Summary
ヒダチジフォームほくろは、形態学的特徴およびモルゲノムへの親の寄与に応じて分類することができる異種性腸科を有する異常なヒト妊娠である。ここでは、ホルマリン固定パラフィン埋め込みモル組織の多重マイクロサテライトDNAジェノタイピングおよびフローサイトメトリーのプロトコルを、結果の解釈および統合とともに詳細に説明する。
Abstract
ヒダチジフォームほくろ(HM)は、過剰な栄養芽細胞増殖および異常な胚発生を特徴とする異常なヒト妊娠である。顕微鏡形態学的評価に基づくHMには、完全HM(CHM)と部分HM(PHM)の2種類があります。これらは、モルゲノムに対する親の寄与に基づいてさらに細分化することができる。HMのこのような特性化は、形態学および遺伝子型分析によって、患者管理およびこの興味深い病理の基本的な理解のために重要である。HMの形態学的解析は広い観察者間変動の影響を受け、HMをCHMおよびPHMに正確に分類し、水中非モル中絶と区別するには十分ではないことが十分に文書化されている。ジェノタイピング分析は、主に、最適な品質を持たないホルムリン固定パラフィン埋め込み(FFPE)製品のDNAおよび組織に対して行われ、結果的に間違った結論につながる可能性があります。本稿では、FFPEモル組織の多重ゲノタイピングおよびフローサイトメトリー分析のための詳細なプロトコルを提供し、これらの方法の結果の解釈、トラブルシューティング、および形態学的評価との統合を提供する。、p57KIP2免疫組織化学、およびその中の蛍光ハイブリダイゼーション(FISH)は、正しく、堅牢な診断に達する。ここでは、約400の概念製品の分析から過去10年間に学んだ方法と教訓を共有する。
Introduction
ヒダチジフォームほくろ(HM)は、異常な胚発生、栄養芽細胞の過剰増殖、絨毛絨毛性絨毛(CV)の水文変性を特徴とする異常なヒト妊娠である。従来、HMは形態学的評価1のみに基づいて完全なHM(CHM)と部分HM(PHM)の2種類に分けられており、従来は2種類に分けられております。しかし、形態学的評価だけではHMを2つのサブタイプ(CHMおよびPHM)に分類し、非モル流産2、3、4と区別するには不十分であることが示されている。
CHMとPHMは悪性腫瘍に対する傾向が異なるため、患者に適切なフォローアップと管理を提供するために、HMのゲノムタイプを正確に決定することが重要です。その結果、過去数十年にわたり、モル組織に対する親の寄与を特定し、HMの正しい分類に達することを目的として、いくつかの方法論が開発され、進化してきました。これらには、核型分析、染色体バンディング多型、ヒト白血病抗原(HLA)血清、制限断片長多型、可変数のカンデム反復、マイクロサテライトジェノタイピング、フローサイトメトリー、およびp57が含まれます。KIP2免疫組織化学。これにより、ゲノムに対する親の貢献に基づくHM概念の正確な細分化が可能になりました:CHMは、ジプロイド・アンドロティック・モノスマティックまたはディプロイド・アンドロゲンティック・ディスパーミックであり、PHMは99%で、99%のディスパーミックであり、症例5、6、7、8の1%で単精子。さらに、過去20年間に出現した別のゲノムタイプのHMがあり、これは二重親である。後者は主に再発し、単一の家族(シンプレックス症例)または少なくとも2つの家族(家族の場合)に影響を与える可能性があります。これらの二重親モルは、主に患者9、10、11、12におけるNLRP7またはKHDC3Lの劣性変異によって引き起こされる。NLRP7における劣性変異を有する患者における二葉性双親HMは、形態学的分析によってCHMまたはPHMと診断され、これは患者13、14における変異の重症度と関連していると思われる。彼らの遺伝子型に従ったHMの分類に加えて、いくつかの遺伝子タイピング法の導入と使用は、異球体二親の概念のような非モル流産からの様々なモルエンティティの区別を可能にしました。概念の他のタイプ5,15.このような概念は、ある程度、HMのいくつかの形態学的特徴を模倣するいくつかの栄養芽細胞増殖および異常な絨毛形態を持ち込む可能性がある。
この記事の目的は、ホルマリン固定パラフィン埋め込み(FFPE)組織の多重ゲノタイピングとフローサイトメトリーの詳細なプロトコルを提供し、これらの方法の結果と他の方法との統合の包括的な分析を提供することです。モル組織の正しく、決定的な診断。
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Protocol
この研究は、マギル機関レビュー委員会によって承認されました.すべての患者は、研究に参加し、様々な病理学部門から受胎(POC)のFFPE製品を取得することに書面による同意を提供しました。
注:フローサイトメトリーによるジェノタイピングとプロディ決定にはいくつかの方法がありますが、ここで提供されるプロトコルは、それぞれに1つのプラットフォームを使用した1つの分析方法を説明します。
1. ジェノタイピング
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最高のFFPEブロックの選択
- 概セプション(POC)の各FFPE産物について、セクション1.2および1.3に記載されている4μm厚のヘマトキシリンおよびエオシン(H&E)染色されたセクションを調製し、顕微鏡による形態学的評価を行う。
- H&Eスライドと小顕微鏡を使用して、最大量の絨毛膜絨毛(CV)を有するFFPEブロックを選択し、可能であれば、CVを持つブロックと母体組織とは分離せず、混ざり合わないブロックを選択します。
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断面
- 選択したブロックを氷の上に15分間置き、断面を容易にします。
- 顕微鏡の形態学的評価のために4 μmの厚さ、DNA抽出のための10 μmの厚さのセクションを切断するためにマイクロトームを調整します。
- マイクロトームにコールドブロックを配置し、H&E染色のための各ブロックから1つのセクションをカットし、選択したブロックから10-30セクションを、ブロック内のCVの量に応じて、DNA抽出用に切断します。
注:CVがいっぱいのブロックの場合、DNA抽出には10のセクションで十分です。ブロックの約10%のみがCVを含み、残りが母体組織である場合、十分な量のDNAを確保するために20−30のセクションが必要です。 - 鉗子を使用して、45 °Cの水浴に各セクションを移します。水浴の断面を、鉛筆を使ってサンプル識別番号でラベル付けした正の電荷スライド(材料の表)で取り出します。
- セクションを含むスライドをオーブンに入れ、セクションがスライドに付着できるように65 °Cに置きます。H&Eのスライドをオーブンに25分間保管し、DNA抽出用のスライドをオーブンで20分間保管します。
注:インキュベーション時間が短いほど、組織はスライドにわずかに付着しなくなり、その結果、母体組織の除去が容易になります。
