Summary
الشامات الوراثية هي حالات الحمل البشري غير الطبيعية مع المسببات غير المتجانسة التي يمكن تصنيفها وفقا لخصائصها المورفولوجية ومساهمه الوالدين في الجينوم المولي. وفي هذا الصدد ، توصف بالتفصيل البروتوكولات المتعلقة بالتنميط الجيني للحمض النووي المتعدد الميكروي وتدفق الخلايا الخلوية من فورمالين-الانسجه المولية الثابتة من البارافين ، إلى جانب تفسير النتائج وتكاملها.
Abstract
الخلد hydatidiform (HM) هو الحمل البشري غير طبيعيه تتميز الانتشار المفرط تروفوبلاستيك والتنمية الجنينية غير طبيعيه. هناك نوعان من HM استنادا إلى التقييم المورفولوجية المجهرية ، كامله HM (اليه تبادل أليات) وجزئيه HM (PHM). ويمكن تقسيمها بشكل أكبر علي أساس مساهمه الوالدين في الجينوم المولي. هذا التوصيف لل HM ، من خلال تحليلات المورفولوجية والنمط الجيني ، هو أمر حاسم لأداره المرضي والفهم الأساسي لهذه الامراض المثيرة للاهتمام. ومن الموثق جيدا ان التحليل المورفولوجية لصاحبه الجلالة يخضع لتقلبات واسعه بين المراقبين وليس كافيا من تلقاء نفسه لتصنيفها بدقه في اليه تبادل أليات و PHM وتمييزها عن الإجهاض المائي غير المولي. يتم اجراء تحليل التنميط الجيني في الغالب علي الحمض النووي والانسجه من فورمالين-الثابتة البارافين-جزءا لا يتجزا من المنتجات (FFPE) من الحمل ، والتي لديها اقل من الجودة المثلي ، التالي قد يؤدي إلى استنتاجات خاطئه. في هذه المقالة ، يتم توفير بروتوكولات مفصله للتحليل الجيني متعدد الخلايا وتحليلات التدفق الخلوي للانسجه المولية FFPE ، جنبا إلى جنب مع تفسير نتائج هذه الأساليب ، واستكشاف الأخطاء وإصلاحها ، والتكامل مع التقييم المورفولوجية ، p57KIP2 مناعي ، والتهجين في الموقع (FISH) للوصول إلى تشخيص صحيح وقوي. وفي هذا الصدد ، يتقاسم المؤلفون الأساليب والدروس المستفادة في السنوات العشر الماضية من تحليل ما يقرب من 400 منتجا من الحمل.
Introduction
والخلد الورم (HM) هو الحمل البشري غير طبيعيه تتميز النمو الجنيني غير طبيعي ، فرط انتشار تروفوبلاست ، وانحطاط هيدروبيك من الزغب المشيميه (CV). تاريخيا ، كانت HM تنقسم إلى نوعين ، كامله HM (اليه تبادل أليات) وجزئيه HM (PHM) استنادا فقط علي التقييم المورفولوجية1. ومع ذلك ، فقد تبين ان التقييم المورفولوجية وحده لا يكفي لتصنيف HM في النوعين الفرعيين (اليه تبادل أليات و phm) وتمييزها عن الإجهاض غير المولي2،3،4.
لان اليه تبادل أليات و PHM لها ميول مختلفه إلى الأورام الخبيثة ، ولذلك فمن المهم ان تحدد بدقه نوع النمط الجيني من HM لتوفير المتابعة المناسبة والاداره للمرضي. ونتيجة لذلك ، تم في العقود الماضية وضع وتطوير عده منهجيات لغرض تحديد مساهمه الوالدين في الانسجه المولية والتوصل إلى تصنيف صحيح لصاحبه الجلالة. وتشمل هذه تحليل النمط الحقيقي ، وتعدد الكروموسومات النطاقات ، البشرية مستضد الكريات البيضاء (هلا) الكتابة المصلية ، وتقييد طول الجزء المتعدد الاشكال ، وعدد متغير من تكرار ترادفي ، التنميط الجيني الميكروي ، والتدفق الخلوي ، و p57 KIP2 مناعي. وقد سمح هذا التقسيم الدقيق لمفاهيم HM استنادا إلى مساهمه الوالدين في الجينوم الخاصة بهم ، علي النحو التالي: اليه تبادل البيانات ، والتي هي أحاديه اللون andropermic أو مضاعف التشتت اندروجيني ، و phm ، والتي هي triploid ، التشتت في 99 ٪ و أحاديه الميكروفون في 1 ٪ من الحالات5،6،7،8. وعلاوة علي ذلك ، هناك نوع آخر من النمط الجيني من HM التي ظهرت في العقدين الماضيين ، وهو ثنائي اللون ثنائيه اللون. وهذه الاخيره متكررة في معظمها وقد تؤثر علي فرد واحد من افراد الاسره (الحالات البسيطة) أو علي ما لا يقل عن فردين من الاسره (الحالات العائلية). هذه الشامات مضاعف ثنائي الطور غالبا ما تسببها طفرات متنحي في NLRP7 أو KHDC3L في المرضي9,10,11,12. Diploid ثنائي الطور HM في المرضي الذين يعانون من طفرات متنحي في NLRP7 يمكن تشخيصها بأنها اليه تبادل أليات أو phm عن طريق التحليل المورفولوجية وهذا يبدو ان تترافق مع شده الطفرات في المرضي13,14. بالاضافه إلى تصنيف HM وفقا لأنماطها الجينية ، سمح إدخال واستخدام العديد من أساليب التنميط الجيني بالتمييز بين مختلف الكيانات المولية من الإجهاض غير المولي ، مثل التصاميم ثنائيه اللون أخرى أنواع التصاميم5,15. هذه المفاهيم قد يكون لها بعض الانتشار تروفوبلاست والشكل الخسيس الشاذة التي تحاكي ، إلى حد ما ، بعض الميزات المورفولوجية من HM.
الغرض من هذه المادة هو توفير بروتوكولات مفصله لتعدد النماذج الجينية وتدفق الخلوية من formalin-الثابتة البارافين-جزءا لا يتجزا من الانسجه (FFPE) ، وتحليلات شامله لنتائج هذه الأساليب وتكاملها مع أساليب أخرى التشخيص الصحيح والقاطع للانسجه المولية.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
وقد وافق مجلس المراجعة المؤسسية في مكغيل علي هذه الدراسة البحثية. وقدم جميع المرضي موافقه خطيه للمشاركة في الدراسة والحصول علي منتجات FFPE من الحمل (POCs) استردادها من أقسام الامراض المختلفة.
ملاحظه: في حين ان هناك العديد من الطرق لتحديد النظام الجيني واللوني بواسطة قياس التدفق الخلوي ، فان البروتوكولات المقدمة هنا تصف طريقه واحده للتحليل باستخدام منصة واحده لكل منهما.
1-التنميط الجيني
-
اختيار أفضل كتله FFPE
- لكل منتج ffpe من الحمل (المركز) ، واعداد المقاطع الملونة 4 μm-سميكه و يوزين (H & E) الملطخة كما هو موضح في الأقسام 1.2 و 1.3 ، واحد لكل كتله المتاحة ، للتقييم المورفولوجية عن طريق المجهر.
- باستخدام الشرائح H & E والمجهر الضوئي ، حدد كتله ffpe التي لديها أكبر كميه من الزغب المشيميه (cv) ، وإذا كان ذلك ممكنا ، الكتلة التي لديها CV منفصلة عن ، وليس المخلوطة مع ، انسجه الام.
-
اجتزاء
- ضع الكتلة المختارة علي الجليد لمده 15 دقيقه لتسهيل العملية.
- ضبط ميكروتومي لخفض المقاطع التي هي 4 ميكرون سميكه للتقييم المورفولوجية المجهرية و 10 ميكرون سميكه لاستخراج الحمض النووي.
- وضع كتله الباردة في ميكروتومي وقطع مقطع واحد من كل كتله ل H & E تلطيخ و 10 − 30 أقسام من الكتلة المختارة ، اعتمادا علي كميه السيرة الذاتية في كتله ، لاستخراج الحمض النووي.
ملاحظه: للكتل التي هي كامله من السيرة الذاتية ، 10 أقسام كافيه لاستخراج الحمض النووي. إذا كان حوالي 10 ٪ فقط من كتله يحتوي علي السيرة الذاتية بينما الباقي هي انسجه الام ، ثم 20 − 30 الأقسام مطلوبه لضمان كميات كافيه من الحمض النووي. - باستخدام ملقط ، نقل كل قسم إلى 45 درجه مئوية حمام المياه. التقط القسم من حمام المياه مع شريحة مشحونة بشكل إيجابي (جدول المواد) التي سبق وسمها برقم تعريف العينة باستخدام قلم رصاص.
