммов являются следующими: яркое поле, 90% мощности, 25 мс, 20% прироста; 488 нм, 100% мощность, 200 мс, 60% прироста; 568 нм, 45% мощности, 150 мс, 60% прироста.
  11. После завершения визуализации оцените эмбриональную летальность, выполнив низкое увеличение (10х 0,4 NA objective) цельное яркое сканирование 20-24 ч после начала ночной визуализации.

2. Эмбриональный Летальность Скоринг

  1. Используя 10x отсканированные поля, оцените эмбриональную летальность и личиночные дефекты, подсчитав вылупившихся червей и невылупившихся эмбрионов для каждой скважины.
  2. Оценка unhatched эмбрионов, как эмбриональный смертельный. Исключить арестованных одно- до четырехклеточных эмбрионов от количества летальности, так как молодые расчлененные эмбрионы иногда не могут завершить образование яичной скорлупы (если мейоз II еще не завершен) и дефекты проницаемости могут привести к осмотическим осложнениям в течение первых двух Подразделений.
  3. Оценка частично вылупились или полностью вылупившихся червей с морфологией тела или поведенческими дефектами, такими как свалочный или парализованный, как «аномальные личинки».

3. Автоматизированная обрезка(рисунок 3A)

ПРИМЕЧАНИЕ: Программное обеспечение размещается в двух местах: (1) Зенодо дома удобной версии программного обеспечения12, который не требует каких-либо знаний программирования. (2) Github содержит исходный код для нашего embryoCropUI.py и screenCrop.py программного обеспечения13, которые требуют знания с Python. Подробные инструкции по загрузке и эксплуатации обеих версий программы можно найти ниже.

  1. Автоматизированная обрезка с использованием исказуемой версии embryoCropUI (удобная версия)
    1. Чтобы использовать программу embryoCropUI, сначала скачать программу из Зенодо(https://zenodo.org/record/3235681#.XPAnn4hKg2w)12.
      1. Скачать версию формата MacOS или Windows (обратите внимание, что версия MacOS требует MacOS X10.11 или выше).
      2. Загрузите файл инструкций(GUI-Инструкции-zenodo'repoV2.docx),который обеспечивает пошаговую инструкцию для тестирования и использования программы embryoCropUI.
      3. Загрузите test'files.zip, чтобы проверить, правильно ли программа функционирует на платформе (см. инструкции).
    2. После загрузки, распаковать и перемещаться, чтобы найти embryoCropUI исполняемые (...»embryoCropUI »WINDOWS-embryoCropUI.exe) или (...»embryoCropUI'MacOS-embryoCropUI-embryoCropUI.exe). Двойной клик, чтобы запустить (или выбрать "открыть с" терминала) и запустить embryoCropUI исполняемых.
    3. GUI исполняемых культур один 4D поле зрения в то время. В верхнем левом углу выберите открытую кнопку для загрузки определенного поля на обрез (мультитиф). Если обрезка серии tiff, с несколькими измерениями (т.е., z, время, канал), загрузите только первое изображение в серии в папке (одна серия tiff в папку).
    4. После загрузки изображений укажите следующую информацию: количество z-ломтиков, (я), количество точек времени (T), количество каналов (C), канал, который соответствует DIC или яркое поле (первый No1, второй и т.д.).
    5. Выберите дополнительную обработку для выполнения изображений. Программа предлагает коррекцию дрейфа, фоновое вычитание и коррекцию затухания.
    6. Укажите параметры фонового вычитания и коррекции затухания, чтобы направлять усилия по обработке в запросе GUI. Для фоновых вычетов определите размер самого большого объекта, отражающий размер значимого сигнала; этот размер функции не должен рассматриваться как фон и должен быть нечетным значением числа. Ввугатите значение от 0-1 для коррекции затухания. Значение коррекции затухания отражает процент первоначальной интенсивности, которая остается на самой дальней глубине изображенного объекта.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Фоновое вычитание и коррекция затухания должны работать вместе.
    7. Укажите порядок сбора изображений (т.е. канал-z-время (czt) или z-канал-время (zct)).
    8. Укажите микроны на пиксель для изображений на основе используемой камеры.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Плохое обрезка изображений произойдет, если размер пикселя не определен должным образом.
    9. Выберите Выполнить в левом нижнем углу. Новый субфолдер с пометкой с надписью "crop" будет создан в том же пути, что и необрезанная папка; обрезанные версии будут сохранены в этом месте. В зависимости от размера файла, обрезка должна завершиться в течение нескольких секунд до нескольких минут.
  2. Автоматизированная обрезка с использованием screenCrop.py (пакетная альтернатива эмбрионам, описанная выше;Python подкованных пользователей только)10,13
    1. Чтобы использовать screenCrop.py, версия программного обеспечения Python для обрезки больших наборов данных в пакетном формате, клонирования или загрузки исходного кода из Github (github.com/renatkh/embryo_crop.git).
    2. Прочитайте инструкции по настройке правильной виртуальной среды и следуйте описанной системе именования файлов; оба из них подробно описаны в файле README в репозитории Github: https://github.com/renatkh/embryo_crop/blob/master/README.md.
    3. После того, как экологические переменные и соглашения о наименовании были надлежащим образом установлены, открытые parameters.py и screenCrop.py в редакторе по выбору.
    4. Чтобы изменить регулируемые параметры, не касаясь исходного кода, откорректировать parameters.py файл.
      ПРИМЕЧАНИЕ: можно также непосредственно изменять параметры в заголовке screenCrop.py.
      1. При использовании файла конфигурации parameters.py, измените настройку настройки использования на True. При использовании прямого редактирования в течение screenCrop.py, оставьте настройку use'configure на False.
      2. Найдите следующую информацию в файле parameters.py и внедните изменения в соответствии с желаемыми параметрами изображения и структурой файлов:
        1. loadFolder (линия 9): Изменение диска, на котором хранятся файлы (например, ::,, D:// и т.д.)
        2. Дата (строка 7): Изменение папки, содержащей файлы для сеанса визуализации. Это называется «Имя экспериментального Фолдера» в файле отслеживания CSV (см. инструкции).
        3. trackingFile (строка 11): Изменение пути к файлу CSV, в котором хранится информация об эксперименте.
        4. z (линия 13): Установить как количество z самолетов.
        5. nT (линия14): Установить количество таймтов.
        6. nWells (линия 19): Установите как количество используемых скважин.
        7. pointVisits (линия 20): Установить в качестве максимального числа посещений точки (за хорошо).
        8. В строке 10 найдите местоположение, занимаемое в настоящее время 'CV1000/' и ввведайте внешнюю папку, используемую в пути файла. Чтобы избежать проблем, используйте следующую конвенцию: 'XXXXXXX/'.
        9. В строке 12 ввейди допустимый путь файла для хранения данных о соотношении сторон для обрезанных данных.
        10. В строках 15, 16, 17 и 18 входных True/False для того, проходят ли изображения через следующую обработку:
          1. Вход True или False для коррекции дрейфа на линии 15.
          2. Ввод True или False для фонового вычета на строке 16. Размер объекта должен быть эмпирически определен для различных штаммов маркеров и размеров пикселей. В конфигурации здесь размер функции был определен как 41 для штамма Germ-Layer и 201 для штамма Morphogenesis. Фоновая вычитание должно быть сделано в сочетании с коррекцией затухания.
          3. Вход True или False для коррекции затухания на строке 17.
          4. Ввод True или False для переднего заднего вращения на линии 18.
    5. Как только все изменения были сделаны, обрезка может начаться. Для этого, переключиться на screenCrop.py и выбрать значок игры в панели инструментов, в выпадающем меню выберите Run Как
    6. Поскольку обрезка может занять несколько часов для большого набора данных (50 пунктов посещения 18 z шагов, 3 канала, 31 тайм-пойнт), отслеживать ход обрезки в окне консоли. После завершения обрезки небольшое окно покажет предварительные просмотры обрезанных изображений перед сохранением. Для каждого изображения есть 3 варианта:
      1. Сохранить: Пресс-панель пространства, чтобы сохранить изображение, если изображение обрезается должным образом без каких-либо областей, представляющих интерес быть отрезаны.
      2. X: Нажмите X, если изображение, как представляется, области, представляющие интерес отрезали; изображение будет сохранено с X перед именем, чтобы отделить его от других изображений.
      3. Удалить: Нажмите D, чтобы удалить обрезанное изображение, если изображение не обрезано должным образом или эмбрион не является удовлетворительным.
        ПРИМЕЧАНИЕ: Изображения будут сохранены в subfolder под названием "Обрезанный" в Load Folder (определяется в строке 9 программы).