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H&E染色
- スライドが室温(10分)まで冷却できるようにします。
- 試薬の調製
- エオシン Y ワーキング ソリューションの準備 (0.25%)表 1 に次のように。よく混ぜ、室温で保存します。
- ヘマトキシリン5xのストック溶液を水中で希釈して作業ヘマトキシリン溶液を調作する(すなわち、80mLの水をヘマトキシリンの20mLと混合する)。
注:貯蔵用の箔にヘマトキシリンのストック溶液をラップします。
- 表2に従って、ヒュームフードの下に正しい試薬で染色瓶を準備します。
- 表 2に従って、適切な期間にスライドを適切な染色瓶に浸して H&E 染色を実行します。
- 取り付け媒体とガラスカバースリップで形態解析のための形態解析のための4 μmセクションを取り付けます(材料の表)。
注:ジェノタイピングのための10 μmセクションはカバースリップしないでください。 - 有毒なキシレン臭が消散するために、ヒュームフードの下に10 μmのセクションを最低3時間放置してください。
注意:すべての染色ステップは、ヒュームフードの下で行う必要があります。キシレン製品は、キシレン臭が有毒であるため、常にフードの下に保管する必要があります。さらに、キシレンおよびヘマトキシリンは、特別な容器に廃棄する必要があります。これらの容器が満杯になったら、実験室の安全組織によって推薦される通り廃棄する必要がある。
| 試薬 | 量 |
| エオシンYストックソリューション (1%) | 250 mL |
| 80% エタノール | 750 mL |
| 氷河酢酸(濃縮) | 5 mL |
表 1: エオシン Y 作動ソリューション (0.25%)準備。
| 使用試薬(ビンあたり100mL) | 期間 |
| 1) キシレン | 5 分 |
| 2) キシレン | 5 分 |
| 3) 100% エタノール | 2 分 |
| 4) 95% エタノール | 2 分 |
| 5) 70% エタノール | 2 分 |
| 6) 50% エタノール | 2 分 |
| 7) 蒸留水 | 5 分 |
| 8) ヘマトキシリン | 4 分 |
| 9) 蒸留水 | 5 分 |
| 10) エオシン | 1 分 |
| 11) 95% エタノール | 5 分 |
| 12) 100% エタノール | 5 分 |
| 13) キシレン | 5 分 |
| 14) キシレン | 5 分 |
表 2: H&E 染色プロトコルの試薬および持続時間。
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CVの分離
- 小光ステレオ顕微鏡の下では、鉗子と水湿紙ワイプ(材料の表)の小片を使用して、H&E染色された10μmの厚いセクションから不要な母体組織を掻き取ります。
注:最終的な目標は、スライド上のCVまたは胎児膜(存在する場合)を維持し、したがって、他のすべての組織を除去することです。このステップは、細部に細心の注意を払う必要があるため、ブロックによっては多くの時間と忍耐が必要な場合があります。 - 2人目の人に、クリーニング後にスライドを再確認し、母体組織がないことを確認します。
- きれいなスライドの写真を撮るか、データの解釈に役立つ次の文書:1)組織が洗浄が困難であったかどうか、出血性、または非常にきれいであったかどうか、2)使用されるセクションの数、および3)洗浄された組織のおおよその量。
注: 図 1は、簡単にクリーニングできるスライドの例を示しています。この量のCVを含むブロックの場合、DNA抽出には10のセクションで十分です。図2のスライドは、母体組織と混ざり合った非常に少数のCVを有し、洗浄が非常に困難で時間がかかります。この量のCVを含むブロックの場合、DNA抽出には30のセクションが必要です。 - 小さな湿った紙の拭き取りを使用してCVを収集します。鉗子を使用して、湿った紙の拭き取りから小さな部分を引き裂き、CVを収集するためにそれを使用します。
- 付属のCVで紙拭き取りをラベル付きの1.5 mLチューブに入れます。
- このステップで使用される紙拭き取りの量を最小限に抑えるには、DNA抽出カラムが詰まり、収集されたDNAの最終量が減少する可能性があります。平均して、サンプルあたり 7 個未満の小さな用紙拭き取りを使用することを目指します。大量のCVが存在することが不可能な場合は、抽出を容易にするために2つのチューブ間でサンプルを分割します。
- 小光ステレオ顕微鏡の下では、鉗子と水湿紙ワイプ(材料の表)の小片を使用して、H&E染色された10μmの厚いセクションから不要な母体組織を掻き取ります。
図1:ジェノタイピングの代表的なスライド。上:母体組織を解放するために「洗浄」する必要があるスライド。下: 洗浄後に表示される同じスライドで、DNA抽出用の CV しか含まれていません。この図のより大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。
図2:ジェノタイピングの代表的なスライド。上:母体組織を解放するために「洗浄」する必要があるスライド。下: 洗浄後に表示される同じスライドで、DNA抽出用の CV しか含まれていません。この図のより大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。
- FFPEキット(材料の表)からのDNA抽出のプロトコルに従ってDNA抽出を実行します。
注:一部のキットでは、最終的な溶出に 15-20 μL の溶出バッファーを使用することをお勧めします。経験から、溶出バッファーの15 μLの溶出はほとんどのサンプルのためによく働く。希釈は、必要に応じてストックDNAから調製してもよい。
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DNA定量
- ラボ分光光度計装置を使用して、DNAの1 μLをロードし、定量のために260 nmで吸光度を測定します。
- 2%のアガロースゲルにDNAの1 μLをロードし、定性的評価のために80−100Vの電圧でゲル電気泳動を実行します。
- ステップ1.6.1および1.6.2の結果に基づいて、多重短タンデムリピート(STR)ポリメラーゼ連鎖反応(PCR)増幅に使用するDNAの体積を選択します。その後のPCR増幅に最低1000ngのDNAを使用することを目指します。
注:図3は、DNAの濃度(分光光度計の結果に基づく)と、以下の多重STR PCRに推奨されるDNA溶液の体積と共に、ゲルの代表的な例を示す。
図3:DNA定量のための代表的なゲル。分光光度計を用いて測定した各DNAの濃度と、多重PCRに使用される量が含まれます。この図のより大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。