- ضع الشرائح التي تحتوي علي الأقسام في فرن عند 65 درجه مئوية للسماح للأقسام بالانضمام إلى الشرائح. الحفاظ علي الشرائح ل H & E في الفرن لمده 25 دقيقه. الحفاظ علي الشرائح لاستخراج الحمض النووي في الفرن لمده 20 دقيقه.
ملاحظه: وقت الحضانة أقصر يجعل الانسجه اقل قليلا ملتصقة الشرائح التالي يسهل أزاله انسجه الام.
-
H & تلطيخ
- السماح للشرائح لتبرد إلى درجه حرارة الغرفة (10 دقيقه).
- اعداد كاشف
- اعداد ايوسين Y حل العمل (0.25%) وفقا للجدول 1. يخلط جيدا ويخزن في درجه حرارة الغرفة.
- اعداد العمل الحل الهيلوكسيلين عن طريق تمييع حل الأسهم من هيتوكوكسيلين 5x في الماء (اي ، مزيج 80 mL من الماء مع 20 مل من الهيوكسيلين).
ملاحظه: التفاف حل الأسهم من الهيلوكسيلين في إحباط للتخزين.
- اعداد الجرار تلطيخ مع الكواشف الصحيحة تحت غطاء الدخان وفقا للجدول 2.
- قم باجراء تلطيخ H & E عن طريق دمج الشرائح في الجرار تلطيخ المناسبة للفترة الزمنيه الصحيحة وفقا للجدول 2.
- جبل الأقسام 4 μm للتحليل المورفولوجية مع تصاعد المتوسطة و كوفيرسليب مع الزجاج الشفتين (جدول المواد).
ملاحظه: لا ينبغي ان تكون الأقسام 10 μm لتنميط الجينات الشفاه. - ترك المقاطع 10 μm تحت غطاء الدخان لمده لا تقل عن 3 ساعات من أجل الروائح السامة أكسلين لتبديد.
تحذير: جميع الخطوات تلطيخ تحتاج إلى ان يتم تنفيذها تحت غطاء الدخان. المنتجات اكسيلين تحتاج إلى ان تبقي تحت غطاء محرك السيارة في جميع الأوقات لان الروائح اكسيلين هي سامه. وعلاوة علي ذلك ، تحتاج إلى التخلص من اكسيلين و الهيلوكسيلين في حاويات خاصه. وبمجرد امتلاء هذه الحاويات ، فانها تحتاج إلى التخلص منها علي النحو الموصي به من قبل منظمه سلامه المختبر.
| كاشف | كميه |
| حل أسهم ايزين Y (1%) | 250 مل |
| 80 ٪ الايثانول | 750 مل |
| حمض الخليك الجليدي (مركز) | 5 مل |
الجدول 1: ايوسين Y حل العمل (0.25%) اعداد.
| الكاشف المستخدمة (100 mL لكل بن) | مده |
| 1) اكسيلين | 5 دقائق |
| 2) اكسيلين | 5 دقائق |
| 3) 100 ٪ الايثانول | 2 دقيقه |
| 4) 95 ٪ الايثانول | 2 دقيقه |
| 5) 70 ٪ الايثانول | 2 دقيقه |
| 6) 50 ٪ الايثانول | 2 دقيقه |
| 7) الماء المقطر | 5 دقائق |
| 8) الهيلوكسيلين | 4 دقائق |
| 9) الماء المقطر | 5 دقائق |
| 10) ايوسين | 1 دقيقه |
| 11) 95 ٪ الايثانول | 5 دقائق |
| 12) 100 ٪ الايثانول | 5 دقائق |
| 13) اكسيلين | 5 دقائق |
| 14) اكسيلين | 5 دقائق |
الجدول 2: الكواشف والمدد الخاصة ببروتوكول التلطيخ H & E.
-
عزل السيرة الذاتية
- تحت المجسم الفراغي الخفيف ، استخدم ملقط وقطع صغيره من مناديل مبلله بالماء (جدول المواد) لكشط الانسجه الاموميه غير المرغوب فيها من H & E-الملون 10 μm أقسام سميكه.
ملاحظه: الهدف النهائي هو الحفاظ علي اي شيء ولكن السيرة الذاتية أو اغشيه الجنين (عند الحاضر) علي الشرائح التالي لأزاله جميع الانسجه الأخرى. قد تحتاج هذه الخطوة الكثير من الوقت والصبر ، اعتمادا علي كتله ، كما انه يتطلب اهتماما دقيقا للتفاصيل. - يجب علي الشخص الثاني التحقق من الشرائح بعد التنظيف للتاكد من خلوها من انسجه الام.
- التقاط صور للشرائح التي تم تنظيفها أو توثيق ما يلي للمساعدة في تفسير البيانات: 1) ما إذا كان من الصعب تنظيف الانسجه ، النزفية ، أو نظيفه جدا ، 2) عدد الأقسام المستخدمة ، و 3) الكمية التقريبية من الانسجه المنظفة.
ملاحظه: يقدم الشكل 1 مثالا علي شريحة سهله التنظيف. بالنسبة للكتلة التي تحتوي علي تقريبا هذا المبلغ من السيرة الذاتية ، 10 أقسام كافيه لاستخراج الحمض النووي. الشريحة في الشكل 2 لديها عدد قليل جدا من السيرة الذاتية التي تتداخل مع انسجه الام ، مما يجعل من الصعب جدا وتستغرق وقتا طويلا لتنظيف. بالنسبة للكتلة التي تحتوي علي تقريبا هذا المبلغ من السيرة الذاتية ، هناك حاجه إلى 30 قسما لاستخراج الحمض النووي. - جمع السيرة الذاتية باستخدام قطعه مبلله صغيره من مناديل ورقيه. باستخدام ملقط ، المسيل للدموع قطعه صغيره من مناديل مبلله ورقه واستخدامها لجمع السيرة الذاتية.
- وضع قطعه من المناديل الورقية مع السيرة الذاتية المرفقة في أنبوب 1.5 مل الموسومة.
- تقليل كميه المناديل الورقية المستخدمة في هذه الخطوة لان الكثير قد تسد عمود استخراج الحمض النووي التالي تقليل الكمية النهائية من الحمض النووي الذي تم جمعه. في المتوسط ، وتهدف إلى استخدام اقل من سبع قطع صغيره من مناديل ورقيه لكل عينه. إذا لم يكن ذلك ممكنا بسبب وجود كميات كبيره من السيرة الذاتية ، وتقسيم العينة بين اثنين من أنابيب لتسهيل استخراج.
- تحت المجسم الفراغي الخفيف ، استخدم ملقط وقطع صغيره من مناديل مبلله بالماء (جدول المواد) لكشط الانسجه الاموميه غير المرغوب فيها من H & E-الملون 10 μm أقسام سميكه.
الشكل 1: الشريحة التمثيلية للنمط الجيني. الأعلى: الشريحة التي تحتاج إلى "تنظيف" لتصبح خاليه من انسجه الام. أسفل: نفس الشريحة المعروضة بعد ان تم تنظيفه والآن يحتوي علي اي شيء ولكن السيرة الذاتية لاستخراج الحمض النووي. يرجى النقر هنا لعرض نسخه أكبر من هذا الرقم.
الشكل 2: الشريحة التمثيلية للنمط الجيني. الأعلى: الشريحة التي تحتاج إلى "تنظيف" لتصبح خاليه من انسجه الام. أسفل: نفس الشريحة المعروضة بعد ان تم تنظيفه والآن يحتوي علي اي شيء ولكن السيرة الذاتية لاستخراج الحمض النووي. يرجى النقر هنا لعرض نسخه أكبر من هذا الرقم.
- اتبع بروتوكول استخراج الحمض النووي من مجموعه FFPE (جدول المواد) لاجراء استخراج الحمض النووي.
ملاحظه: بعض مجموعات يوصي باستخدام 15 − 20 μL من العازلة التملص للهلاك النهائي. من الخبرة ، والتملص مع 15 μL من المخزن المؤقت الشطف يعمل بشكل جيد لمعظم العينات. قد يتم اعداد المخففات من الحمض النووي المخزون حسب الحاجة.
-
التحديد الكمي للحمض النووي
- باستخدام جهاز المختبر الطيفي ، وتحميل 1 μL من الحمض النووي وقياس الامتصاص في 260 نانومتر للقياس الكمي.
- تحميل 1 μL من الحمض النووي علي 2 ٪ هلام اجنشا وتشغيل الكهربائي هلام في الجهد من 80 − 100 V للتقييم النوعي.
- استنادا إلى نتائج الخطوات ال1.6.1ه وال1.6.2ه ، اختر حجم الحمض النووي الذي سيتم استخدامه في مكبر الصوت المتعدد التكرار القصير الترادفي (STR) لتفاعل البلمره المتسلسل (PCR). تهدف إلى استخدام الحد الأدنى من 1000 ng من الحمض النووي في التضخيم PCR الذي يلي.