4. Визуализация(рисунок 4)

ПРИМЕЧАНИЕ: OpenandCombine'embsV2.ijm10,12 является Macro ImageJ, который будет строить простой для просмотра файл айф из всех изображений для конкретного напряжения и состояния. Требуется установка FIJI/ImageJ14,15. Этот макрос работает в соответствии с нашей структурой файлов; его необходимо будет модифицировать для работы с другими файлофайлными структурами. Руководство по надлежащей структуре файлов и подробное описание важных соображений можно найти в конце GUI-Инструкции-zenodo-repoV2.docx файла на репозиторий Зенодо. Пожалуйста, прочитайте эти инструкции полностью перед визуализацией, чтобы правильно имя и структура файлов, чтобы лучше всего взаимодействовать с этим макросом. Для справки, наша структура местоположения файла выглядит следующим образом:
Вопрос: «обрезанный»-Таргет»-Эмб»-Эмб»-15 Дигит уникальный идентификатор «W»#F »T»#_Z.#_C.tif
т.е. ::«Обрезанный»EMBD0001»GLS-Emb1-EMB1-20140327T135219

  1. Скачать OpenandCombine'embsV2 и GUI-Инструкции-zenodo'repoV2.docx от Зенодо (https://zenodo.org/record/3235681#.XPAnn4hKg2w).
  2. Подготовьте следующую информацию:
    -Место, где хранятся папки изображения (после обрезки).
    - Имя папки изображения (ы) для обработки конкретного состояния (ы) (т.е. EMBD0002). Это называется «Цель» в приведенном выше примере
    -15-значный альфа-числовой уникальный идентификатор, который специфичен для данного ночного эксперимента , этот идентификатор является именем папки для получения данных (т.е. 20140402T140154) и уникальный идентификатор встроен в индивидуальное имя файла tiff (EMBD0002 20140402T140154-W06F2-T01'01-C1) за каждый эмбрион, изображенный в этот день. Макрос использует этот идентификатор для проверки эмбрионов, приобретенных в один и тот же день, и может собирать повторяющиеся условия с отдельными датами в отдельные файлы ImageJ.
  3. Открыть ImageJ, и перетащите и падение макрофайла, OpenandCombine'embsV2.ijm, в бар ImageJ, или открыть макрос напрямую.
  4. Как только макрос открыт, найдите линии 3 и 4. Ввод информации, собранной в разделе 4.2) в соответствии со следующими шагами:
    1. В строке 3 (RNAL) ввейте целевое имя для обработки изображений. Ввод каждой цели в следующую структуру newArray ("XXXXXXXXXX/"); включают цитаты. Для запуска нескольких условий одновременно, отделиться от запятой и сохранить все целевые имена в скобках (т.е., newArray ("EMBD0000/","EMBD0001/","EMBD0002/").
    2. В строке 4 (дата) ввводите 15-значный альфа-числовой уникальный идентификатор в котировках, например newArray ("20140402T140154").
  5. Пресс-запуск в левом нижнем углу окна макроса. Появится окно, которое запустит запрос для навигации по внешней папке, содержащей обрезанные папки изображения (указано в 4.4.1).
  6. После выбора появится еще одно окно, которое позволит спецификации параметров изображения.
    1. Введите количество каналов, количество срезов, размер шрифта для текста, используемого при маркировке компилированных изображений, и цвет для каждого из каналов.
    2. Проверка автоматического контрастирования/выключения во всех каналах.
  7. После того, как все параметры были определены, нажмите OK в нижней части окна. Составной файл начнет собираться; это займет несколько минут, на условие, чтобы завершить.
  8. После завершения, просмотрите файлы, которые остаются открытыми при желании. Они могут быть закрыты без сохранения, так как макрос уже сохранил файлы в недавно созданной папке, которая названа следующим образом: имя внешней папки (указано в запросе раздела 4.5) обрезанный-фиджи-обработанный-выход-EMBD0002-GLS-20140402T140154.tif).