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PCR増幅
- 多重STRシステム(材料の表)を使用して蛍光マイクロサテライトゲノタイピングを実行します。
- 多重STRシステム(材料の表)を使用してPCR増幅のために図4に示すPCR条件を使用してください。
注:このマルチプレックス STR システムでは、D18S51、D21S11、TH01、D3S1358、ペンタ E、FGA、TPOX、D8S1179、vWA、アメロゲニン、CSF1PO、D16S539、D7S820、D13S318、および D13S3181818、および D13S1817 で使用されています。
図4:多重STRシステムのPCRサイクル条件。この図のより大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。
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毛細血管電気泳動によってPCR製品を解決します。
- 多重システムの内部標準レーンの0.5 μLおよび高度脱イオン化されたホルムアミドの9.5 μL(材料の表)の各増幅されたサンプルの1 μLを中断する。
- 器械および多重システムの色素セットのための適切な分離マトリックス(材料のテーブル)を使用して毛細血管電気泳動器械(材料の表)を通してサンプルを実行する。
- データ分析
- DNAフラグメント解析ソフトウェアを使用してデータを分析し、POC対向性を親の対向性に比較して、その起源を特定します。
- サイズ標準を設定します。
注:これにより、ソフトウェアはマルチプレックスSTRシステムで使用されるラダーを認識し、ラダーに基づいてアンプリコンにベースペアを割り当てることができます。次の手順は、1 つの特定のソフトウェア (マテリアルの表)を対象としていますが、他の種類のソフトウェアをセットアップする場合にも役立つ場合があります。- ソフトウェアを開きます。[新しいプロジェクトを開始]をクリックし、[新しいサイズの標準]をクリックします。
- サイズ標準に名前を付けます (ABI_600 など)。
- [新しいサイズ標準定義を入力]という名前のボックスに、次のように入力します: 60、 80、100、120、140、140、160、180、200、225、250、275、300、325、425、450、475、475、500、500、500、500。次に、[サイズを追加] をクリックします。
注: 入力した数値は右側のボックスの下に表示され、現在のサイズ標準定義という名前が付けられています(図 5 を参照)。 - [保存]をクリックします。
- ファイルをインポートして分析するには、[ファイルの追加]をクリックし、分析する fsa ファイルを選択します。[選択したファイルを追加]をクリックし、[OK] をクリックします。 次に、次の手順に従います。
- [サイズ標準]列を見つけて、ABI_600 (またはサイズ標準に指定された名前) を選択します。
- [解析方法]で、[既定のサイズ変更 - NPP]をクリックし、緑色の[分析]ボタンをクリックします。
- これで、ファイルを表示する準備ができました。表示オプションを調整して、必要に応じてデータを表示します。
- トラブルシューティング - 分析方法
注:ソフトウェアは、ピークを識別し、正しく位置合わせに失敗することがあります。これは、ピークが低すぎるか高すぎる場合に発生します。次の 2 つの分析方法は、これを修正し、サンプルを再テストする前に試す必要があります。- 高ピークの解析方法 1:
- 新しい分析方法をクリックし、[高ピーク](または個人の好みに基づいて別の名前)と付けます。
- [範囲]をクリックし、[部分範囲]をクリックして解析とサイズ変更を行います。次に、開始点と開始サイズに100と入力します。
- [ストップ ポイントの場合は、10,000 と入力してください。[ストップ サイズ]に「1000」と入力します。
- 次に、最小ピークの高さをクリックし、色のピークしきい値が次のようになるように数値を変更します: 青: 50;緑: 50;イエロー:20;赤: 100;オレンジ:5000。
- 新しい解析方法を保存します。
- 低ピークの解析方法 2:
- 新しい分析方法をクリックし、低ピーク(または個人の好みに基づいて別の名前) という名前を付けます。
- [範囲]をクリックし、[部分範囲]をクリックして解析とサイズ変更を行います。次に、開始点と開始サイズに100と入力します。
- [ストップ ポイントの場合は、10,000 と入力してください。[ストップ サイズ]に「1000」と入力します。
- 次に、品質フラグをクリックし、パス範囲を変更して、0.5から 1 に読み取るようにします。低品質範囲を0.0 から 0.0 に読み取るように変更します。(bp) 100.0 から (bp) 800.0 に対して、線形性を次のように変更します。
- 新しい解析方法を保存します。
注:[解析方法]で[低ピーク]または [高ピーク]を選択し、緑色の[分析]ボタンをクリックしてファイルを再分析できるようになりました。
- 高ピークの解析方法 1:
図 5: サイズ標準エディタを示すスクリーンショット。この図のより大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。
2. フローサイトメトリー
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理想的な FFPE ブロックの選択
- H&Eスライドと小顕微鏡を使用して、CVで構成される組織の約50−70%を有するFFPEブロックを選択します。
注:図6は、約50%のCV(セクションの右半分)と50%の母体組織(左半分)で構成されているため、フローサイトメトリー分析に適したブロックの代表的な例です。彼らはジプロイドピークの内部制御として機能するので、母体組織の存在は重要です。 - CV の理想的な量を持たないブロックの場合は、セクション化が実行されるにつれて CV に富む。この方法を行うには、対応する H&E スライドに従って、新しく切断されたセクションのどちら側にさらに CV が含まれているかを特定します。それに基づいて、CVのために豊かにするために廃棄する必要がある残りの半分を切断するためにブレードを使用します。
注:図7は、フローサイトメトリー分析に十分なCVを持たないブロックを示しています。このようなブロックの場合、図に示すように、母体組織に対するCVの量を増やすために、CVを含む半分が廃棄されるようにセクションをカットする必要があります。破棄される部分を補正するために、より多くのセクションをカットしてください。
- H&Eスライドと小顕微鏡を使用して、CVで構成される組織の約50−70%を有するFFPEブロックを選択します。
図 6: フロー サイトメトリーに最適な POC ブロックを表す H&E セクション。この図のより大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。