ملاحظه: الشكل 3 يوضح أمثله تمثيليه من الهلام مع تركيزات الحمض النووي (استنادا إلى نتائج الطيف الطيفي) ، وحجم محلول الحمض النووي التي يوصي بها لمتعددة شارع PCR الذي يلي.
الشكل 3: هلام تمثيلي لتحديد كميه الحمض النووي. وتشمل تركيزات كل حمض نووي ، كما تقاس باستخدام مقياس طيفي ، والكميات المستخدمة لمتعدد PCR. يرجى النقر هنا لعرض نسخه أكبر من هذا الرقم.
-
التضخيم PCR
- أداء التنميط الجيني الميكروي الفلوري باستخدام نظام متعددالاستعمالات (جدول المواد).
- استخدام الشروط PCR المبينة في الشكل 4 لتضخيم pcr باستخدام متعددة STR النظام (جدول المواد).
ملاحظه: وتستخدم الإشعال التالية في هذا النظام STR متعددة: D18S51 ، D21S11 ، TH01 ، D3S1358 ، بنتا E ، FGA ، TPOX ، D8S1179 ، vWA ، Amelogenin ، CSF1PO ، D16S539 ، D7S820 ، D13S317 ، D5S818 ، وبنتا د.
الشكل 4: شروط دوره PCR لنظام الإرسال المتعدد STR. يرجى النقر هنا لعرض نسخه أكبر من هذا الرقم.
-
حل المنتجات PCR بالكهربي الشعرية.
- تعليق 1 μL من كل عينه تضخيمها في 0.5 μL من الممر القياسي الداخلي لنظام تعدد الإرسال و 9.5 μL من formamide عاليه الأيونات (جدول المواد).
- قم بتشغيل العينات من خلال أداه الكهربي الشعرية (جدول المواد) باستخدام مصفوفة فصل مناسبه (جدول المواد) للاداه ومجموعه صبغ نظام تعدد الإرسال.
- تحليل البيانات
- تحليل البيانات باستخدام برنامج تحليل جزء من الحمض النووي ومقارنه الاللات الخاصة بالجينات الابويه لتحديد أصلها.
- قم باعداد معيار الحجم.
ملاحظه: وهذا يسمح للبرنامج للتعرف علي السلم الذي يستخدم في متعددة STR النظام ، وتعيين باسيبيرس إلى الرموز علي أساس السلم. الخطوات التالية هي لبرنامج واحد محدد (جدول المواد) ولكن قد تكون مساعده لاعداد أنواع أخرى من البرامج أيضا.- افتح البرنامج. انقر علي بدء مشروع جديد ثم علي معيار حجم جديد.
- إعطاء الحجم القياسي للاسم (علي سبيل المثال ، ABI_600).
- في المربع المسمي ادخل التعريف القياسي للحجم الجديد: ادخل ما يلي: 60 ، 80 ، 100 ، 120 ، 140 ، 160 ، 180 ، 200 ، 225 ، 250 ، 275 ، 300 ، 325 ، 350 ، 375 ، 400 ، 425 ، 450 ، 475 ، 500 ، 550 ، 600. ثم انقر علي أضافه حجم (s).
ملاحظه: ستظهر الأرقام التي تم إدخالها تحت المربع الموجود علي اليمين ، والذي يسمي " التعريف القياسي للحجم الحالي " (انظر الشكل 5). - انقر علي حفظ.
- لاستيراد وتحليل ملف ، انقر فوق أضافه ملفات، واختر ملف fsa ليتم تحليلها. انقر علي أضافه الملفات المحددة ثم علي OK. ثم اتبع الخطوات التالية:
- حدد موقع العمود القياسي للحجم واختر ABI_600 (أو أيهما اعطي الاسم إلى معيار الحجم).
- تحت أسلوب التحليل، انقر علي تغيير الحجم الافتراضي-الحزب التقدمي الواحد ثم انقر علي زر تحليل الخضراء.
- الملف جاهز الآن للعرض. اضبط خيارات العرض لعرض البيانات حسب الرغبة.
- استكشاف الأعطال وإصلاحها-طريقه التحليل
ملاحظه: قد يفشل البرنامج في بعض الأحيان في تحديد القمم ومحاذاتها بشكل صحيح. يحدث هذا عندما تكون القمم اما منخفضه جدا أو مرتفعه جدا. يمكن تصحيح طريقتي التحليل التالية لهذا ويجب ان يحاكم قبل ان يتم أعاده اختبار العينة.- طريقه التحليل 1 لقمم عاليه:
- انقر علي طريقه التحليل الجديدة واسمها قمم عاليه (أو اسم آخر وفقا لتفضيل شخصي).
- انقر علي نطاق ثم علي نطاق جزئي للتحليل والتحجيم. ثم اكتب في 100 لنقطه البداية وحجم البدء.
- بالنسبة لنقطه الإيقاف، ادخل 10,000. بالنسبة لحجم الإيقاف، ادخل 1000.
- ثم انقر علي مرتفعات الذروة الحد الأدنى وتغيير الأرقام بحيث عتبه الذروة للألوان كما يلي: الأزرق: 50. اللون الأخضر: 50. اصفر: 20; الأحمر: 100. البرتقالي: 5000.
- احفظ طريقه التحليل الجديدة.
- طريقه التحليل 2 لقمم منخفضه:
- انقر علي أسلوب تحليل جديد واسمه قمم منخفضه (أو اسم آخر وفقا لتفضيل شخصي).
- انقر علي نطاق ثم علي نطاق جزئي للتحليل والتحجيم. ثم اكتب في 100 لنقطه البداية وحجم البدء.
- بالنسبة لنقطه الإيقاف، ادخل 10,000. بالنسبة لحجم الإيقاف، ادخل 1000.
- ثم انقر علي علامات الجودة وتغيير نطاق التمرير بحيث يقرا من 0.5 إلى 1. تغيير نطاق جوده منخفضه بحيث يقرا من 0.0 إلى 0.0. تغيير تفترض خطيه إلى ما يلي: من (bp) 100.0 إلى (bp) 800.0.
- احفظ طريقه التحليل الجديدة.
ملاحظه: فمن الممكن الآن لأعاده تحليل ملف عن طريق اختيار قمم منخفضه أو قمم عاليه تحت أسلوب التحليل ومن ثم النقر علي زر تحليل الخضراء.
- طريقه التحليل 1 لقمم عاليه:
الشكل 5: لقطه شاشه تبين حجم محرر القياسية. يرجى النقر هنا لعرض نسخه أكبر من هذا الرقم.
2. تدفق الخلوي
-
اختيار كتله FFPE المثالي
- باستخدام الشرائح H & E والمجهر الضوئي ، حدد كتله FFPE التي لديها حوالي 50 − 70 ٪ من الانسجه التي تتكون من السيرة الذاتية.
ملاحظه: الشكل 6 مثال تمثيلي لكتله مناسبه لتحليل التدفق الخلوي ، كما انه يتكون من تقريبا 50 ٪ CV (النصف الأيمن من القسم) و 50 ٪ انسجه الام (النصف الأيسر). ووجود انسجه الام أمر مهم لأنها تشكل مراقبه داخلية لذروه الديبلويد. - للكتل التي لا تملك القدر المثالي من السيرة الذاتية ، إثراء لcv كما يتم تنفيذ العملية. للقيام بذلك ، وتحديد الجانب من المقاطع قطع حديثا يحتوي علي المزيد من السيرة الذاتية وفقا لشريحة H & E المقابلة. واستنادا إلى ذلك ، استخدم شفره لقطع النصف الآخر الذي يحتاج إلى التخلص منه من أجل إثراء السيرة الذاتية.
ملاحظه: يظهر الشكل 7 كتله ليس لديها السيرة الذاتية الكافية لتحليل تدفق الخلوي. لكتل مثل هذا واحد ، والأقسام تحتاج إلى ان تقطع بحيث يتم التخلص من النصف الذي يحتوي علي السيرة الذاتية اقل من أجل زيادة كميات السيرة الذاتية فيما يتعلق انسجه الام ، كما هو مبين في الشكل. تاكد من قطع المزيد من المقاطع لتعويض ما يتم تجاهله.
- باستخدام الشرائح H & E والمجهر الضوئي ، حدد كتله FFPE التي لديها حوالي 50 − 70 ٪ من الانسجه التي تتكون من السيرة الذاتية.
الشكل 6: القسم H &Amp; E الذي يمثل الكتلة التي تعتبر مثاليه لقياس التدفق الخلوي. يرجى النقر هنا لعرض نسخه أكبر من هذا الرقم.
الشكل 7: القسم H &Amp; E الذي يمثل كتله أكثر صعوبة لقياس التدفق الخلوي. يوضح هذا القسم H & E الممثل انه يجب استخدام النصف السفلي فقط من هذا القسم لتحليل التدفق الخلوي ، بهدف إثراء السيرة الذاتية. المنطقة المحددة ، المسمية "CV" ، تتكون في الغالب من السيرة الذاتية. الرجاء النقر هنا لعرض نسخه أكبر من هذا الرقم.