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Значительная проблема в характеристике влияния молекулярных возмущений на эмбриональное развитие C. elegans заключается в том, что эмбрионам требуется около 10 ч, чтобы прогрессировать от первого расщепления до конца удлинения при 20'16. Полу-высокой пропускной метод, в котором большие когорты эмбрионов могут быть одновременно изображены полезно для событий в этом временном масштабе, поскольку это позволяет изображения нескольких условий параллельно с достаточным размером ансамбля для каждого состояния, чтобы количественный анализ(рисунок 1А).

Полувысокой пропускной способ визуализации и многомаркерные штаммы
Полу-высокой пропускной способ визуализации, описанный здесь (изложено на рисунке 1B), использует 384-колодец нижней пластины; формат мультискважин позволяет выстраивать параллельно до 14 условий, а небольшой размер скважин ограничивает область поиска, упрощая идентификацию полей, содержащих эмбрионы, для визуализации с высоким разрешением. Здесь использовалась коробка для конфокальных сканеров, оснащенная двойным вращающимся диском Nipkow с двойным двигателем Nipkow, камерой 512 x 512 EM-CCD, высокоточной автоматической XY-Stage (обозначенное разрешение 0,1 мкм) и моторизованным управлением z-оси (специально едецкое разрешение 0,1 мкм). Тем не менее, протокол может быть адаптирован для любого конфокального микроскопа с точностью возможности посещения точки и адаптер этапе, который может вместить многослойной пластины. Важной задачей при разработке этого метода была разработка средств для создания пластины эмбрионов на той же стадии развития, с тем чтобы полностью развитие можно было захватить для всех эмбрионов в каждой области. Это проблема, потому что эмбрионы, выложенные на пластину изображения сначала будет продолжать развиваться в то время как более поздние образцы вскрыты, в результате чего градиент постановки через скважины. Чтобы обойти эту проблему, эмбрионы ранней стадии (2-8 клеточной стадии) выбираются и сохраняют вскрытие носителя и пластины для визуализации на льду; это останавливает эмбриогенез для вскрытых эмбрионов, пока все условия были выстроены без существенного влияния эмбриональной жизнеспособности10. Чтобы ограничить время, в течение которого эмбрионы сидят на льду 1 часом, два исследователя выполняют вскрытия одновременно, что позволяет установить 14 различных условий примерно за 50 минут. После вскрытия пластина закручена при 600 х г в течение 1 мин для отложения эмбрионов и колодцев предварительно сканируется при низком увеличении, чтобы найти поля с группами подходящих эмбрионов для визуализации с высоким увеличением; места посещения точки отмечены. Эмбрионы снимаются в комнате, контролируемой температурой, на ночь с помощью 60-х масляного погружения 1.35 NA объектива. Образцы настроены в 4 скважины на 4 хорошо области так, что площадь поверхности пластины, которая используется в эксперименте сопоставима с 22 х 22 мм2 стандартный крышкой, что позволяет использовать 60x нефти цели. Равномерное распространение нефти по всему региону до начала визуализации имеет решающее значение для успешного долгосрочного приобретения изображения. Развивающиеся эмбрионы изображены в растворе, содержащем анестетик; это гарантирует, что, когда старые эмбрионы в люк евка, их движение не нарушает положение соседних молодых эмбрионов, которые в настоящее время изображения. Из-за непроницаемой природы яичной скорлупы, анестезия не влияет на движение до вылупления. В этих условиях 3D-данные о замедленном промежутке времени собираются в 3-каналах в общей сложности 80-100 эмбрионов в одном ночном эксперименте (обсуждается ниже).

C. elegans эмбрионального развития происходит в два этапа. Во-первых, 10 раундов деления клеток в сочетании с клеточной судьбой спецификации генерировать три слоя зародыша (эктодерм, мезодерм, и эндодерм) в течение 6 часов17. В следующих 7 ч морфогенетические события приводят к образованию дифференцированных тканей8,16. Чтобы запечатлеть эти два аспекта развития, мы построили пару пользовательских штаммов, штаммы зародышевого слоя и морфогенеза10 (рисунок 2А)и использовали полу-высокой пропускной протокол для изображения эмбрионов от обоих штаммов. Штамм Germ Layer выражает закодированные трансгенными флуоресцентными белками, которые отмечают ядра в эктодерме, мезодерме и эндодерме красным, желтым и зеленым цветом. Этот штамм содержит три репортера трансгенов: (1) трансген, выражающий PHA-4::GFP, который отмечает ядра в кишечнике и глотки (зеленый эндодерм)10,18,19, (2) трансген, выражающий слияние mCherry-histone в эпидермисе и в 1/3 нейронов (красный эктодерм; Рисунок 2A), и (3) трансген, который одновременно выражает mCherry и GFP-тегами гистоны в мышце стенки тела (желтый мезодерм). Штамм Morphogenesis имеет два трансгена, которые выражают: (1) зеленый эпителиальный маркер соединения (DLG-1::GFP) в эпидермисе, и (2) mCherry-тегами плазменной мембраны маркер, в 1/3 нейронов(Pnd-1 промоутер; Рисунок 2А). Для повышения эффективности РНК, оба штамма были также разработаны, чтобы содержать пару РНК-чувствительных мутаций(nre-1(hd20) лин-15b (hd126)20. Они были построены с целью выполнения крупномасштабного РНК-экрана из 2000 генов, необходимых для эмбрионального развития. Однако эта пара штаммов также будет представлять собой широко полезную стандартизированную платформу для оценки дефектов развития у мутантов и для более детального анализа роли различных белков в развитии.