図 7: フローサイトメトリーのより困難なブロックを表す H&E セクション。この代表的な H&E セクションでは、このセクションの下半分だけをフロー サイトメトリー分析に使用し、CV を豊かにすることを目的としています。「CV」というラベルの付いた輪郭を描いた領域は、主にCVで構成されています。
- 断面
- 断面を容易にするために、15分間氷の上にブロックを残します。
- 可能な限り最高のFFPEブロックを使用して、マイクロトームを使用して50 μm厚い(または2つの100 μmの厚いセクション)の4つのセクションを切断します。
注:フローサイトメトリーの場合は、より厚い断面を有することが好ましい。 - 理想的なFFPEブロックが利用できない場合には、それにもかかわらず、母体組織に対するCVの比率を維持することを目指す。たとえば、ブロックの 30% のみが CV で構成され、残りの部分に母体組織がある場合は、母体組織を含むセクションの少なくとも半分を削除し、さらに多くのセクションを使用して補正します (図 7参照)。
- ラベル付きの 15 mL チューブにセクションを配置します。
注:次のステップで使用する有機試薬はインクを溶解および除去することができるので、ラベルの上にテープを貼るようにしてください。
- FFPE組織からのフローサイトメトリープロトコル
- 脱パラフィン化と水分補給
- ヒュームフードの下で以下の洗い物(表3)を行います。
- 15 mLチューブを適切な試薬の6 mLで充填し、表3に示す順序に従って、試薬内のセクションをそれぞれの持続時間に残し、真空吸引とガラスパスツールピペットを使用して試薬を除去する。
- 各ステップの間に、最初に70%のエタノールでパスツールピペットを浸し、次に蒸留水に浸してから、次のステップに進みます。
- 試薬と一緒に組織の断片を除去しないように非常に注意してください。15 mLチューブを60度の角度に傾け、ティッシュを引かずに液体試薬の吸引を容易にします。
注意:廃棄された液体にはキシレンが含まれており、キシレン廃棄物容器に入れるべきです。
- ソリューションの準備
- クエン酸2gを二重蒸留水の1Lに溶解してクエン酸溶液を調出す。pHを6にします。4 °Cで保存します。
- ペプシン溶液を0.01gのペプシンを2mLで9個のNaCl、pH 1.64に溶解して調出する。これは 1 つのサンプルです。
注意:ペプシンは有毒であり、容易に分散し、空気中になることができます。ペプシンを粉末状に取り扱う場合はマスクを着用し、使用後に作業領域をすべて拭き取ります。 - ヨウ化プロピジウム(PI)-リボヌクレアーゼ1サンプルに対する溶液製剤。
- 50 μL の PI を 450 μL の PBS と混合します(希釈 10 倍)。
- 混合物に50 μLのリボヌクレアーゼA(1mg/mL)を加えます。常にホイルに包んでおいてください。
- 消化と染色
- 15 mLチューブに4°Cのクエン酸溶液を加え、80°Cの水浴に2時間入れます。
- 溶液を室温(15分)まで冷やします。クレート溶液を取り除きます。
- 1x PBS、渦の6 mLを追加し、組織が底部に落ち着くように1-2分待ちます。真空吸引とガラスパスツールピペットを使用して1x PBSを取り外します。
- 1 mLのペプシン溶液(37°Cに予熱)を加え、37°Cの乾式浴に30分毎に30分間置き、このインキュベーションの最後の10分間でPI-リボヌクレアーゼA溶液を準備します。
- 1x PBS、渦の6 mLを追加し、組織が底部に落ち着くように1-2分待ちます。真空吸引とガラスパスツールピペットを使用して1x PBSを取り外します。
- PI-リボヌクレアーゼA溶液の550 μLを追加し、30分間37°Cの乾燥浴にサンプルを入れます。
注:この時点で、サンプルはホイルで包まれ、翌朝まで4°Cで一晩残すことができます。 - 48 μm の濾過メッシュを通して溶液をろ過します。フローサイトメーターで使用できるポリスチレン丸底チューブで濾液を収集します。鉗子を使用して、チューブの上部に 5 cm x 5 cm の濾過メッシュを配置し、液体をメッシュを通してチューブ内にピペテットできるようにします。
注:これで、サンプルをフローサイトメーターで実行する準備が整いました。彼らが実行する準備ができるまで、ホイルで包んでおいてください。
- 組織のフローサイトメトリープラットフォーム技術者の助けを借りて、フローサイトメーターでサンプルを実行します。
注:PEチャネルは、PI染色されたDNAを検出するために使用され、流量は取得時に遅く設定する必要があります。分析と解釈を容易にするために、ディップロイドピークがPE-A X軸に沿っておよそ200であるような電圧が選択されていることを確認してください。サンプルごとに最低 20,000 イベントを記録することを目指します。
- 脱パラフィン化と水分補給
| 使用試薬(各6mL) | 期間 |
| 1) キシレン | 2 x 10 分 |
| 2) 100% エタノール | 2 x 10 分 |
| 3) 95% エタノール | 10分 |
| 4) 70% エタノール | 10分 |
| 5) 50% エタノール | 10分 |
| 6) 蒸留水 | 2 x 10 分 |
表3:脱パラフィン化および水分補給のための試薬および持続時間。
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フローサイトメトリーデータ分析
- フローサイトメトリー解析ソフトウェア(材料の表)を使用してデータを分析します。
注:次の手順は、1 つの特定のソフトウェア (マテリアルの表)を対象としていますが、他の種類のソフトウェアをセットアップする場合にも役立つ場合があります。- フロー サイトメーターでサンプルを実行した後、分析用に FCS 2.0 ファイルをダウンロードします。
- フローサイトメトリー解析ソフトウェアを開き、[ファイル] をクリックします。新しいドキュメント:
- ヒストグラムアイコン ()
をクリックし、ポインタをドラッグして四角形を作成します。 - FCS ファイルを参照し、[開く]をクリックします。X 軸に沿って、FCS-Aをクリックし、PE-A を選択します。
- ドットプロットアイコン()
をクリックし、ポインタをドラッグしてヒストグラムプロットの下に別の長方形を作成します。次に、ヒストグラムに対して選択されたのと同じ FCS ファイルを参照します。 - ドットプロットのX軸をPE-Aに、Y 軸をPE-Wに変更します。
注: 図 8Aは、この時点でのプロットの外観を示しています。 - [領域] アイコン
() をクリックし、ディプロイドピークの前 (図 8Bの x 軸で約 100) の前に始まり、X 軸で約 700 で終わるドット プロット上のボックスを描画します(図8のドット プロットに示すように)B.