- اجتزاء
- ترك كتل علي الجليد لمده 15 دقيقه لتسهيل العملية.
- باستخدام أفضل كتله FFPE ممكن ، وقطع أربعه أقسام التي هي 50 μm سميكه (أو مقاطع سميكه 2 100 μm) باستخدام ميكروتومي.
ملاحظه: لقياس التدفق الخلوي فمن الأفضل ان يكون أكثر سمكا المقاطع. - في حاله ان كتله FFPE مثاليه غير متوفرة ، تهدف إلى الحفاظ علي نسبه السيرة الذاتية إلى انسجه الام مع ذلك. علي سبيل المثال ، إذا كان 30 ٪ فقط من كتله تتكون من السيرة الذاتية في حين ان بقية لديها انسجه الام ، ثم أزاله ما لا يقل عن نصف القسم الذي يحتوي علي انسجه الام واستخدام المزيد من الأقسام للتعويض (انظر الشكل 7).
- وضع المقاطع في الموسومة 15 مل أنابيب.
ملاحظه: تاكد من الشريط علي التسميات لان الكواشف العضوية المستخدمة في الخطوة التالية يمكن حل وأزاله الحبر.
- تدفق الخلوية بروتوكول من الانسجه FFPE
- المغادرون والجفاف
- قم باجراء الغسيل التالي (الجدول 3) تحت غطاء الدخان.
- ملء أنبوب 15 مل مع 6 مل من كاشف المناسبة ، وفقا للترتيب المقدمة في الجدول 3 ، ترك الأقسام في الكواشف لمده كل منهما ، ثم أزاله الكاشف باستخدام شفط فراغ وماصه الزجاج باستور.
- بين كل خطوه ، تراجع ماصه باستور الاولي في 70 ٪ الايثانول ، ثم في الماء المقطر ، ومن ثم المضي قدما إلى الخطوة التالية.
- كن حذرا جدا لا لأزاله قطع من الانسجه جنبا إلى جنب مع كاشف. أماله أنبوب 15 مل إلى زاوية 60 درجه لتسهيل شفط كاشف السائل دون انسجه الرسم.
تحذير: تحتوي السوائل المهملة علي اكسيلين وينبغي التخلص منها في حاويات نفايات اكسيلين.
- اعداد الحلول
- اعداد الحل سيترات عن طريق حل 2 غرام من حمض الستريك في 1 لتر من الماء المقطر مزدوجة. جلب الأس الهيدروجيني إلى 6. يخزن عند درجه حرارة 4 درجات مئوية.
- اعداد البيبسين حل عن طريق تذويب 0.01 غرام من البيبسين في 2 مل من 9 أجزاء لكل الف كلوريد الصوديوم ، pH 1.64. هذا لعينه واحده.
تحذير: البيبسين سامه ويمكن بسهوله تفريق وتصبح المحمولة جوا. ارتداء قناع عند التعامل مع البيبسين في شكل مسحوق ويمسح كل منطقه العمل بعد استخدامه. - بروبيديوم يوديد (PI)-ريبونكليوداز اعداد حل لعينه واحده.
- مزيج 50 μL من PI مع 450 μL من تلفزيوني (لتمييع 10x).
- أضافه 50 μL من ريبونكليوداز A (1 مغ/مل) إلى الخليط. تبقي ملفوفه في إحباط في جميع الأوقات.
- الهضم وتلطيخ
- أضافه محلول سيترات 4 درجه مئوية إلى أنابيب 15 مل ثم وضع في حمام مياه 80 درجه مئوية لمده 2 ساعة.
- دع المحلول يبرد إلى درجه حرارة الغرفة (15 دقيقه). أزاله الحل سيترات.
- أضافه 6 مل من 1x تلفزيوني, دوامه, والانتظار 1 − 2 دقيقه للسماح للانسجه ليستقر إلى أسفل. أزاله 1x تلفزيوني باستخدام شفط فراغ وماصه الزجاج باستور.
- أضافه 1 مل من محلول البيبسين (مسخن إلى 37 درجه مئوية) ومكان في 37 درجه مئوية حمام جاف لمده 30 دقيقه. دوامه كل 10 دقيقه. اعداد الحل في الدقيقة الاخيره 10 من هذه الحضانة.
- أضافه 6 مل من 1x تلفزيوني, دوامه, والانتظار 1 − 2 دقيقه للسماح للانسجه ليستقر إلى أسفل. أزاله 1x تلفزيوني باستخدام شفط فراغ وماصه الزجاج باستور.
- أضافه 550 μL من PI-ribonase حل ووضع العينات في حمام جاف 37 درجه مئوية لمده 30 دقيقه.
ملاحظه: عند هذه النقطة ، يمكن ان تكون ملفوفه العينات في إحباط وترك بين عشيه وضحيها في 4 درجه مئوية حتى صباح اليوم التالي. - تصفيه الحل من خلال شبكه الترشيح 48 μm. جمع الترشيح في أنابيب البوليسترين جولة القاع ، والتي يمكن استخدامها مع تدفق المضخم. استخدام ملقط لوضع 5 سم بنسبه 5 سم قطعه من شبكه الترشيح في الجزء العلوي من الأنبوب ، بحيث يمكن ان يكون السائل الأنابيب من خلال شبكه والي الأنبوب.
ملاحظه: العينات جاهزه الآن ليتم تشغيلها باستخدام مقياس التدفق الخلوي. الاحتفاظ بها ملفوفه في إحباط حتى انهم مستعدون لتشغيل.
- تشغيل العينات باستخدام مقياس التدفق الخلوي بمساعده فني منصة التدفق الخلوي للمؤسسة.
ملاحظه: يتم استخدام قناه PE للكشف عن الحمض النووي الملون PI ويجب تعيين معدل التدفق لإبطاء اثناء الاستحواذ. تاكد من ان يتم اختيار الجهد من هذا القبيل ان ذروه مضاعف هو تقريبا في 200 علي طول PE-A x-محور لتسهيل التحليل والتفسير. تهدف إلى تسجيل الحد الأدنى من 20,000 الاحداث لكل عينه.
- المغادرون والجفاف
| الكاشف المستخدمة (6 مل لكل منهما) | مده |
| 1) اكسيلين | 2 × 10 دقيقه |
| 2) 100 ٪ الايثانول | 2 × 10 دقيقه |
| 3) 95 ٪ الايثانول | 10 دقائق |
| 4) 70 ٪ الايثانول | 10 دقائق |
| 5) 50 ٪ الايثانول | 10 دقائق |
| 6) الماء المقطر | 2 × 10 دقيقه |
الجدول 3: الكواشف وفترات المغادرين والجفاف.
-
تحليل بيانات التدفق الخلوي
- تحليل البيانات باستخدام برنامج تحليل التدفق الخلوي (جدول المواد).
ملاحظه: الخطوات التالية هي لبرنامج واحد محدد (جدول المواد) ولكن قد تكون مساعده لاعداد أنواع أخرى من البرامج أيضا.- بعد تشغيل العينات علي مقياس التدفق الخلوي ، تحميل FCS 2.0 ملفات للتحليل.
- افتح برنامج تحليل التدفق الخلوي ، انقر علي الملف | مستند جديد.
- انقر فوق رمز الرسم البياني (
) ، ثم اسحب المؤشر لجعل مستطيل. - استعرض للحصول علي ملف FCS ثم انقر فوق فتح. علي طول المحور س ، انقر علي FCS-a ثم حدد PE-a.
- انقر فوق رمز نقطه المؤامرة (
) ثم قم بسحب المؤشر لإنشاء مستطيل آخر تحت مخطط الرسم البياني. ثم استعرض للحصول علي نفس الملف FCS التي تم تحديدها للرسم البياني. - تغيير المحور س من مؤامرة نقطه إلى pe-A ومحور ص إلى pe-W.
ملاحظه: يبين الشكل 8الف مظهر المؤامرات في هذه المرحلة. - انقر علي أيقونه المنطقة (
) ورسم مربع علي مؤامرة نقطه التي تبدا قبل ذروه مضاعف (حوالي 100 علي المحور س في الشكل 8ب) والتي تنتهي حول 700 علي محور x ، كما هو مبين في مؤامرة نقطه في الشكل 8 باء-
ملاحظه: الذروة مضاعف في الشكل 8 تقريبا في 200 علي المحور س. يتم اختيار هذا تعسفا كما يتم تسجيل العينات من خلال تدفق الخلوي ، وذلك ببساطه لتسهيل تحليل وتفسير النتائج. - انقر علي مؤامرة | حرر المناطق/البوابات، ثم اكتب R0 في الخلية المجاورة للخلية الG0ه ضمن الاستراتيجية. ثم انقر علي إغلاق.