Для сбора данных в этом полувысоком формате пропускной связи, с этими штаммами, зеленый, красный и ярко-поле z-серии (18 х 2 мкм2 интервалы) собираются, каждые 20 минут, в течение 10 ч в 16 градусов по Цельсию контролируемой комнате; это поддерживает микроскоп между 21-23 градусов по Цельсию во время запуска. Интервал времени в 20 мин позволяет нам изображение 50 полей эмбрионов (точечные посещения) за эксперимент. Пользователи могут адаптировать приобретения к более коротким интервалам с меньшим количеством посещений точек, или более длительными интервалами с большим количеством посещений точек, чтобы наилучшим образом соответствовать их экспериментальным целям. Для этих штаммов, ранние сроки развития не изображены, потому что ткани конкретных репортеров вождения маркер выражение не начинают выражать до середины-позднего гастрирования. На этой ранней стадии скважины сканировались при низком увеличении (10x) и поля отбирались для визуализации с высоким увеличением. Рекомендуется выбрать поля, содержащие более одного эмбриона на ранней стадии, но избегая полей, где эмбрионы частично перекрываются, чрезмерно переполнены или находятся на крайнем краю скважины. После ночной 60x визуализации, низкое увеличение (10x) всего хорошо сканирование выполняется, чтобы определить, являются ли эмбрионы люк с нормальным внешним видом (WT), люк с видимыми аномалиями (личино-волокиты ненормальным), или эмбриональных летальных для каждого состояния оценивается ( Рисунок 1B). Этот шаг служит легкой альтернативой созданию табличек параллельно для оценки летальности среди более широкого населения; весь колодец 10x пост-сканирование предоставляет эмбриональные данные о летальности на 50-80 эмбрионов на условие. Использование этой меры для сравнения данных о летальности эмбрионов для контроля между пробегами является полезным контролем, обеспечивающим согласованность в отношении здоровья штаммов и экологических условий и этапов обработки. При изображении в комбинации, два пользовательских штаммов репортер анамнез обеспечивают информативные считывания для большинства крупных событий развития, в том числе клеточная судьба спецификации, дорсальной интеркалировки, эпидермального корпуса, удлинения, и нейрогенез (представитель контрольные изображения показаны на рисунке 2B, также см. Ван и др.10).

Обработка данных: автоматизированная обрезка эмбрионов и ориентация
С нашим протоколом визуализации каждое поле изображений с высоким разрешением содержит от 1 до 5 эмбрионов; эти эмбрионы случайным образом ориентированы и часто расположены непосредственно рядом друг с другом. Данные, собранные с использованием обычных методов установки эмбрионов, страдают от тех же проблем. Для подготовки данных к последующей визуализации и анализу необходимы значительные практические манипуляции для обрезки и ориентации последовательностей эмбрионов, а также для их предварительной обработки для вычитания фона, правильного дрейфа и компенсации затмения сигнала с глубиной. Для оптимизации этого процесса была построена пользовательская программа по посеву эмбрионов, которая изолирует и ориентирует каждый эмбрион из более широкого поля(рисунок 1C, рисунок 3). Эта программа была упакована в качестве удобной, автономной программы с графическим пользовательским интерфейсом (GUI, совместимый с данными с большинства платформ изображений), которые могут принять в 3D покадровой последовательности поля эмбрионов, и обработать его в отдельных серии tiff для каждого эмбриона в поле(рисунок 3B, доступен на https://zenodo.org/record/3235681#.XPAnn4hKg2w)10,12. Исходный код Python для графического интерфейса (embryoCropUI.py) и пакетная версия этой программы (screenCrop.py) также доступны опытным пользователям Python на GitHub (https://github.com/renatkh/embryo_crop.git)10,13. Основная функциональность этой программы заключается в том, чтобы найти, обрезать и сориентировать эмбрион вдоль передней задней оси. Одновременно с чем фоновое вычитание, коррекция затухания и коррекция дрейфа могут быть выполнены на наборе данных с помощью дополнительных регулируемых настроек.

Короче говоря, автоматизированное программное обеспечение для обрезки итеративно обнаруживает отдельные эмбрионы в бинарной маске, полученной из изображений яркого поля, и последовательно выседает эмбрионы из всех каналов и ориентирует изображения вдоль передней задней оси (Рисунок 3 B, впервые описано в Wang et al.10). Перед обрезкой, программное обеспечение корректирует для дрейфа, вычитает фон и выполняет коррекцию глубины затухания в каждом канале флуоресценции (по желанию). Для получения бинарной маски, программное обеспечение применяет Canny края обнаружения21 для яркого поля изображения, выполняет максимальную интенсивность проекции трех центральных плоскостей и заполняет в небольших отверстий. Алгоритм обнаруживает отдельные эмбрионы, приспосабливая овал Cassini к разделу начертания бинарной маски (см. рисунок 3B, 3C). После выравнивания овал вдоль своей основной оси, программное обеспечение измеряет интенсивность красной флуоресценции в каждой половине изолированного эмбриона и вращает эмбрион таким образом, что красная интенсивность ориентирована на левую, что ставит передний эмбрион слева для обоих репортер штаммов, используемых в этой работе(Рисунок 3D). Пилотирование этого программного обеспечения показало, что большинство эмбрионов были эффективно обрезаны, как ожидалось. Незначительные проблемы с визуализацией, такие как дрейф эмбрионов, временная потеря фокусной плоскости (из-за пузырей в масле) или переполненные поля эмбрионов, как правило, не нарушали успешной обрезки. Тем не менее, для областей, где были большие скопления эмбрионов (несколько перекрытия в z), эмбрионы, которые были значительно наклонены в плоскости изображения (в к), долгосрочная потеря фокусной плоскости, или эмбрионы, которые были частично отрезаны, успешное обрезка не всегда Достигнуто. Эти проблемы можно легко обойти путем лучшего отбора полей на этапе сбора данных. В целом, предварительная обработка данных, собранных с помощью этого полувысокой пропускной силы метода или с использованием обычных методов монтажа является полезным первым шагом для визуализации и анализа эмбриональных наборов данных.