注:図 8のディプロイド ピークは、X 軸上の約 200 です。これは、サンプルがフローサイトメーターを介して記録され、単に結果の分析と解釈を容易にするために任意に選択されます。 - プロットをクリック|[領域/ゲートを編集]を行い、[ストラテジー] の下のG0セルの横にあるセルにR0と入力します。次に、をクリックします。
- ヒストグラム上の任意の場所をクリックし、プロットで|プロット/オーバーレイの書式設定 :[ゲート]で[G0 = R0]を選択し、[OK]をクリックします。
注:これは、プロイディピークをより良く視覚化することを可能にするゲーティングステップです。ヒストグラムは、図 8Bのヒストグラムのように見えるはずです。ドットプロットの特定の領域に焦点を当てるために(ステップ2.4.1.7で描かれたボックスを動かすことによって)作成されたゲートで遊ぶことができます。 - プロットにラベルを付けるには、[テキスト領域]
アイコン () をクリックし、ポインターをドラッグしてドキュメントの上部にボックスを作成し、次の情報を入力します: 患者 ID、POC ID、および使用されるブロック (1 つの POC に対して複数のブロックが存在する可能性があるため)。ブロック上に存在するパーセント CV、サンプルの実行に使用される電圧、および日付。
- フローサイトメトリー解析ソフトウェア(材料の表)を使用してデータを分析します。
をクリックし、ポインタをドラッグして四角形を作成します。
をクリックし、ポインタをドラッグしてヒストグラムプロットの下に別の長方形を作成します。次に、ヒストグラムに対して選択されたのと同じ FCS ファイルを参照します。
() をクリックし、ディプロイドピークの前 (図 8Bの x 軸で約 100) の前に始まり、X 軸で約 700 で終わるドット プロット上のボックスを描画します(図8のドット プロットに示すように)B.
アイコン () をクリックし、ポインターをドラッグしてドキュメントの上部にボックスを作成し、次の情報を入力します: 患者 ID、POC ID、および使用されるブロック (1 つの POC に対して複数のブロックが存在する可能性があるため)。ブロック上に存在するパーセント CV、サンプルの実行に使用される電圧、および日付。
図8:ヒストグラムと、アンゲート(A)とゲート(B)の代表的なサンプルのドットプロットを表示するスクリーンショット。この図のより大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。
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Representative Results
モル組織の複雑さと様々な形のゲノムを持つ可能性があるという事実は、形態学的評価、p57免疫組織化学、マイクロサテライトゲノタイピング、フローサイトメトリー、FISHなどのいくつかの方法の厳格な分析と使用を必要とします。例えば、1人の患者(1790)は、POCのマイクロアレイ分析によってのみ三脚であることが判明した2つのPHMと呼ばれた。したがって、患者は再発PHMと診断された。患者と彼女のパートナーのDNAと一緒に彼女の2つの「PHM」のマイクロサテライトゲノタイピングは、患者の最初のほくろが三重性ジスペルムである間(図9A)、彼女の2番目の「PHM」は三重性ジニカル遺伝子型を持っていることを明らかにしました(図9) B)はPHMではなく、非モル流産である。
図 9 Aの最初のマーカー (黒) は、POC の 2 つのピークを示しています。最初のピークは、母親だけがこのサイズのピークを持っているので、母親から発生します。同じ推論に続いて、第二のピークは、彼が同じ対立遺伝子を共有しているので、父親から発生します。第2のピークが最初のピークよりもはるかに高いことに注意してください, そのピークにおそらく同じ父性対立遺伝子の2つの用量があることを示しています.後で詳しく説明する母体汚染は、POCが第2の母性対立遺伝子の位置に非常に小さなピークを表示するので、このPOCでは非常に最小限です。
図 9 Aの 2 番目のマーカー (青色) は、POC の 3 つのピークを示しています。これらのピークのうちの2つは、父親と母親から1つに由来します。したがって、このマーカーから、POCに3つの対向性、父親から2つ、母親から1つ存在することが再び明らかになります。図 9Aの 3 番目と 4 番目のマーカーは、最初のマーカーに似ており、父親から来る 2 つの対向物と母親からの 1 つのア対位マーカーも示しています。
すべての4つのマーカーは、一貫して3つの対減(用量または異なるサイズの3つの対減の存在によって)を示すので、2つは父親から、もう1つは母親から起因するので、1つは、このPOCが三重の異性であると結論付け、PHMの診断を確認することができます。
図9Bの4つのマーカーはすべて再び3つの対減を示す:最初のマーカーは、母親から発生した最初のピークで2回の用量と、父親から発生した第2のピークの1回の用量を示す。2番目と4番目のマーカーは、3つの異なるピーク(すなわち、3つの異なる対位)を示し、そのうちの2つは母親から来ている。第3のマーカーは、父親に由来する第1ピークの1回の用量と、母親由来の第2ピークの2回の用量を示す。したがって、このPOCは、2組の染色体が母親から来て、1セットが父親から来るので、起源の三折ロイドジニニックです。したがって、非モル流産です。
図9:患者1790の代表的なジェノタイピング結果。(A)三重性ジプロミクスを示す患者の最初の概念のジェノタイピング結果を選択する。(B)三重性ジグニック遺伝子型を示す患者の第2の概念からジェノタイピング結果を選択する。X 軸はベースペアです。ラベルとベースペアのサイズは、わかりやすくするために省略されています。Y 軸はピークの高さを表し、わかりやすくするために図から同様に省略されています。この図のより大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。
この患者は、最初に2つのPHMと誤診され、彼女は単一のPHMを持っている間、より多くのほくろのリスクの増加を心配していました。このケースでは、POC 単独での SNP マイクロアレイの制限を強調します。SNPマイクロアレイは強力な方法であり、任意の染色体(トリソミ、モノソミ、または非ジプロイド遺伝子型)の無気力を検出するのに最適です。しかし、親のDNAを分析せずにPOC上で単独で行った場合、三部生の起源は特定できない。遺伝子型の分析と解釈に関する詳細な説明については、マーフィーら16による研究を参照してください。
図10Aに示す代表的な結果は、三値ロイド概念である。X軸の値は核DNA含有量を表します。例えば、200は、一定量の核DNA含有量を含む細胞に与えられる任意の数である。したがって、400のピークは、200ピークと比較して核DNA含有量の2倍の量を含む細胞を表す。300の周りの小さなピークは、200と400のピークの間にある核DNA含有量を表し、したがって、三角ピークです。ディプロイド概念 (図 10B)には、300 値のピークが含まれていないことに注意してください。