- انقر في اي مكان علي الرسم البياني ، ثم علي مؤامرة | تنسيق الرسم/التراكب. تحت البوابة، حدد G0 = R0 ثم انقر علي OK.
ملاحظه: هذه هي الخطوة النابضة التي تسمح للمرء ان تصور أفضل القمم صيغه الصبغيه. يجب ان تبدو المدرج التكراري الآن مثل الرسم البياني في الشكل 8B. فمن الممكن ان تلعب حولها مع البوابة التي تم إنشاؤها (عن طريق تحريك مربع رسمها في الخطوة 2.4.1.7) من أجل التركيز علي مناطق محدده من مؤامرة نقطه. - لتسميه المؤامرات ، انقر فوق رمز منطقه النص (
) ، ثم اسحب المؤشر لإنشاء مربع في اعلي المستند ، ثم اكتب في المعلومات التالية: معرف المريض ، معرف الاتصال الشخصي والكتلة المستخدمة (لأنه قد يكون هناك عده كتل لواحده منها) ، والنسبة المئوية السيرة الذاتية الموجودة علي كتله ، والجهد المستخدم لتشغيل العينة ، والتاريخ.
- تحليل البيانات باستخدام برنامج تحليل التدفق الخلوي (جدول المواد).
) ، ثم اسحب المؤشر لجعل مستطيل.
) ثم قم بسحب المؤشر لإنشاء مستطيل آخر تحت مخطط الرسم البياني. ثم استعرض للحصول علي نفس الملف FCS التي تم تحديدها للرسم البياني.
) ورسم مربع علي مؤامرة نقطه التي تبدا قبل ذروه مضاعف (حوالي 100 علي المحور س في الشكل 8ب) والتي تنتهي حول 700 علي محور x ، كما هو مبين في مؤامرة نقطه في الشكل 8 باء-
) ، ثم اسحب المؤشر لإنشاء مربع في اعلي المستند ، ثم اكتب في المعلومات التالية: معرف المريض ، معرف الاتصال الشخصي والكتلة المستخدمة (لأنه قد يكون هناك عده كتل لواحده منها) ، والنسبة المئوية السيرة الذاتية الموجودة علي كتله ، والجهد المستخدم لتشغيل العينة ، والتاريخ.
الشكل 8: لقطه شاشه تعرض رسما بيانيا ومؤامرة نقطية لعينه تمثيليه غير مسوره (a) ومسوره (B). يرجى النقر هنا لعرض نسخه أكبر من هذا الرقم.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
تعقيد الانسجه المولية وحقيقة انها قد يكون لها مختلف الأنماط الجينية يتطلب تحليلا صارما واستخدام عده طرق مثل التقييم المورفولوجية ، p57 مناعي ، التنميط الجيني الميكروي ، والتدفق الخلوي ، والأسماك. علي سبيل المثال ، تمت أحاله مريض واحد (1790) مع اثنين phm التي تم العثور عليها لتكون منشا بتحليل ميكروصفيف من pocs فقط. ولذلك تم تشخيص المريض مع PHM المتكررة. وكشف التنميط الجيني الميكروي لاثنتينين من "PHM" جنبه مع الحمض النووي للمريض وشريكها انه في حين ان الشامة الاولي للمريض هي تشتت ثلاثي اللون (الشكل 9ا) ، فان لها الثانية "phm" لديها نمط جيني ثلاثي اللون (الشكل 9 B) التالي ليست PHM ، ولكن الإجهاض غير المولي.
تظهر العلامة الاولي في الشكل 9ا (باللون الأسود) قمتين في الجهاز. يتكون الذروة اولي من الام, بما ان فقط الام يتلقى قمة من هذا حجم. يتبع ال نفسه منطق, الثاني قمة ينشا من الأب بما ان هو يشارك ال نفسه [اليل]. لاحظ كيف ان الذروة الثانية اعلي بكثير من الأول ، مشيرا إلى ان هناك علي الأرجح جرعتين من اليل الأبوي نفسه في تلك الذروة. التلوث النفاسي ، والتي سيتم شرحها بمزيد من التفصيل في وقت لاحق ، هو الحد الأدنى جدا في هذا المركز لأنه يعرض ذروه صغيره جدا في موقف allele الام الثانية.
العلامة الثانية في الشكل 9ا (باللون الأزرق) تظهر ثلاث قمم فيالصورة . اثنان من هذه القمم تنبع من الأب وواحده من الام. وهكذا ، فمن الواضح مره أخرى من هذا المؤشر ان هناك ثلاثه الاللات الموجودة في الجهاز ، اثنين من الأب وواحد من الام. العلامات الثالثة والرابعة في الشكل 9(ا ) تشبه العلامة الاولي ، وتظهر أيضا اثنين من الاللات القادمة من الأب وواحده من الام.
وبما ان جميع العلامات الاربعه تظهر باستمرار ثلاثه عللات (بالجرعة أو بوجود ثلاثه من الاللات من احجام مختلفه) ، واثنين من أصل الأب وواحد من الام ، يمكن للمرء ان يستنتج ان هذا النوع من التشتت ثلاثي الابعاد ، ويؤكد تشخيص PHM.
جميع العلامات الاربعه في الشكل 9ب مره أخرى تظهر ثلاثه الاليل: العلامة الاولي تظهر جرعتين في الذروة الاولي التي تنشا من الام وجرعه واحده في الذروة الثانية التي تنبع من الأب. وتظهر العلامتان الثانية والرابعة ثلاث قمم مختلفه (اي ثلاثه أنواع مختلفه) ، اثنان منها من الام. العلامة الثالثة تظهر جرعه واحده في الذروة الاولي التي تنشا من الأب وجرعين في الذروة الثانية التي تنشا من الام. ولذلك ، هذا الجهاز هو digynic منشا في الأصل منذ مجموعتين من الكروموسومات تاتي من الام ومجموعه واحده تاتي من الأب. ولذلك فهو إجهاض غير مولي.
الشكل 9: نتائج التنميط الجيني التمثيلي للمريض 1790. (ا) حدد نتائج التنميط الجيني للمفهوم الأول للمريض الذي يظهر النمط الجيني لتشتت ثلاثي اللون. (ب) حدد نتائج التنميط الجيني من التصور الثاني للمريض الذي يظهر النمط الجيني الثلاثي اللون. محور x في الbasepairs; تم حذف التسميات واحجام basepair للبساطة. يمثل المحور y ارتفاع الذروة ويتم حذفه بالمثل من الشكل للبساطة. يرجى النقر هنا لعرض نسخه أكبر من هذا الرقم.
تم تشخيص هذا المريض في البداية مع اثنين PHM وكان القلق بشان زيادة خطر الشامات أكثر بينما كان لديها PHM واحد. هذه الحالة يسلط الضوء علي الحد من ميكروصفيف الاسكتلندي علي وحده المعالجة الخاصة وحدها. ميكرواري الصغير هو أسلوب قوي وهو الأفضل للكشف عن اي كروموسوم (ثلاثي الفوسفات ، مونوسوميس ، أو الأنماط الجينية غير diploid). ومع ذلك ، عند تنفيذها علي وحده المراقبة الخاصة وحدها دون تحليل الحمض النووي الابويه ، لا يمكن تحديد أصل الثلاثية. لمزيد من التوضيحات حول تحليل النمط الجيني والتفسير ، يرجى الرجوع إلى الدراسة من قبل مورفي وآخرون16.
النتائج التمثيلية المبينة في الشكل 10ا هي من مفهوم ثلاثي اللون. تمثل قيم المحور س محتوي الحمض النووي DNA. علي سبيل المثال ، 200 هو رقم اعتباطي معطي للخلايا التي تحتوي علي كميه معينه من محتوي الحمض النووي DNA. لذلك ، يمثل الذروة عند 400 الخلايا التي تحتوي علي ضعف كميه الحمض النووي DNA مقارنه بذروه 200. القمه الصغيرة حول 300 تمثل محتوي الحمض النووي DNA الذي هو في بين الذروة 200 و 400 التالي الذروة منشا. لاحظ كيف ان مفهوم مضاعف (الشكل 10B) لا يحتوي علي اي ذروه في قيمه 300.
في بعض الحالات ، وذروه منشا خفيه جدا (الشكل 10ج). كلما لوحظت ذروه منشا بالبالكاد ، فمن المهم ان تنظر أولا كميه السيرة الذاتية التي كانت موجودة في الأقسام المستخدمة لتحليل تدفق الخلوي. إذا كانت الأقسام اقل من حوالي 20 ٪ CV ، فانه من المرجح ان تكون ثلاثية حقيقية نظرا لأنه من المتوقع ان تكون ذروه منخفضه جدا. وإذا كانت الأقسام الماخوذه تحتوي علي كميات عاليه من السيرة الذاتية ، يصبح القسم مشبوها بالفسيفساء مع وجود سكان خلويين آخرين. ويمكن التحقق من ذلك عن طريق أعاده النظر في نتائج التنميط الجيني لمعرفه ما إذا كانت تناسب التشتت منشا الكمال أو يمكن أيضا ان تؤكد من قبل الأسماك مع تحقيقات من X, Y, و 18 الكروموسومات. أيضا ، باستخدام البرامج الموضحة في هذه المقالة ، من الممكن تعيين بوابات محدده ، كما هو موضح في القسم 2-4-1 ، التي تسمح للمستخدم بالتركيز علي منطقه معينه لإثراء الخلايا ثلاثية اللون إذا كانت موجودة بالفعل.