Проверка методов сбора изображений и обработки данных: визуализация эмбрионального развития после падения 40 ранее описанных генов
Для проверки этого полу-высокой пропускной метод сбора изображений и пользовательского режима обрезки, небольшой экран РНК был выполнен в пользовательских штаммов, направленных против 40 генов с ранее описанными функциями в спецификации судьбы клеток и морфогенеза ( описанные Ван, Очоа,Халиуллини коллеги 10,11). Для этого dsRNA была создана против каждой цели, вводили L4 животных из каждого штамма, ждали 20-24 ч, а затем расчлененные и изображения эмбрионов с помощью протокола, описанного выше (для полного набора данных10,11). Достижение фенотипов развития РНК требует ингибирования как материнской, так и зизотической экспрессии генов. Гены развития могут быть материнско выражены, с результирующей белковыми продуктами, загружаемыми в эмбрионы, или zygotically выраженными в эмбрионе, или, во многих случаях, как10,22,23. Время между инъекцией и съемкой эмбрионов является критической переменной для эффективного ориентации материнского и зиготически выраженного населения; время определяет как количество инъекционных dsRNA, который загружается в эмбрион, чтобы предотвратить зиготическое выражение24 и степень материнского белка истощения. После инъекции dsRNA материнская мРНК, соответствующая целевому гену, деградирует и не восстанавливается в соответствующий временной интервал. Существующее истощение белка требует производства эмбриона, который выбрасывает материнский белок из зародышевых тканей, загружая его в образующие эмбрионы. 20-24 ч при 20 градусах Цельсия - это самое короткое время инкубации, которое позволяет последовательно еразрушать матери; материнское истощение становится лучше в более поздние временные точки (т.е. 36-42 ч после инъекции). Количество инъекций dsRNA, которое загружается в эмбрион, диктует, насколько эффективной будет профилактика экспрессии зиготических генов. Количество загруженной РНК достигает пика около 5-10 ч после инъекции, когда эмбрионы с инъекционным материалом сначала оплодотворяются, уменьшаясь после этого. По нашему опыту, 24 ч после инъекции является оптимальной временной точкой, в которой истощение материнского белка и ингибирование экспрессии зиготического гена являются эффективными. Анализ фенотипов в пользовательских штаммов репортера, используемых в этой работе, через набор из 40 тестовых генов, показал, что наш комбинированный протокол дал различные, высоко воспроизводимые фенотипы подписи через широкий спектр генов, участвующих в судьбе клеток спецификации и морфогенеза (см. Ван и др.10); полный набор данных доступен11). В качестве примера этих данных, по-прежнему изображения четырех различных эмбрионов для контроля, pha-4 (RNAi), pal-1 (RNAi), и mex-3 (RNAi) в штамм репортера зародышевого слоя показаны на рисунке 4A. Для более всестороннего обсуждения фенотипов, наблюдаемых на экране РНК 40 генов, см. Wang et al.10

Макрос ImageJ: Компиляция и визуализация всех данных для данного состояния
Визуализация большого количества эмбрионов из отдельных стеков tiff может быть утомительной и отнимает много времени для работы до конца. Из наших первоначальных усилий, 400 отдельных эмбрионов были изолированы с помощью пользовательской автоматизированной программы земледелия, описанной выше. Чтобы ускорить анализ первого прохода, мы создали макрос ImageJ, который генерирует массив всех эмбрионов, изображенных для данного состояния РНК в данном фоне штамма(рисунок 4B). Для каждого эмбриона в массиве, яркое изображение поля и максимальная интенсивность проекционного изображения представлены бок о бок, для каждой точки времени, для создания композитного файла фильма. Хотя этот макрос был написан для работы с нашей структурой файлов, он может быть отредактирован с учетом структуры файла пользователя. Однако для достижения наилучших результатов пользователи должны следовать конвенциям именования и структуры файлов, изложенным в протоколе (см. файлы «Зенодо» или «Github README» для более подробной информации для конвенций именования приложений Python и ImageJ). Для просмотра всех обработанных данных ImageJ и получения более углубленного анализа фенотипов, наблюдаемых для набора 40-генных тестов, смотрите данные, отложенные в базе данных Dryad10,11. Этот формат визуализации ImageJ позволяет быстро оценить общий фенотип и его пенетранс, а также позволяет легко помечать проблемы качества данных, такие как наличие мусора или потеря фокусной плоскости. В целом, сочетание полувысокой пропускной силы метода сбора данных, программы обрезки и инструмента визуализации ImageJ, в сочетании с пользовательскими штаммами репортера, значительно облегчает более масштабные усилия по изучению эмбрионального развития.

Figure 1
Рисунок 1. Обзор метода визуализации высокого содержания, процедуры обработки данных и основных инструментов. (A) Сравнение особенностей стандартного метода на основе агарозных колодок для монтажа эмбрионов C. elegans с полувысокой пропускной многоскважинным подходом к визуализации, описанным здесь. (B) Обзор полувысокой пропускной метод для мониторинга эмбрионального развития. Подробнее смотрите текст. (C) Обзор инструментов обработки данных и визуализации, которые могут быть использованы на данных, полученных с помощью либо обычной агарозной колодки на основе монтажа процедуры или полу-высокой пропускной многоскважины пластины на основе метода, описанного в этом. Один 3-канал промежуток времени эмбриона последовательности из одного поля (слева) или несколько 3 каналов, 4-мерных полей эмбриона данных (справа) могут быть обработаны с помощью пользовательской программы обрезки, которая совместима с данными, захваченными на большинстве платформ изображений. Графический пользовательский интерфейс (GUI) версия программы является удобной для пользователей и не требует каких-либо знаний программирования. Приложение screenCrop.py требует экспертизы Python, но оно имеет дополнительные возможности, а именно, что он может обрезать в формате партии. Выход этого шага плотно обрезан, передне-задний ориентированный эмбрион тифф стеки. Чтобы визуализировать все данные из одного состояния, был построен макрос ImageJ, который компилирует обрезанные, вращаемые тифф-стеки, чтобы показать яркое изображение поля и максимальную проекцию интенсивности для каждого эмбриона в каждый момент времени. (D) Панель показывает основные инструменты, необходимые для вскрытия и настройки полу-высокой пропускной форме формата изображений. Некоторые компоненты фигуры воспроизводятся с разрешения Wang et al.10. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой цифры.