場合によっては、三葉同のピークは非常に微妙です(図10C)。かろうじて顕著な三葉状ピークが指摘されるたびに、まずフローサイトメトリー分析に使用されるセクションに存在していたCVの量を考慮することが重要です。セクションが約20%のCVを持っていた場合、それは非常に低いピークであると予想されるので、それは本当の三部井である可能性が高いです。採取されたセクションがCVの量が多い場合、POCは別の二分細胞集団の存在とモザイクの疑いになります。これは、ジェノタイピング結果を再検討して、完璧な三重色体の不離散性に適合するか、またはX、Y、および18の染色体からのプローブでFISHによって確認できるかどうかを確認することによって確認することができます。また、この資料に記載されているソフトウェアを使用して、セクション 2.4.1 で説明するように、特定のゲートを設定して、ユーザーが実際に存在する場合はトリロイドセルを豊かにする特定の領域に集中することができます。
図10:(A)及び(C)における三脚概念を実証する代表的なフローサイトメトリー結果、および(B)における二枚状概念を示す。この図のより大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。
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Discussion
HMは異種病因を有する異常なヒト妊娠であり、異なる組織学的および好奇数型を有し、正確な分類および診断を困難にする。ヒト病理学的形態学的評価はしばしば不正確であることが証明され、したがって、HMをCHMおよびPHMに分類し、非臼頭流産と区別するために単独で信頼性が低い。したがって、HMの正確な診断には、多重マイクロサテライトDNAジェノタイピング、フローサイトメトリーによるプロイディ分析、FISHによるプロイディ分析、p57KIP2免疫組織化学などの他の方法を使用する必要があります。これらの方法にはそれぞれ独自の制限と利点があります。
多重ゲノタイピングとフローサイトメトリーの制限と利点
母体汚染はFFPE組織を使用する際に最も一般的な問題の1つであり、誤診を引き起こす可能性があり、したがって、母親をPOC組織から分離することの重要性を強調する。ジェノタイピングのピークに何を期待するかを考え、その解釈を助けるためには、母体汚染を特定することが重要です。汚染のレベルが大きすぎて、結果の信頼性の高い解釈を妨げる場合は、DNAの分離と抽出を繰り返し、可能なすべての母体組織を除去する場合は細分に注意してください。組織の形態が明確でない領域では、母体汚染の可能性を最小限に抑えるために、そのような領域を除去することをおり知らずに除去することをおそれが良いです。このプロトコルに記載されている方法の第一の利点は、その低コストに加えて、母体組織がスライドから取り除かれ、他の方法はPOC組織を収集することから成り立っている(空気にさらされたときに重合する溶液でそれらを覆うことによって)。母体組織を取り除くことなく、組織を持ち上げる)。したがって、ここで説明する方法は、残りのPOC組織をもう一度見て、必要に応じて再きれいにし、しばしばそうであるように、それらのDNAを収集し、抽出することを可能にする。第二の利点は、我々は非常に染色されていないセクションとカバースリップマップスライドの使用とは対照的に、母体組織の除去を容易にする、滑ったH&E染色されたセクション上の組織をきれいにすることです。しかし、追加の染色はDNAをさらに分解する可能性があり、これはより多くのセクションを追加することによって補償される。
分析のための親のDNAの利用可能性は別の課題です。両方の親の存在は、ジェノタイピング結果の分析と解釈を大幅に容易にします。しかし、残念ながら、父親のDNAが入手できない場合が多く、特に事前固定や長期保存によりPOC DNAの品質が悪い場合に、分析が複雑になることがあります(作業時にはより頻繁に使用されます)再発HM)を使用します。さらに、母体の血液は、DNA抽出のために常に利用できるわけではない。このような場合、母体DNAは、前述の16としてFFPEブロックに存在する母体子宮内膜組織から抽出することができる。また、補助生殖技術の使用に起因するモル組織の特徴付けは、ほとんどの場合、ドナー(男性または女性)からのDNAが通常利用できないため、マイクロサテライト遺伝子型分析を複雑にする可能性があります。
最後に、ピークの高さの点で大きなピークが短くなる傾向があるという事実は、特にピークの高さが単一のピークに2回または1回の用量があるかどうかを判断するために使用する必要がある場合に、混乱のもう一つの可能な原因です。これを克服する1つの方法は、FFPE組織からのDNAの劣化性質により、大きな対立遺伝子サイズ(塩基対数)のピークが短くなる傾向があることを常に念頭に置いておき、より大きな対立遺伝子の増幅に使用できるDNAが少なくなることを念頭に置く必要があります。さらに、PCR断片の増幅が短いほど大きな断片の増幅にかかる時間が短く、DNAの指数関数的増幅はより大きなアレルの量が少なくなります。
フローサイトメトリーの主な欠点は、三葉同の概念が時々見逃される可能性があり、これはブロック内のCVの量が不十分であることが考えられることである。しかし、三葉同のピークの存在は、三部ロイドの決定的な徴候である。この方法は、このプロトコルを使用してトリソミ、テトラプロイドの概念、またはその他の異常を検出するのに十分な敏感ではないことに注意してください。テトラプロイドピークは細胞周期のG2相における二ピロイド細胞の同じピークに対応するため、テトラプロイドの概念はこのプロトコルでは検出できない。
これらの制限と課題を知ることは、間違いを減らすのに役立ちます。したがって、異なる方法で同じ組織を分析し、結果を比較し、それらが互いに一致していることを確認することが重要であり、時には必要です。そうでない場合は、結果を再検討し、分析を繰り返す必要があります。矛盾する結果を示したいくつかのケースでは、実験を繰り返し、元の問題を回避するために適切な注意を払うだけで不一致が解決されました。他のケースでは、組織切片にFISHなどの追加の方法を実行するか、適切なマーカーで追加のシンプレックスジェノタイピングを実行することによって、不一致を解決しました。
母体汚染の同定
母体DNAを持つPOC DNAの汚染を同定することに関しては、POCに伝達される母性対立遺伝子に加えて、POC内のすべての遺伝子座のすべての母性対立遺伝子の存在によって汚染のレベルが反映または認識されます。