الشكل 10: نتائج القياس الخلوي للتدفقات التمثيلية التي تبين التصورات ثلاثية القوائم في (ا) و (ج) ، والتصور الثنائي في (ب). يرجى النقر هنا لعرض نسخه أكبر من هذا الرقم.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
HM هي حالات الحمل البشري غير الطبيعية مع المسببات غير المتجانسة ولها أنواع مختلفه من الانسجه والأنماط الجينية ، مما يجعل تصنيفها الدقيق والتشخيص الصعب. وغالبا ما ثبت ان التقييم المورفولوجية غير دقيق وغير موثوق به من تلقاء نفسه لتصنيف HM في اليه تبادل أليات و PHM وتمييزها عن الإجهاض غير المولي. ولذلك ، فان التشخيص الدقيق لHM يتطلب استخدام أساليب أخرى مثل التنميط الجيني للحمض النووي المتعدد الإرسال المتعدد ، وتحليل الصيغة الخلوية بواسطة قياس التدفق ، والتحليل اللوني بواسطة FISH ، و p57KIP2 مناعي. كل من هذه الطرق لديها القيود والمزايا الخاصة بها.
قيود ومزايا التنميط الجيني متعدد الإرسال والتدفق الخلوي
التلوث النفاسي هو واحد من القضايا الأكثر شيوعا عند العمل مع الانسجه FFPE وقد يؤدي إلى سوء التشخيص ، التالي تسليط الضوء علي اهميه فصل الأمهات من انسجه الجسم. ومن المهم تحديد التلوث النفاسي من أجل الحصول علي فكره عما يمكن توقعه من القمم الجينية والمساعدة في تفسيرها. إذا كان مستوي التلوث كبيرا جدا ويمنع التفسير الموثوق به للنتائج ، فكرر عزل الحمض النووي واستخراجه ، مع الحرص علي أزاله جميع انسجه الام الممكنة. وفي المناطق التي لا يكون فيها شكل الانسجه واضحا ، من الأفضل أزاله هذه المناطق للتقليل إلى ادني حد من فرص التلوث النفاسي. الميزة الاولي للأسلوب الموصوف في هذا البروتوكول ، بالاضافه إلى تكلفته الأقل ، هي انه يتم أزاله انسجه الام من الشرائح في حين ان الطرق الأخرى تتكون من جمع انسجه الجسم (من خلال تغطيتها بالمحلول الذي بوليميريزيس عند التعرض للهواء ورفع الانسجه) دون أزاله انسجه الام. وهكذا تسمح الطريقة الموصوفة هنا بإلقاء نظره ثانيه علي انسجه الجسم المتبقية ، وأعاده تنظيفها إذا لزم الأمر ، كما هو الحال غالبا ، ثم جمع واستخراج الحمض النووي منها. والميزة الثانية هي اننا تنظيف الانسجه علي غير القابل للازاله H & المقاطع الملونة E ، والتي تسهل إلى حد كبير أزاله الانسجه الاموميه ، بدلا من استخدام المقاطع غير الملونة وشريحة خريطة coversliشفاه. ومع ذلك ، فان تلطيخ اضافيه قد تزيد من تدهور الحمض النووي ، وهذا يعوض عن طريق أضافه المزيد من المقاطع.
ومن التحديات الأخرى توافر الحمض النووي الأبوي للتحليل. ان وجود كلا الوالدين يسهل كثيرا تحليل وتفسير نتائج التنميط الجيني. ولكن لسوء الحظ ، غالبا ما يكون الحمض النووي للأب غير متوفر ، وهو ما قد يعقد التحليل في بعض الأحيان ، وخاصه في الحالات التي تكون فيها نوعيه الحمض النووي لل "بي في دي" رديئه بسبب التثبيت المسبق أو التخزين طويل الأجل (أكثر تواترا عند العمل مع المتكررة HM). وعلاوة علي ذلك ، قد لا يكون دم الام متاحا دائما لاستخراج الحمض النووي. في مثل هذه الحالات ، يمكن استخراج الحمض النووي للأمهات من انسجه بطانة الرحم الموجودة في كتل FFPE كما هو موضح سابقا16. كما ان توصيف الانسجه المولية التي نتجت عن استخدام تكنولوجيات الإنجاب المساعدة قد يعقد تحليل النمط الجيني الميكروي لأنه في معظم الحالات لا يكون الحمض النووي من المتبرعين (ذكورا أو إناثا) متاحا عاده.
وأخيرا ، فان كون القمم الكبيرة تميل إلى ان تكون أقصر من حيث ارتفاع الذروة هو مصدر آخر محتمل للالتباس ، خاصه عندما تحتاج مرتفعات الذروة إلى استخدامها لتحديد ما إذا كانت هناك جرعتان أو جرعه واحده في ذروه واحده. طريقه واحده للتغلب علي هذا هو ان نضع في اعتبارنا دائما ان قمم حجم اليل كبيره (عدد من أزواج قاعده) تميل إلى ان تكون أقصر ، وذلك بسبب الطبيعة المتدهورة من الحمض النووي من انسجه ffpe ، مما يجعل الحمض النووي اقل المتاحة لتضخيم الاليل أكبر. الاضافه إلى ذلك ، فان التضخيم الأقصر للجزء PCR ياخذ وقتا اقل من الحجم الأكبر ، ويؤدي التضخيم الاسي للحمض النووي إلى كميات اقل من الاللات الأكبر.
العيب الرئيسي لقياس التدفق الخلوي هو ان التصاميم منشا قد تكون في بعض الأحيان غاب ، وهذا يمكن ان يكون بسبب كميات غير كافيه من السيرة الذاتية في الكتلة. ومع ذلك ، فان وجود ذروه منشا هو دلاله قاطعه علي الثلاثية. لاحظ ان هذا الأسلوب غير حساس بما فيه الكفاية للكشف عن ثلاثي القوائم أو التصاميم رباعي اللون أو الأخرى التي تستخدم هذا البروتوكول. لا يمكن اكتشاف التصاميم رباعيه اللون بواسطة هذا البروتوكول لان الذروة رباعيه اللون تقابل نفس ذروه الخلايا الثنائية في المرحلة G2 من دوره الخلية.
معرفه هذه القيود والتحديات يساعد في الحد من الأخطاء. التالي فمن المهم ، وأحيانا ضرورية لتحليل نفس النسيج مع أساليب مختلفه ، ومقارنه النتائج ، والتاكد من انها متطابقة مع بعضها البعض. وإذا لم تكن هناك حاجه إلى أعاده النظر في النتائج وينبغي تكرار التحليلات. النسبة للحالات العديدة التي أظهرت نتائج متضاربة ، تم حل التناقضات ببساطه عن طريق تكرار التجارب واتخاذ العناية المناسبة لتجنب المشكلة الاصليه. وفي حالات أخرى ، تم حل التناقضات عن طريق القيام بأساليب اضافيه مثل FISH علي أقسام الانسجه أو عن طريق القيام بالتنميط البسيط الإضافي مع العلامات المناسبة.
تحديد التلوث النفاسي
وفيما يتعلق بتحديد تلوث الحمض النووي للحمض الخلوي الريبي مع الحمض النووي الأمومي ، فان مستوي التلوث سينعكس أو يعترف به بوجود جميع الأمهات الأموميات في جميع المواقع الموجودة في العقار ، بالاضافه إلى اليل الأمهات التي تنتقل إلى الام.
وفي الشكل 11(ا) ، توصف القمم الناشئة عن التلوث بالحمض النووي للأمهات ب "ج". لاحظ كيف كل ذروه ملحوظ مع "ج" موجود أيضا في الام ، ونحن نري هذه القمم "ج" في جميع العلامات الثلاث. لاحظ انه بالنسبة للعلامة الثانية (باللون الأزرق) ، فان ذروه التلوث النفاسي المشار اليها بواسطة "c" هي اعلي من كل ذروه "c" عند العلامة الاولي لان الام هي هووزيوس للعلامة الثانية ؛ التالي تضاعف ارتفاع الملوثات لهذه العلامة. في هذا الأمر ، لا توجد قمم أمومي المشتقة. وبعبارة أخرى ، فان هذا الأمر لم يرث اي من المورثات من الام. هناك فقط واحده الذروة الحقيقية في كل علامة وهذه الذروة ليست موجودة في الام. ولذلك فاننا نعلم ان القمم الحقيقية يجب ان تاتي من الأب. مع المعلومات بلويدي من اما النمط النوى أو تحليل الخلوي التدفق مما يدل علي ديبلويدي ، فمن الممكن ان نستنتج ان هذا الأمر هو علي حد سواء ثعلبه في الأصل وثنائي اللون.