Figure 2
Рисунок 2. Пользовательские штаммы, генерируемые для высокой содержания изображения C. elegans эмбриогенеза. (A) Схемы иллюстрируют трансгены, используемые для построения герм-слоя (вверху) и морфогенеза (внизу) штаммов. (B) Максимальная интенсивность проекционных панелей показывают время развития курса в Morphogenesis (вверху) и герметик слой (внизу) штаммов. Вентральный вид отображается, как показано в схемах (слева). Время относительно стадии запятой (t no 0), которая легко идентифицируется в обоих штаммах. Шкала бар 10 мкм. Рисунок воспроизводится с разрешения Ван и др.10. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой цифры.

Figure 3
Рисунок 3. Пользовательская программа обрезки изолирует и ориентирует отдельные эмбрионы из полей изображений. (A) Схема иллюстрирует особенности пользовательской программы обрезки эмбрионов и выделяет два варианта доступа к этой программе: удобный интерфейс GUI, который не требует опыта программирования и доступен на Зенодо (слева) и пакетная версия обрезки программы, которая требует опыта Python и доступна на Github (справа). (B) Графика обобщает автоматизированный алгоритм обрезки - двоичная маска генерируется из 8-битных ярких изображений и отдельных эмбрионов обнаруживаются, обрезаются и ориентированы вдоль передней задней оси. Шкала бар 10 мкм. (C) Схема подробно процедура, используемая для итеративного обнаружения эмбрионов в двоичной маске. (D) Схема иллюстрирует метод, используемый для ориентации эмбрионов вдоль передней задней оси. Панели B-D воспроизводится с разрешения Wang et al.10. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой цифры.

Figure 4
Рисунок 4. Пользовательский макрос ImageJ позволяет визуализировать данные скрининга РНК, генерируя композитные файлы для каждого состояния. (A) Показаны эмбрионы для трех примеров условий RNAi из набора 40-генных тестов (см. Wang et al.10,11 для полного набора данных) (справа), которые подчеркивают различные фенотипы подписи, которые получены для каждого состояние и воспроизводимость фенотипов в каждом состоянии. Панель была адаптирована с разрешения Wang et al.10. (B) Панель иллюстрирует, как пользовательский макрос ImageJ (OpenandCombine-embsV2.ijm) массивы эмбрионов из данного состояния RNAi в составной файл ImageJ, который массивов яркое поле и максимальная интенсивность прогнозов для каждого эмбриона в каждый момент времени. Хотя выделен только один пример, этот макрос может компилировать данные для многих условий RNAi одновременно. ФотоJ макрос доступен на Зенодо12. Шкала бар 10 мкм. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой цифры.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Эта работа описывает набор инструментов и методов, которые были разработаны для того, чтобы позволить более масштабные усилия по профилировать функции генов в эмбриональном развитии в C. elegans. Наш метод полувысокой пропускной записи позволяет 3D-замедленной визуализации эмбрионального развития при разрешении 20 мин для 80-100 эмбрионов в одном эксперименте. Хотя этот протокол может быть адаптирован для использования с любым желаемым штаммом маркера (ы), эта работа демонстрирует потенциал метода с использованием двух пользовательских штаммов, разработанных для мониторинга событий во время эмбриогенеза: (1) штамм репортера зародышевого слоя, в котором ткани конкретные промоутеры диск выражение флуоресцентных гистонов, чтобы отметить эндодерм, мезодерм и эктодерм ядра, и (2) штамм репортера морфогенеза, который использует эпидермальные и нейрональные промоутеры для привода выражение флуоресцентных маркеров в клетках-соединениях и плазменной мембраны. С помощью изображения двух штаммов, последствия молекулярных возмущений на спецификации судьбы клеток и морфогенетических событий могут быть захвачены с замечательной детализацией. Для решения проблем, связанных с количеством данных, генерируемых этим методом, были разработаны пользовательские инструменты для оптимизации обработки и визуализации данных. Первый инструмент выседает отдельные эмбрионы из поля эмбрионов в 3D-последовательности промежуток времени, а также вращая эмбрионы к стандартной передне-задней ориентации и выполняя фоновое вычитание, коррекцию дрейфа и коррекцию затухания. Эта программа была упакована в качестве удобного графического интерфейса (https://zenodo.org/record/3235681#.XPAnn4hKg2w) и исходный код и более продвинутая версия пакетирования программы для пользователей Python (github.com/renatkh/embryo_crop.git) предоставляется10,12,13. Наконец, чтобы визуализировать эти обработанные данные в значимом формате, был разработан макрос ImageJ; это позволяет пользователю визуализировать все эмбрионы из данного состояния РНК в многопанельном фильме, который показывает яркое поле и максимальную интенсивность проекции для каждого эмбриона в каждую точку времени. Вместе, штаммы, протокол, и инструменты обработки данных, прилагать усилия для изучения C. elegans эмбриогенеза в более крупных масштабах более осуществимой деятельности.