図11Aでは、母体DNA汚染に起因するピークに「c」と標識されている。「c」でマークされたすべてのピークが母に存在し、3つのマーカーすべてにこれらの「c」ピークが表示されることに注意してください。2番目のマーカー(青色)の場合、母体は第2マーカーに対してホモ接合であるため、最初のマーカーの各「c」ピークよりも「c」で示される母体汚染ピークが高いことに注意してください。したがって、このマーカーでは汚染物質の高さが倍になります。このPOCでは、母体由来のピークはありません。言い換えれば、このPOCは母親から任意の対数を継承しませんでした。各マーカーには1つの本当のピークしか存在せず、このピークは母に存在しません。したがって、本当のピークは父親から来たに違いがあることを知っています。核型またはフローサイトメトリー分析のいずれかからのプロディ情報がジプロイディを実証することで、このPOCは起源とジプロイドの両方のアンドロゲンシスゲンであると結論付け入れ可能です。
さらに、図 11Aのこれら 3 つのマーカーは、マーカーごとに常に 1 つの実際のピークしか存在しないことが明らかになりました。ここに示されているマーカーは 3 つだけですが、多重キットには同じパターンを明らかにするマーカーが多く含まれていることが多くあります。このPOCは二重化であるので、各ピークに2つの用量がなければならない。この情報により、このPOCはアンドロゲンティック単精子であり、すべてのマーカーでホモ接合性であると結論付けることができます。
図11Bは、二重親POCを表す。最初のマーカーの最初のピーク(緑色)を横切る小さな黒いバーは、この実際のピーク内に存在する汚染の推定量を表します。「R」は、POC DNAから来るこのピークの実際の部分を示します。「c」は、母体DNAから来るこのピークの汚染物質部分を表す。汚染のレベルを特定するにはどうすればよいでしょうか。この場合、母親の対照の1つがPOCに存在しないため、マーカーが母親のヘテロジゴウスである場合に可能である。たとえば、"c" とラベル付けされた最初のマーカーの小さなピークは、これは他の母体継承ピークに対して予想される汚染レベルであることを示します。その結果、母体起源であるすべてのPOCピークは、汚染の少量のために、父方に受け継がれたピークよりもわずかに高くなります。図11Bの3番目のマーカー(黒色)の場合、汚染レベルは通常の量の2倍になると予想されます(母親はこの特定のマーカーに対してホモ接性であるため)、したがって、最初のピークには1回の用量しか存在しないため、1つは推測できます。POC で。
図11Cは、三重のディスパーミックPOCを示す。最初のマーカー (緑色) は、POC の 3 つのピークを示します。これらの3つのピークは同様の高さを持っているので、このPOCは三葉ロイドである可能性が高いと結論付けかねない。このマーカーの 3 番目のピークは、最初のピークよりも短いことに注意してください。これは、一般的な傾向として、より大きなピークが短くなる傾向があるために予想されます。第2のピークは、最初のピークよりもわずかに高く、これはバーと「c」によって示されているように、母体汚染の少量によって説明することができます。さらに、これら3つのピークのうちの2つは母親に存在しないため、父親から来たに違いない。これまでのところ、このマーカーは、POCが三重線(またはトリソミー)であり、染色体の余分なセットの起源が父性であることを示しています。また、POCは父親から2つの異なる対向性を継承したので、それは不離しい概念であることを示しています。
図 11Cの 2 番目のマーカー (青色) には、ピークが 2 つだけです。汚染のレベルを考慮した後、2 番目のピークは最初のピークよりも高く表示され、これは大きなピークが小さくなるように一般的な傾向にもかかわらずです (分析中に常に心に留めておく必要がある傾向)。したがって、その1つの大きなピークに2つの用量がある可能性が高い。これは、最初のマーカーがトリプロイディを示しているという事実によってもサポートされています。
最後に、図 11Cの 3 番目のマーカー (黒) は、トリプロイディを示す 3 つのピークを示しています。多重キットのほとんどのマーカーは異なる染色体から来るので、複数の異なるマーカー間で3つのアレンドルの同じ傾向を観察した後、POCが三重体であると確信して結論付け入れが可能です。また、このマーカーから、3つのピークのうち2つは父親から発生し、ディスパーミックの起源を確認することに注意してください。
図11:母体汚染の効果を示すジェノタイピング結果。上のパネルはPOCに属する対向性を示し、下のパネルは母親に属するものを示す。(A)では、POCはアンドロゲンティック単精子であり、汚染のレベルは矢印と文字「c」で強調表示されます。(B)では、POCは二重親であり、汚染のレベルは文字「c」で強調表示されます。(C)では、POCは三位一致のディスパーミックであり、汚染のレベルは文字「c」で強調表示されます。小さな黒いバーは、ピークの高さの大きさは母体の汚染から来ているかを示し、したがって、ピークの高さを比較する際に考慮する必要があります。X 軸はベースペアです。ラベルとベースペアのサイズは、わかりやすくするために省略されています。Y 軸はピークの高さを表し、わかりやすくするために図から同様に省略されています。この図のより大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。
チャレンジングなケースの例
多くの場合、3つの評価(すなわち、フロー、p57KIP2、および多重ジェノタイピング)を同時に持つことによってのみ結論に達することが可能でした。例えば、1例(808)は非臼頭流産と呼ばれた。前記病理学的評価は、POCのモル概念とジェノタイピング分析の疑いにつながる、明確に3つのピークを示した1つのマーカーを明らかにしました(父から2つ、母親から1つ)。p57KIP2の結果は決定的ではなかった。フローサイトメトリー分析は、FISH分析で確認された小さな三葉状ピークを明らかにし、別の二球細胞集団の存在も排除した。FISHからの確認により、POCは確かに三元的な異性ほくろであると結論付けさせられた。
別の症例(1192)も非モル流産と呼ばれた。このPOCのCVは、母体組織と混ざり合い、壊死性も高く、洗浄プロセスは非常に困難でした。その結果、最初の遺伝子タイピング分析では、すべての母体対立遺伝子がPOCで見られるように、母体汚染の高レベルが示されました(汚染の可能性を示す良好な指標)。さらに、p57KIP2は残念ながら決定的ではなく、おそらく固定が遅れたために、組織の壊死性に起因する可能性が最も高い。しかし、フローサイトメトリーの結果は、FISHによっても確認された三型色を示すものでした。DNAは、汚染のレベルを低減し、不明確な形態を持つ組織を除去することを目的として再抽出されました。新しいジェノタイピング結果の分析は、母体汚染の可能性を考慮しながら、POCは三重のディスパーミックXXY PHMであると結論付けることができました。
表 4に、分析に使用される一般的な方法の概要を示します。HMおよび少なくとも1つのジェノタイピング法を疑わしいすべての組織に形態学的評価およびp57KIP2免疫組織化学を使用することをお勧めします。ジェノタイピング法の中で最も有益なのは、多重DNAジェノタイピングです。異なるメソッド間の結果が一致しない場合、または一部の結果が決定的でない場合は、他のジェノタイピング方法を使用する必要があります。この表は、可能な HM タイプごとに期待される一致した結果と、それらを解決するためのまれな例外と推奨事項を示しています。