وعلاوة علي ذلك ، فان هذه العلامات الثلاث في الشكل 11ا تكشف انه لا يوجد دائما سوي ذروه حقيقية واحده لكل علامة. فقط ثلاث علامات موضحه هنا ، ومع ذلك ، غالبا ما تاتي مجموعات متعددة مع العديد من العلامات التي سوف تكشف أيضا عن نفس النمط. منذ هذا الجهاز هو ثنائي اللون ، يجب ان يكون هناك جرعتين في كل ذروه. مع هذه المعلومات ، يمكننا ان نستنتج ان هذا الميكروفون هو أحادي الذكورة وهو هووزيوس في كل علامة واحده.
ويمثل الشكل 11باء الثنائية ثنائيه اللون. ويمثل الشريط الأسود الصغير عبر الذروة الاولي للعلامة الاولي (باللون الأخضر) الكمية المقدرة من التلوث الموجود ضمن هذه الذروة الحقيقية. ال "R" يشير إلى الجزء الحقيقي من هذه الذروة القادمة من الحمض النووي لل. ال "ج" يمثل الجزء الملوث من هذه الذروة القادمة من الحمض النووي للأمهات. كيف يمكن للمرء ان يحدد مستوي التلوث ؟ ومن الممكن ، في هذه الحالة ، عندما تكون العلامة غير متجانسة في الام لان واحده من الاللات الاموميه غائبه في الأمن العام. الذروة الصغيرة في العلامة الاولي المسمية ب "ج" ، علي سبيل المثال ، تشير إلى ان هذا هو مستوي التلوث الذي ينبغي توقعه لأمومي الأخرى الموروثة الذروة. التالي ، فان جميع القمم التي هي من أصل أمومي اعلي قليلا من القمم الموروثة أبويا بسبب الكمية المضافة الصغيرة من التلوث. للعلامة الثالثة (باللون الأسود) في الشكل 11ب، ومن المتوقع ان يكون مستوي التلوث ضعف المبلغ المعتاد (لان الام هي هووزوس لهذه العلامة محدده) ، ويمكن للمرء ان يستنتج بالتالي ان هناك جرعه واحده فقط في الذروة الاولي في الداخل.
يوضح الشكل 11ج التشتت ثلاثي اللون. تظهر العلامة الاولي (باللون الأخضر) ثلاثه قمم في المؤشر. وبما ان هذه القمم الثلاثة لها ارتفاعات متشابهة ، فمن الممكن استنتاج ان هذا الرقم الثلاثي الابعاد يحتمل ان يكون ثلاثي الابعاد. لاحظ ان الذروة الثالثة في هذه العلامة أقصر من الأول. ومن المتوقع ان تكون القمم الأكبر ، كاتجاه عام ، أقصر. الذروة الثانية اعلي قليلا من الاولي ، وهذا يمكن ان يعزي إلى كميه صغيره من التلوث النفاسي ، كما هو مبين في شريط و "ج". وعلاوة علي ذلك ، فان اثنتين من هذه القمم الثلاث ليست موجودة في الام ، ولذلك يجب ان تاتي من الأب. وحتى الآن ، يشير هذا المؤشر إلى انه يمكن ان تكون ثلاثية القوائم (أو ثلاثه الصبغي) وان منشا مجموعه اضافيه من الكروموسومات هو الأب. ويشير أيضا إلى انه مفهوم التشتت ، لان الجهاز ورثت اثنين من المورثات مختلفه من الأب.
العلامة الثانية (باللون الأزرق) في الشكل 11C لديها فقط اثنين من القمم. بعد المحاسبة لمستوي التلوث ، والذروة الثانية تظهر اعلي من الأول ، وهذا هو علي الرغم من الاتجاه العام لقمم أكبر لتكون أصغر (الاتجاه الذي يجب ان يوضع دائما في الاعتبار اثناء التحليل). التالي ، فمن المرجح ان هناك جرعتين في ان ذروه واحده كبيره. وهذا ما يدعمه أيضا حقيقة ان العلامة الاولي تدل علي الثلاثية.
وأخيرا ، فان العلامة الثالثة (باللون الأسود) في الشكل 11ج تظهر ثلاث قمم ، وهذا يدل مره أخرى علي الثلاثية. وبما ان معظم العلامات في مجموعات متعددة تاتي من كروموسومات مختلفه ، فمن الممكن ان نستنتج بثقة ان الملف ثلاثي اللون بعد مراقبه نفس الاتجاه من ثلاثه الاللات عبر عده علامات مختلفه. نلاحظ أيضا من هذه العلامة ان اثنين من القمم الثلاثة تنبع من الأب ، مما يؤكد أصل التشتت.
الشكل 11: نتائج التنميط الجيني التي توضح اثر التلوث النفاسي. تظهر اللوحات العلوية المورثات التي تنتمي إلى ألواح السفلية وتظهر اللوحات الأسفل تلك التي تنتمي إلى الام. في (ا) ، وهو الاحاديه الذكورة الوراثية ويتم تسليط الضوء علي مستوي التلوث من قبل السهم والحرف "ج". وفي الفئة (ب) ، فان الرقم التعريفي لهذه ألغام هو ثنائي اللون ، ويسلط الحرف "ج" الضوء علي مستوي التلوث. في (ج) ، وهو التشتت منشا ويتم تسليط الضوء علي مستوي التلوث في الحرف "ج". وتظهر القضبان السوداء الصغيرة كم من ارتفاعات الذروة تاتي من التلوث النفاسي ، ولذلك ينبغي ان تؤخذ في الاعتبار عند مقارنه ارتفاعات الذروة. محور x في الbasepairs; تم حذف التسميات واحجام basepair للبساطة. يمثل المحور y ارتفاع الذروة ويتم حذفه بالمثل من الشكل للبساطة. يرجى النقر هنا لعرض نسخه أكبر من هذا الرقم.
أمثله علي الحالات الصعبة
النسبة لعدد من الحالات ، لم يتسن التوصل إلى نتيجة الا باجراء جميع التقييمات الثلاثة في ان واحد (اي التدفق ، p57KIP2، والتنميط المتعدد الأغراض). علي سبيل المثال ، تمت الاشاره إلى حاله واحده (808) كاجهاض غير مولي. وقد ادي التقييم المرضي إلى الاشتباه في التصور المولي وتحليل التنميط الجيني لجهاز الأمن الخاص الذي كشف عن علامة واحده أظهرت بوضوح ثلاثه قمم (اثنان من الأب والاخر من الام). لم تكن نتائج p57KIP2 حاسمه. كشف تحليل تدفق الخلوية ذروه منشا الصغيرة التي تم تاكيدها مع تحليل الأسماك ، والتي استبعدت أيضا وجود السكان الخلوية مضاعف آخر. مع تاكيد من الأسماك ، كان من الممكن ان نستنتج ان الجاسوس هو في الواقع الخلد التشتت ثلاثي اللون.
وأشير أيضا إلى حاله أخرى (1192) باعتبارها إجهاضا غير مولي. تم مزج السيرة الذاتية لهذا المكان مع انسجه الام وكانت نخريه للغاية أيضا ، مما يجعل عمليه التنظيف صعبه للغاية. ونتيجة لذلك ، اظهر تحليل التنميط الجيني الأول مستوي عاليا من التلوث النفاسي ، بحيث يمكن رؤية كل اليل أمومي في السجل العام للأمهات (وهو مؤشر جيد علي التلوث المحتمل). وعلاوة علي ذلك ، كان p57KIP2 للأسف غير حاسمه ، علي الأرجح بسبب طبيعة نخريه من الانسجه ، وربما بسبب تاخر التثبيت. ومع ذلك ، كانت نتائج قياس التدفق الخلوي مؤشرا علي الثلاثية ، والتي أكدتها الأسماك أيضا. وأعيد استخراج الحمض النووي بهدف الحد من مستوي التلوث وأزاله الانسجه ذات المورفولوجية غير الواضحة. تحليل النتائج الجينية الجديدة ، في حين ان المحاسبة للوجود المحتمل للتلوث الأمهات ، وسمح لنا ان نستنتج انه كان التشتت منشا xxy phm.
ويبين الجدول 4 الأساليب النموذجية المستخدمة للتحليل. فمن المستحسن استخدام التقييم المورفولوجية و p57KIP2 مناعي علي جميع الانسجه المشبوهة من HM وطريقه واحده علي الأقل التنميط الجيني. ومن بين أساليب التنميط الجيني ، فان الأكثر أفاده هو تعدد الجينات الجينية. عندما تكون النتائج بين الطرق المختلفة غير متطابقة أو عندما تكون بعض النتائج غير حاسمه ، يجب استخدام أساليب التنميط الجيني الأخرى. يوضح الجدول النتائج المتطابقة المتوقعة لكل نوع من أنواع HM المحتملة مع استثناءات نادره وتوصيات لحلها.
الجدول 4: الترتيب النموذجي للتحليل ، والنتائج المتوقعة ، والاستثناءات النادرة إلى جانب التوصيات المتعلقة بحلها. P57KIP2 مناعي يهدف إلى الكشف عن التعبير عن P57KIP2، والبروتين المرمزة بواسطة CDKN1C جين. وهذا الجين مطبوع بشكل أبوي في الورم الخلوي والمشيمة الخسيسة لأول مره في الثلث ويتم التعبير عنه فقط من الجينوم الأمومي. ولذلك فانه يستخدم كعلامة تبعية للكشف ، بطريقه سهله وغير مكلفه ، عن وجود المجين الأمومي في القوات الخاصة. فمن المستحسن لأداء p57KIP2 مناعي لجميع pocs يشتبه في ان تكون HM بالتوازي مع التقييم المورفولوجية. في مختبر المؤلف ، يتم استخدام p57KIP2 الأجسام المضادة والمنصات المشار اليها في جدول المواد والمؤلفين سعداء جدا مع نوعيه النتائج. المختصرات: IHC = مناعي ؛ تراجع و = مضاعف androgenetic; تراجع bip = مضاعف ثنائي اللون; Chr = كروموسوم; MC = الإجهاض; و TP = انتشار تروفوبلاستيك.
علي حد علم المؤلفين ، هذه المقالة هي الاولي التي توفر بروتوكولات مفصله لقياس التدفق الخلوي ، فضلا عن منخفضه التكلفة وعاليه الجودة متعددة الجينات الحمض النووي الدنا الجينية من الانسجه FFPE. كما يتم وصف تفسير النتائج ، إلى جانب استكشاف الأخطاء وإصلاحها والتكامل مع تلك الأساليب الأخرى للوصول إلى استنتاجات دقيقه وتشخيصات لل POCs و HM. ويامل المؤلفون بإخلاص ان هذه المادة يمكن ان تكون مفيده للباحثين الذين يحاولون فهم هذا الكيان المعقد.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
وليس لدي المؤلفين ما يفصحون عنه.
Acknowledgments
ويشكر المؤلفان صوفي باترير وماريان باريسي لمشاركتهما بروتوكول التدفق الخلوي الأصلي ، و Promega و Qiagen لتوفير الإمدادات والكاشفات. وقد حظي هذا العمل بدعم من الهيئة الكندية لأعاده الإنتاج والمعهد الR.S. للبحوث الصحية (MOP-130364) إلى المركز الكوري لبحوث الصحة.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| BD FACS Canto II | BD BioSciences | 338960 | |
| Capillary electrophoresis instrument: Genomes Applied Biosystems 3730xl DNA Analyzer | Applied biosystems | 313001R | Service offered by the Centre for Applied Genomics (http://www.tcag.ca) |
| Citric acid | Sigma | 251275 | |
| Cytoseal 60, histopathology mounting medium | Fisher | 23244257 | |
| Eosin Y stock solution (1%) | Fisher | SE23-500D | |
| FCSalyzer - flow cytometry analysis software | SourceForge | - | https://sourceforge.net/projects/fcsalyzer/ |
| FFPE Qiagen kit | Qiagen | 80234 | |
| Forceps | Fine Science Tools | 11295-51 | For sectioning and for the cleaning process |
| Glacial Acetic Acid (Concentrated) | Sigma | A6283-500mL | |
| Glass coverslips: Cover Glass | Fisher | 12-541a | |
| Hematoxylin | Fisher | CS401-1D | |
| Highly deionized formamide: Hi-Di Formamide | Thermofisher | 4311320 | |
| IHC platform: Benchmark Ultra | Roche | - | |
| Kimwipes | Ultident | 30-34120 | |
| Microtome | Leica | RM2135 | |
| Microtome blades | Fisher | 12-634-1C | |
| Nitex filtering mesh, 48 μm | Filmar | 74011 | http://www.filmar.qc.ca/index.php?filet=produits&id=51&lang=en ; any other filter is suitable, but this is an inexpensive and effective option from a non-research company |
| p57 antibody | Cell Marque | 457M | |
| Pasteur pipette | VWR | 53499-632 | |
| PCR machine | Perkin Elmer, Applied Biosystems | GeneAmp PCR System 9700 | |
| PeakScanner 1.0 | Applied Biosystems | 4381867 | Software for genotyping analysis. |
| Pepsin from porcine gastric mucosa | Sigma | P7012 | |
| Polystyrene round-bottom tubes | BD Falcon | 352058 | |
| Positively charged slides: Superfrost Plus 25x75mm | Fisher | 1255015 | |
| PowerPlex 16 HS System | Promega Corporation | DC2102 | |
| Propidium Iodide | Sigma | P4864 | |
| Ribonuclease A from bovine pancreas | Sigma | R4875 | |
| Separation matrix: POP-7 Polymer | Thermofisher | 4352759 | |
| UltraPure Agarose | Fisher | 16500-500 | |
| Xylene | Fisher | X3P1GAL |
References
- Szulman, A. E., Surti, U. The syndromes of hydatidiform mole. II. Morphologic evolution of the complete and partial mole. American Journal of Obstetrics & Gynecology. 132 (1), 20-27 (1978).
- Fukunaga, M., et al. Interobserver and intraobserver variability in the diagnosis of hydatidiform mole. The American Journal of Surgical Pathology. 29 (7), 942-947 (2005).
- Gupta, M., et al. Diagnostic reproducibility of hydatidiform moles: ancillary techniques (p57 immunohistochemistry and molecular genotyping) improve morphologic diagnosis for both recently trained and experienced gynecologic pathologists. The American Journal of Surgical Pathology. 36 (12), 1747-1760 (2012).
- Howat, A. J., et al. Can histopathologists reliably diagnose molar pregnancy? Journal of Clinical Pathology. 46 (7), 599-602 (1993).
- Banet, N., et al. Characteristics of hydatidiform moles: analysis of a prospective series with p57 immunohistochemistry and molecular genotyping. Modern Pathology. 27 (2), 238-254 (2014).
- Lipata, F., et al. Precise DNA genotyping diagnosis of hydatidiform mole. Obstetrics & Gynecology. 115 (4), 784-794 (2010).
- Buza, N., Hui, P. Partial hydatidiform mole: histologic parameters in correlation with DNA genotyping. International Journal of Gynecologic Pathology. 32 (3), 307-315 (2013).
- Fisher, R. A., et al. Frequency of heterozygous complete hydatidiform moles, estimated by locus-specific minisatellite and Y chromosome-specific probes. Human Genetics. 82 (3), 259-263 (1989).
- Murdoch, S., et al. Mutations in NALP7 cause recurrent hydatidiform moles and reproductive wastage in humans. Nature Genetics. 38 (3), 300-302 (2006).
- Parry, D. A., et al. Mutations causing familial biparental hydatidiform mole implicate c6orf221 as a possible regulator of genomic imprinting in the human oocyte. American Journal of Human Genetics. 89 (3), 451-458 (2011).
- Nguyen, N. M., Slim, R. Genetics and Epigenetics of Recurrent Hydatidiform Moles: Basic Science and Genetic Counselling. Current Obstetrics and Gynecology Reports. 3, 55-64 (2014).
- Sebire, N. J., Savage, P. M., Seckl, M. J., Fisher, R. A. Histopathological features of biparental complete hydatidiform moles in women with NLRP7 mutations. Placenta. 34 (1), 50-56 (2013).
- Nguyen, N. M., et al. Comprehensive genotype-phenotype correlations between NLRP7 mutations and the balance between embryonic tissue differentiation and trophoblastic proliferation. Journal of Medical Genetics. 51 (9), 623-634 (2014).
- Brown, L., et al. Recurrent pregnancy loss in a woman with NLRP7 mutation: not all molar pregnancies can be easily classified as either "partial" or "complete" hydatidiform moles. International Journal of Gynecologic Pathology. 32 (4), 399-405 (2013).
- Colgan, T. J., Chang, M. C., Nanji, S., Kolomietz, E. A Reappraisal of the Incidence of Placental Hydatidiform Mole Using Selective Molecular Genotyping. The International Journal of Gynecological Cancer. 26 (7), 1345-1350 (2016).
- Murphy, K. M., McConnell, T. G., Hafez, M. J., Vang, R., Ronnett, B. M. Molecular genotyping of hydatidiform moles: analytic validation of a multiplex short tandem repeat assay. The Journal of Molecular Diagnostics. 11 (6), 598-605 (2009).