Хотя это просто реализовать в целом, полу-высокой пропускной способ приобретения описано здесь требует внимания к нескольким критическим деталям, которые обсуждаются ниже. Во-первых, пользователи должны иметь доступ к конфокального микроскопа с точностью доступа к точкам посещения, которые могут быть оснащены многослойной пластины держателя. Наиболее важным фактором для этого протокола является то, что микроскоп будет поддерживаться в комнате, контролируемой температурой. Хотя многие микроскопы имеют способность нагреваться, большинство из них не может надежно охлаждаться, таким образом, температура окружающей среды должна быть адаптирована для поддержания постоянной дружественной температуры C. elegans. Для этого, комната визуализации проводится при 16 градусах Цельсия. Область образца прибора нагревается до 21-23 градусов по Цельсию во время визуализации. Колебания комнатной температуры могут повлиять на время развития и тонко изменить точность фокусной плоскости во время посещения точки и следует избегать как можно больше. Обратите внимание, что бег при температурах выше 23 градусов по Цельсию может привести к значительному всплеску эмбриональной летальности для условий контроля и не рекомендуется. Другим ключевым фактором является отбор эмбрионов и рассеиrevealingесь во время вскрытия. Следует позаботиться о том, чтобы избежать переноса старых эмбрионов в колодцы для визуализации, поскольку при вылуплении животные, как правило, свистят соседние эмбрионы вне поля зрения; заболеваемость этим уменьшается за счет включения анестезии в средствах массовой информации. Дисперсия эмбрионов, чтобы избежать больших скоплений эмбрионов, также является критической переменной. Clumping, как правило, происходят, когда эмбрионы передаются в скважины в капиллярных pipets, которые слишком тонко вытягивается, или когда эмбрионы не достаточно рассеяны во время вскрытия. Другим соображением является то, что выбор точек и координационная настройка плоскости требует времени. Пластина не удерживается на льду во время этого процесса, поэтому эмбрионы начинают развиваться немедленно. Для пользовательских штаммов маркера, используемых в этом исследовании, есть около 90 минут окна после пластины удаляется со льда для выполнения сканирования пластин и выбора точек до маркеры начинают быть выражены. Это достаточное время для создания на нашем инструменте с этими штаммами, но другие микроскопы и штаммы могут предложить дополнительные проблемы времени, которые потребуют устранения неполадок. Наконец, метод, который мы описываем, использует 60-кратную цель нефти для сбора z-стеков 50 месторождений с интервалом 20 минут. Как мы подчеркиваем, временное разрешение может быть увеличено за счет уменьшения количества изображений полей. Например, 10 полей можно отобразить с разрешением 4 мин. Второй альтернативой для увеличения временного разрешения является использование более низкого увеличения, высокочисленной цели диафрагмы; в этом случае, большее поле зрения позволяет изображения большого количества эмбрионов при более высоком разрешении времени только с умеренным сокращением пространственного разрешения.

Для обеспечения обработки и визуализации данных в более широком масштабе мы создали пользовательские инструменты и сделали их доступными в свободном доступе. Наиболее широко полезным инструментом является пользовательский графический интерфейс, который не требует опыта программирования для работы. GUI может быть использован для выращивания и ориентации эмбрионов на всех стадиях развития и совместим со всеми маркерами, что делает его полезным не только для биологов развития, но и для исследователей, изучающих процессы в раннем эмбрионе. Поскольку выход ГРАФИЧЕСКОго интерфейса точно обрезан, ориентирован, масштабируется, корректируется в дрейф, данные могут быть легко направлены в автоматизированный конвейер анализа, что делает этот инструмент полезным для анализа прошлых и будущих данных; при использовании соответствующих штаммов, полученные файлы данных могут быть использованы в качестве ввода для существующих автоматизированных режимов анализа, таких как инструменты выравнивания эмбриогенеза25. Для того, чтобы использовать программу, важно, чтобы пользователи знали, что алгоритм обрезки требует яркого поля или DIC изображения, которые будут собраны для каждого шага и времени. Кроме того, пользователи должны отметить, что алгоритм передней задней ориентации структурирован на основе распределения красного сигнала в зародышевом слое репортера и морфогенеза доклад штаммов, показанных в этой работе. Таким образом, точность ориентации AP в других штаммах маркера должна оцениваться на индивидуальной основе. GUI был протестирован с данными, собранными на трех различных конфокальных изображений платформ и совместим по всем направлениям для стеков с несколькими тиффами и тифф серии. В дополнение к удобной для пользователя версии, исходный код для ГРАФИЧЕСКОго интерфейса и пакетная версия этой программы также были доступны, с оговоркой, что опыт программирования не требуется, и файловые структуры и именования конвенций должны быть соблюдены. Наконец, макрос обработки ImageJ был построен, чтобы взять сырые стеки изображений для всех эмбрионов, в каждом состоянии РНК, и составить информационный массив, чтобы показать все эмбрионы для этого состояния в ярком поле и флуоресценции максимальной интенсивности проекции в каждый момент времени. Этот инструмент может быть адаптирован к спецификациям пользователя и является полезным макросом, чтобы сделать исследование данных и оценку контроля качества проще.

Вместе, полу-высокой пропускной способ съемки метод а также эмбриона обрезки и обработки изображений инструментов, описанных в настоящем процессе будет способствовать анализу C. elegans эмбрионального развития с использованием различных мутантов, возмущений и маркер штаммов. В нашей собственной лаборатории, крупномасштабный экран, используя эти методы для пленки эмбрионов из двух пользовательских инженерии штаммов, описанных здесь после нокдауна 2000 генов, необходимых для развития, в настоящее время ведется. Наконец, данные этих усилий послужат еще одним ресурсом для активизации усилий по пониманию спецификации судьбы клеток и морфогенетических событий во время эмбриогенеза.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Ни один

Acknowledgments

S.D.O. была поддержана Национальным институтом общих медицинских наук под эгидой Калифорнийского университета Сан-Диего Институциональные исследования и академическое развитие карьеры премии (NIH/ IRACDA K12 GM068524). A.D. и K.O. были поддержаны Институтом Людвига по исследованию рака, который также предоставил им финансирование исследований, используемых для поддержки этой работы. Мы благодарны Эндрю Чисхолму за его советы на ранних этапах этого проекта, Рональду Биггсу за вклад в этот проект после начальной стадии разработки метода, и Дэйву Дженкинсу и Энди Шиау за поддержку и доступ к открытию малых молекул высокососодержание системы визуализации группы.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Aspirator Tube Assembly Drummond Scientific 2-000-000
Calibrated Pipette (25 mL) Drummond Scientific 2-000-025
Cell Voyager Software Yokogawa Electric Corp Included with CV1000
Conical Tube (15 mL) USA Scientific 1475-0501
CV1000 Microscope Yokogawa Electric Corp CV1000
Depression slide (3-well) Erie Scientific 1520-006
Dissection Microscope Nikon SMZ-645
Eppendorf Centrifuge 5810R Eppendorf 5811 07336
ImageJ/FIJI Open Source https://imagej.net/Fiji
M9 Buffer Lab Prepared https://openwetware.org/wiki/M9_salts
Microcentrifuge Tube (1.5 mL) USA Scientific 1615-5500
Microseal F-foil Seal Bio-Rad MSF1001
NGM Plates Lab Prepared http://www.wormbook.org/chapters/www_strainmaintain/strainmaintain.html#d0e214
Scalpel #15 Bard Parker REF 371615
Sensoplate Plus, 384 Well, F-bottom, Glass Bottom Greiner Bio-One 781855
Tetramisole Hydrochloride Sigma Aldirch T1512-10G
Tweezers, Dumont #3 Electron Microscopy Sciences 0109-3-PO
U-PlanApo objective (10× 0.4 NA) Olympus 1-U2B823
U-PlanApo objective (60× 1.35 NA) Olympus 1-U2B832