表 4: 一般的な分析順序、期待される結果、およびまれな例外と、それらを解決するための推奨事項。P57KIP2免疫組織化学は、CDKN1C遺伝子によってコード化されたタンパク質であるp57KIP2の発現を検出することを目的としています。この遺伝子は、細胞質芽細胞芽細胞芽細胞および第1期胎盤の絨毛性間質に小児的に刻印され、母体ゲノムからのみ発現される。従って、POCにおける母体ゲノムの存在を容易かつ安価な方法で検出する補助マーカーとして使用される。HMと疑われるすべてのPOCに対してp57KIP2免疫組織化学を、形態学的評価と並行して行うことをお勧めします。著者の研究室では、材料の表に示されたp57KIP2抗体とプラットフォームが使用され、著者は結果の品質に非常に満足しています。略語: IHC = 免疫組織化学;ディップと= ディプロイドアンドロジェネティック;ディップビップ= ディプロイドバイペアレント;Chr = 染色体;MC = 流産;そしてTP=栄養芽細胞増殖。
著者の知る限りでは、この記事は、FFPE POC組織の低コストで高品質な多重マイクロサテライトDNAジェノタイピングと同様に、フローサイトメトリーのための詳細なプロトコルを提供する最初のものです。結果の解釈は、そのトラブルシューティングと他の方法との統合と共に、正確な結論とPOCとHMの診断に到達するために説明されています。著者らは、この複雑な実体を理解しようとする研究者にとって、この記事が役立つことを心から願っています。
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Disclosures
著者は何も開示していない。
Acknowledgments
著者らは、元のフローサイトメトリープロトコルを共有してくれたソフィー・パトリアーとマリアンヌ・パレシー、および供給と試薬を提供するためのプロメガとキアゲンに感謝しています。この研究は、レソー・ケベコイス・アン・リオー殖とカナダ保健研究所(MOP-130364)によってR.S.に支援されました。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| BD FACS Canto II | BD BioSciences | 338960 | |
| Capillary electrophoresis instrument: Genomes Applied Biosystems 3730xl DNA Analyzer | Applied biosystems | 313001R | Service offered by the Centre for Applied Genomics (http://www.tcag.ca) |
| Citric acid | Sigma | 251275 | |
| Cytoseal 60, histopathology mounting medium | Fisher | 23244257 | |
| Eosin Y stock solution (1%) | Fisher | SE23-500D | |
| FCSalyzer - flow cytometry analysis software | SourceForge | - | https://sourceforge.net/projects/fcsalyzer/ |
| FFPE Qiagen kit | Qiagen | 80234 | |
| Forceps | Fine Science Tools | 11295-51 | For sectioning and for the cleaning process |
| Glacial Acetic Acid (Concentrated) | Sigma | A6283-500mL | |
| Glass coverslips: Cover Glass | Fisher | 12-541a | |
| Hematoxylin | Fisher | CS401-1D | |
| Highly deionized formamide: Hi-Di Formamide | Thermofisher | 4311320 | |
| IHC platform: Benchmark Ultra | Roche | - | |
| Kimwipes | Ultident | 30-34120 | |
| Microtome | Leica | RM2135 | |
| Microtome blades | Fisher | 12-634-1C | |
| Nitex filtering mesh, 48 μm | Filmar | 74011 | http://www.filmar.qc.ca/index.php?filet=produits&id=51&lang=en ; any other filter is suitable, but this is an inexpensive and effective option from a non-research company |
| p57 antibody | Cell Marque | 457M | |
| Pasteur pipette | VWR | 53499-632 | |
| PCR machine | Perkin Elmer, Applied Biosystems | GeneAmp PCR System 9700 | |
| PeakScanner 1.0 | Applied Biosystems | 4381867 | Software for genotyping analysis. |
| Pepsin from porcine gastric mucosa | Sigma | P7012 | |
| Polystyrene round-bottom tubes | BD Falcon | 352058 | |
| Positively charged slides: Superfrost Plus 25x75mm | Fisher | 1255015 | |
| PowerPlex 16 HS System | Promega Corporation | DC2102 | |
| Propidium Iodide | Sigma | P4864 | |
| Ribonuclease A from bovine pancreas | Sigma | R4875 | |
| Separation matrix: POP-7 Polymer | Thermofisher | 4352759 | |
| UltraPure Agarose | Fisher | 16500-500 | |
| Xylene | Fisher | X3P1GAL |
References
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