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Armenti, S. T., Nance, J. Adherens junctions in C. elegans embryonic morphogenesis. Sub-Cellular Biochemistry. 60, 279-299 (2012).
  2. Chisholm, A. D., Hsiao, T. I. The Caenorhabditis elegans epidermis as a model skin. I: development, patterning, and growth. Wiley Interdisciplinary Reviews Developmental Biology. 1 (6), 861-878 (2012).
  3. Jackson, B. M., Eisenmann, D. M. beta-catenin-dependent Wnt signaling in C. elegans: teaching an old dog a new trick. Cold Spring Harbor Perspectives In Biology. 4 (8), 007948 (2012).
  4. Lamkin, E. R., Heiman, M. G. Coordinated morphogenesis of neurons and glia. Current Opinion in Neurobiology. 47, 58-64 (2017).
  5. Loveless, T., Hardin, J. Cadherin complexity: recent insights into cadherin superfamily function in C. elegans. Current Opinion in Cell Biology. 24 (5), 695-701 (2012).
  6. Priess, J. R. Notch signaling in the C. elegans embryo. WormBook. , 1-16 (2005).
  7. Spickard, E. A., Joshi, P. M., Rothman, J. H. The multipotency-to-commitment transition in Caenorhabditis elegans-implications for reprogramming from cells to organs. FEBS Letters. 592 (6), 838-851 (2018).
  8. Vuong-Brender, T. T., Yang, X., Labouesse, M. C. elegans Embryonic Morphogenesis. Current Topics in Developmental Biology. 116, 597-616 (2016).
  9. Wang, J. T., Seydoux, G. Germ cell specification. Advances in Experimental Medicine and Biology. 757, 17-39 (2013).
  10. Wang, S., et al. A high-content imaging approach to profile C. elegans embryonic development. Development. 146 (7), (2019).
  11. Wang, S., Ochoa, S., Khaliullin, R. N., Gerson-Gurwitz, A., Hendel, J. M., Zhao, Z., Biggs, R., Chisholm, A. D., Desai, A., Oegema, K., Green, R. A. Dryad Digital Repository. , (2019).
  12. Wang, S., Ochoa, S., Khaliullin, R., Gerson-Gurwitz, A., Hendel, J., Zhao, Z., Biggs, R., Chisholm, A., Desai, A., Oegema, K., Green, R. A. Zenodo. , (2018).
  13. Khaliullin, R. N. Software to crop C. elegans embryos from multi-channel microscopy images. , Available from: https://github.com/renatkh/embryo_crop (2018).
  14. Schindelin, J., et al. Fiji: an open-source platform for biological-image analysis. Nature Methods. 9 (7), 676-682 (2012).
  15. Schneider, C. A., Rasband, W. S., Eliceiri, K. W. NIH Image to ImageJ: 25 years of image analysis. Nature Methods. 9 (7), 671-675 (2012).
  16. Chisholm, A. D., Hardin, J. Epidermal morphogenesis. WormBook. , 1-22 (2005).
  17. Sulston, J. E., Schierenberg, E., White, J. G., Thomson, J. N. The embryonic cell lineage of the nematode Caenorhabditis elegans. Developmental Biology. 100 (1), 64-119 (1983).
  18. Fakhouri, T. H., Stevenson, J., Chisholm, A. D., Mango, S. E. Dynamic chromatin organization during foregut development mediated by the organ selector gene PHA-4/FoxA. PLoS Genetics. 6 (8), (2010).
  19. Zhong, M., et al. Genome-wide identification of binding sites defines distinct functions for Caenorhabditis elegans PHA-4/FOXA in development and environmental response. PLoS Genetics. 6 (2), 1000848 (2010).
  20. Schmitz, C., Kinge, P., Hutter, H. Axon guidance genes identified in a large-scale RNAi screen using the RNAi-hypersensitive Caenorhabditis elegans strain nre-1(hd20) lin-15b(hd126). Proceedings of the National Academy of Sciences, USA. 104 (3), 834-839 (2007).
  21. Canny, J. A computational approach to edge detection. IEEE transactions on pattern analysis and machine intelligence. 8 (6), 679-698 (1986).
  22. Levin, M., Hashimshony, T., Wagner, F., Yanai, I. Developmental milestones punctuate gene expression in the Caenorhabditis embryo. Developmental Cell. 22 (5), 1101-1108 (2012).
  23. Packer, J. S., et al. A lineage-resolved molecular atlas of C. elegans embryogenesis at single cell resolution. BioRxiv. , (2019).
  24. Oegema, K., Hyman, A. A. Cell division. WormBook. , 1-40 (2006).
  25. Insley, P., Shaham, S. Automated C. elegans embryo alignments reveal brain neuropil position invariance despite lax cell body placement. PLoS One. 13 (3), 0194861 (2018).

Tags

Биология развития Выпуск 152 C. elegans эмбрион высокосодержание изображений эмбриогенез обработка изображений визуализация данных развитие эмбриональное развитие полу-высокой пропускной записи
Полу-высокой пропускной способ визуализации и инструментвизуализации данных для анализа <em>C. elegans</em> эмбрионального развития
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Khaliullin, R. N., Hendel, J. M.,… More

Khaliullin, R. N., Hendel, J. M., Gerson-Gurwitz, A., Wang, S., Ochoa, S. D., Zhao, Z., Desai, A., Oegema, K., Green, R. A. A Semi-high-throughput Imaging Method and Data Visualization Toolkit to Analyze C. elegans Embryonic Development. J. Vis. Exp. (152), e60362, doi:10.3791/60362 (2019).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter