Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Genetics
Click here for the English version

Genetics

דנ א של מיקרולוווין הגנוזות וזרימה Cy, בדיקות פלוטודיה של פורמאלין-קבוע פרפין-מוטבע רקמות טוחנת

Published: October 20, 2019 doi: 10.3791/60366
Automatic Translation
1, 2, 2, 1,2,3
1Department of Experimental Medicine, McGill University, 2Department of Human Genetics, McGill University, 3Department of Obstetrics and Gynecology, McGill University

Summary

שומות hydatidiform הם הריונות אנושיים חריגים עם aetiologies הטרוגנית שניתן סיווג על פי תכונות מורפולוגיות שלהם תרומת הורים הגנום הטוחנת. כאן, פרוטוקולים של הננו-DNA מיקרולוווין של דנ א וזרימה cy, הרקמה הקבועה של formalin-מוטבע הרקמות הטוחנת מתוארים בפרוטרוט, יחד עם התוצאות ' פרשנות ואינטגרציה.

Abstract

Hydatidiform שומה (HM) הוא הריון אנושי נורמלי מאופיין התפשטות trophoblastic מוגזמת ופיתוח עובריים חריגים. ישנם שני סוגים של HM מבוסס על הערכה מורפולוגית מיקרוסקופית, להשלים HM (CHM) חלקי HM (PHM). אלה יכולים להיות מחולקת עוד יותר על בסיס תרומת הורים הגנום הטוחנת. אפיון כזה של HM, לפי מורפולוגיה וניתוחי גנוטיפ, הוא חיוני לניהול המטופלים ולהבנה הבסיסית של הפתולוגיה הזאת מעניינת. זה מתועד היטב כי ניתוח מורפולוגית של HM הוא כפוף השונות הבינמתבונן רחב והוא לא מספיק על עצמו כדי לסווג במדויק HM לתוך CHM ו PHM ולהבדיל אותם מפני הפלות הלא טוחנת הידרופית. ניתוח הקלדה מבוצע בעיקר ב-DNA ורקמות מ-formalin קבוע פרפין-מוטבע (FFPE) מוצרים של תפיסה, אשר יש פחות מאשר איכות אופטימלית ולכן עלול להוביל למסקנות שגויות. במאמר זה, פרוטוקולים מפורטים עבור מולטיטפלקס והזרמת cy, ניתוח הרקמות הטוחנת של FFPE מסופקים, יחד עם הפרשנות של תוצאות שיטות אלה, פתרון בעיות שלהם, אינטגרציה עם הערכה מורפולוגית , p57KIP2 אימונוהיסטוכימיה, ו זריחה באתרו היברידיזציה (דג) כדי להגיע לאבחנה נכונה ואיתנה. כאן, המחברים חולקים את השיטות והלקחים שנלמדו במהלך 10 השנים האחרונות מהניתוח של כ 400 מוצרים של ההתעברות.

Introduction

שומה מולה (HM) הוא הריון אנושי נורמלי המאופיינת התפתחות עובריים חריגים, היפרהפצה של trophoblast פיצוץ, ו הידרוpic ניוון של villi כוריוני (CV). מבחינה היסטורית, HM היה מחולק לשני סוגים, להשלים HM (CHM) חלקי HM (PHM) מבוסס רק על הערכה מורפולוגית1. עם זאת, הוכח כי הערכה מורפולוגית לבד אינה מספיקה כדי לסווג HM לתוך שני סוגי המשנה (CHM ו-phm) ולהבדיל אותם מפני הפלות לא-טוחנת2,3,4.

בגלל CHM ו PHM יש נטיות שונים כדי ממאירות, ולכן חשוב לקבוע במדויק את סוג גנוטיפ של HM כדי לספק מעקב מתאים וניהול לחולים. כתוצאה מכך, בעשורים האחרונים פותחו מספר מתודולוגיות והתפתחו לצורך זיהוי התרומה הורית לרקמות הטוחנת ולהשגת סיווג נכון של HM. אלה כוללים ניתוח קריוטיפ, פולימורפיזם פסים כרומוזומלית, אנטיגן לוקיציט אנושי (hla) סרולוגית הקלדה, מגבלת אורך קטע ההגבלה, מספר משתנה של הטנדם חוזר, גנוטיפ מיקרולוווין, הזרמת cy, ו p57 KIP2 אימונוהיסטוכימיה. זה איפשר חלוקה מדויקת של התפיסות HM מבוסס על תרומת הורים כדי genomes שלהם, כדלקמן: CHM, אשר דיפלואידי דמוי מונוספרמיק או דיפלואידי אנדרוגנטי, ו phm, אשר הם triploid, מפזרים ב 99% ו מונוספרמיק ב 1% מהמקרים5,6,7,8. יתר על כן, יש עוד סוג של גנוטיפ של HM אשר התפתחה בשני העשורים האחרונים, אשר הוא דיפלואידי biparental ורים. האחרון הוא בעיקר וחוזר ועלול להשפיע על בן משפחה בודד (במקרים משפחתיים) או לפחות שני בני משפחה. אלה דיפלואידי הורים שומות נגרמות בעיקר על ידי מוטציות רצסיבי ב NLRP7 או KHDC3L בחולים9,10,11,12. Diploid ביורית HM בחולים עם מוטציות רצוניות ב NLRP7 ניתן לאבחן כמו CHM או phm על ידי ניתוח מורפולוגית וזה נראה קשור לחומרת המוטציות בחולים13,14. בנוסף לסיווג של HM על פי הגנוטיפים שלהם, המבוא והשימוש של מספר שיטות גנוסטי מותר את ההבחנה של ישויות טוחנת שונות מפני הפלות שאינן מולרי, כגון תפיסות הורים ו תפיסות מסוגים אחרים5,15. תפיסות כאלה אולי יש כמה התפשטות trophoblast פיצוץ ומורפולוגיה villous חריגים המחקים, במידה מסוימת, כמה תכונות מורפולוגיות של HM.

המטרה של מאמר זה היא לספק פרוטוקולים מפורטים עבור מולטיפלקס וזרימה cy, לזרום עם הרקמה הקבועה של הפרפין-מוטבע (FFPE) רקמות, וניתוחים מקיפים של תוצאות שיטות אלה ושילובם עם שיטות אחרות עבור אבחנה נכונה וחותכת של רקמות טוחנת.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

מחקר זה אושרה על ידי הלוח סקירה מוסדית מקגיל. כל המטופלים סיפקו הסכמה בכתב להשתתף במחקר ולקבל מוצרים FFPE שלהם של תפיסה (POCs) אוחזרו ממחלקות פתולוגיה שונים.

הערה: בעוד ישנן מספר שיטות לקביעת הגנוזות ולהגדרה פלויידי על ידי הזרימה cy, הפרוטוקולים המסופקים כאן לתאר שיטה אחת של ניתוח באמצעות פלטפורמה אחת לכל.

1. הקלדת הגנוזה

  1. בחירה של בלוק FFPE הטוב ביותר
    1. עבור כל מוצר FFPE של תפיסה (POC), להכין 4 μm-המטאוקסילין עבה ו אאוזין (H & E) סעיפים מוכתם כמתואר סעיפים 1.2 ו 1.3, אחד עבור כל בלוק זמין, עבור הערכה מורפולוגית על ידי מיקרוסקופ.
    2. באמצעות שקופיות H & E ומיקרוסקופ אור, בחר את בלוק FFPE כי יש את הכמות הגדולה ביותר של villi כוריוני (CV), ואם אפשרי, את הבלוק כי יש קורות חיים נפרד, ולא התערבבו עם, רקמות אימהי.
  2. חלוקתה
    1. מניחים את הבלוק הנבחר על הקרח 15 דקות כדי להקל על החסימה.
    2. להתאים את המיקרוטומה כדי לגזור סעיפים כי הם 4 יקרומטר עבה עבור הערכה מורפולוגית מיקרוסקופית 10 יקרומטר עבה עבור חילוץ DNA.
    3. מניחים את הגוש הקר במיקרוטומה וחותכים קטע אחד מכל בלוק לצביעת H & E ו -10-30 סעיפים מהבלוק הנבחר, בהתאם לכמות קורות החיים בבלוק, להפקת דנ א.
      הערה: עבור בלוקים מלאים קורות חיים, 10 סעיפים מספיקים להפקת DNA. אם רק כ 10% של הבלוק מכיל קורות חיים בעוד השאר הם רקמות אימהי, אז 20 על 30 סעיפים נדרשים כדי להבטיח כמויות מספיקות של דנ א.
    4. באמצעות מלקחיים, להעביר כל קטע לאמבט מים 45 ° c. הרם את החלק ממרחץ המים עם שקופית טעונה באופן חיובי (טבלת חומרים) שמסומנת בעבר עם מספר הזיהוי לדוגמה באמצעות עיפרון.
    5. הצב את השקופיות המכילות את המקטעים בתנור ב-65 ° צ' כדי לאפשר למקטעים לדבוק בשקופיות. שמור את השקופיות עבור H & E בתנור במשך 25 דקות. שמור את השקופיות להפקת דנ א בתנור במשך 20 דקות.
      הערה: זמן הדגירה קצר יותר הופך את הרקמות מעט פחות מחסיד לשקופיות וכתוצאה מכך מקל על הסרת רקמות אימהי.
  3. כתמים של H & E
    1. אפשר לשקופיות להתקרר לטמפרטורת החדר (10 דקות).
    2. הכנה מגיב
      1. להכין פתרון עבודה אאוזין Y (0.25%) כלפי שולחן 1. מערבבים היטב ומאחסנים בטמפרטורת החדר.
      2. הכנת פתרון המטאוקסילין על ידי דילול תמיסת מניות של המטאוקסילין 5x במים (כלומר, מערבבים 80 מ ל של מים עם 20 מ ל של המטאוקסילין).
        הערה: לעטוף את מלאי התמיסה של המטאוקסילין בנייר כסף לאחסון.
    3. הכינו צנצנות מכתים עם הריאגנטים הנכון מתחת למכסה המנוע לפי שולחן 2.
    4. בצע את הצביעת ה-H & E על-ידי מיזוג השקופיות לתוך צנצנות המכתים המתאימות לתקופת הזמן הנכונה בהתאם לטבלה 2.
    5. הר 4 יקרומטר סעיפים עבור ניתוח מורפולוגית עם הרכבה בינונית ו coverslip עם שמיכות זכוכית (טבלת חומרים).
      הערה: הסעיפים 10 יקרומטר עבור הקלדה לא צריך להיות שמיכות.
    6. השאירו את הסעיפים 10 יקרומטר תחת מכסה המנוע עבור מינימום של 3 h על מנת להפיג את הריחות הרעילים כדי להתפזר.
      זהירות: כל צעדי הצביעה צריכים. להתבצע תחת מכסה המנוע מוצרי קסילן צריך להישמר מתחת למכסה המנוע כל הזמן, כי קסילן ריחות רעילים. כמו כן, יש להיפטר מקסילין וממטאוקסילין במכולות מיוחדות. ברגע שהמכולות הללו מלאות, יש להיפטר ממנו כפי שמומלץ על ידי ארגון הבטיחות של המעבדה.
ריאגנט כמות
פתרון מניות אאוזין Y (1%) 250 מ ל
80% אתנול 750 מ ל
חומצה אצטית קרחוני (מרוכז) 5 מ ל

טבלה 1: אאוזין Y פתרון עבודה (0.25%) כנה.

מגיב בשימוש (100 mL לכל סל) משך
1) קסילן 5 דקות
2) קסילן 5 דקות
3) 100% אתנול 2 דקות
4) 95% אתנול 2 דקות
5) 70% אתנול 2 דקות
6) 50% אתנול 2 דקות
7) מים מזוקקים 5 דקות
8) המטאוקסילין 4 דקות
9) מים מזוקקים 5 דקות
10) אאוזין 1 דקות
11) 95% אתנול 5 דקות
12) 100% אתנול 5 דקות
13) קסילן 5 דקות
14) קסילן 5 דקות

שולחן 2: ריאגנטים ומשכים עבור פרוטוקול הצביעת H & E.

  1. בידוד קורות חיים
    1. תחת stereomicroscope אור, השתמש מלקחיים וחתיכות קטנות של מגבונים נייר הלחלח (לוח חומרים) כדי לגרד רקמות אימהי לא רצויות מ-H & E-מוכתם 10 יקרומטר חלקים עבים.
      הערה: המטרה הסופית היא לשמור רק על קורות חיים או ממברנות עוברי (כאשר קיים) על השקופיות ובכך להסיר את כל הרקמות האחרות. שלב זה עשוי להזדקק להרבה זמן וסבלנות, בהתאם לבלוק, כפי שהוא דורש תשומת לב קפדנית לפרטים.
    2. יש אדם שני לבדוק את השקופיות לאחר ניקוי כדי לוודא שהם חופשיים של רקמות אימהי.
    3. צלם תמונות של השקופיות הנקיות או תעד את הפרטים הבאים כדי לסייע בפענוח נתונים: 1) אם הרקמה הייתה קשה לניקוי, דימום או ניקוי מאוד, 2) מספר הסעיפים המשמשים ו-3) הכמות המשוערת של רקמות נקיות.
      הערה: איור 1 מספק דוגמה לשקופית קלה לניקוי. עבור גוש המכיל בערך כמות זו של קורות חיים, 10 סעיפים מספיקים להפקת DNA. השקופית באיור 2 יש מעט מאוד קורות חיים כי הם התערבבו עם רקמות אימהי, מה שהופך אותו קשה מאוד זמן רב לנקות. עבור גוש המכיל בערך כמות זו של קורות חיים, 30 סעיפים נחוצים להפקת ה-DNA.
    4. לאסוף את קורות החיים באמצעות פיסות מגבונים קטנים לחלח. באמצעות מלקחיים, לקרוע חתיכה קטנה מתוך מגבונים לחלח ולהשתמש בו כדי לאסוף את קורות החיים.
    5. מניחים את פיסות הנייר עם קורות החיים המצורפים שלהם לתוך שפופרת מתויג 1.5 mL.
    6. מזער את כמות מגבונים הנייר המשמשים בשלב זה כמו יותר מדי עשוי לסתום את עמודת החילוץ DNA וכתוצאה מכך להקטין את הסכום הסופי של ה-DNA שנאסף. בממוצע, המטרה היא להשתמש בפחות משבעה פיסות נייר קטנות לכל מדגם. אם זה לא אפשרי עקב נוכחות של כמויות גדולות של קורות חיים, לפצל את המדגם בין שתי שפופרות כדי להקל על החילוץ.

Figure 1
איור 1: שקופית ייצוגית להקלדת הגנוזה. למעלה: שקופית שצריך "לנקות" כדי להיות חופשי של רקמות אימהי. בתחתית: אותה שקופית המוצגת לאחר ניקוי וכעת היא מכילה רק קורות חיים עבור חילוץ ה-DNA. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.

Figure 2
איור 2: שקופית ייצוגית להקלדת הגנוזה. למעלה: שקופית שצריך "לנקות" כדי להיות חופשי של רקמות אימהי. בתחתית: אותה שקופית המוצגת לאחר ניקוי וכעת היא מכילה רק קורות חיים עבור חילוץ ה-DNA. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.

  1. בצע את הפרוטוקול של חילוץ ה-DNA מערכת FFPE (לוח חומרים) כדי לבצע חילוץ dna.
    הערה: ערכות מסוימות ממליצים על שימוש ב-15 עד 20 μL של מאגר הימנעות עבור האחרון. מניסיון, הימנעות עם 15 μL של מאגר הימנעות עובד היטב עבור רוב הדגימות. דילול עשוי להיות מוכן DNA מלאי לפי הצורך.
  1. כימות דנ א
    1. באמצעות מכשיר ספקטרוסקופיה מעבדה, טען 1 μL של DNA ולמדוד ספיגת bance ב 260 nm עבור כימות.
    2. טען 1 μL של ה-DNA על 2% העלה ג'ל והפעל אלקטרופורזה ג'ל במתח של 80-100 V להערכה איכותית.
    3. בהתבסס על התוצאות של שלבים 1.6.1 ו 1.6.2, לבחור את הנפח של ה-DNA כדי לשמש במגה-בתים קצרים החוזר המקביל (STR) פולימראז תגובת שרשרת (PCR) הגברה. המטרה להשתמש לפחות 1000 ng של ה-DNA בהגברה הPCR שלהלן.
      הערה: איור 3 מדגים את הדוגמאות הנציגים של ג'ל יחד עם ריכוזי ה-dna (על בסיס התוצאות של הספקטרוסקופיה), ואת נפח של פתרון ה-dna כי הוא מומלץ עבור מולטיפלקס ה-PCR העוקב.

Figure 3
איור 3: ג'ל מייצג לקוונפיקציה של דנ א. כלולים הם ריכוזים של כל דנ א, כפי שנמדד באמצעות ספקטרוסקופיה, ואת הכמויות המשמשות את ה-PCR הקולנוע. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.

  1. הגברה הPCR
    1. ביצוע שימוש במיקרו-לווין פלורסצנט באמצעות מערכת STR מולטיקלבית (טבלת חומרים).
    2. השתמש בתנאי ה-PCR המוצגים באיור 4 עבור הגברה ה-pcr באמצעות מערכת ה-STR (טבלת חומרים).
      הערה: התחל הבאים משמשים במערכת הקולנוע הזאת STR: D18S51, D21S11, TH01, D3S1358, פנטאה E, FGA, TPOX, D8S1179, vWA, Amelogenin, CSF1PO, D16S539, D7S820, D13S317, D5S818, ופנטאה D.

Figure 4
איור 4: התנאים של מחזור ה-PCR עבור מערכת STR. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.

  1. לפתור את מוצרי ה-PCR על ידי אלקטרופורזה קפילר.
    1. השהה 1 μL של כל מדגם מוגבר ב-0.5 μL של נתיב התקן הפנימי של המערכת במגה-בוני ו9.5 μL של המערך הגבוה ביותר (טבלת חומרים).
    2. הפעל דגימות דרך מכשיר אלקטרופורזה בכלי (לוח חומרים) באמצעות מטריצת הפרדה מתאימה (טבלת חומרים) לכלי הנגינה ולערכת הצבע של המערכת.
  1. ניתוח מידע
    1. לנתח את הנתונים עם התוכנה ניתוח קטע ה-DNA ולהשוות את POC אללים לאלס הורים כדי לקבוע את מקורם.
    2. התקן גודל.
      הערה: הדבר מאפשר לתוכנה לזהות את הסולם המשמש במערכת ה-STR, ולהקצות צמדי בסיס להמגברה המבוססת על הסולם. השלבים הבאים מוגדרים עבור תוכנה ספציפית אחת (טבלת חומרים) אך עשויה לסייע להקמת סוגי תוכנה אחרים גם כן.
      1. פתח את התוכנה. לחץ על התחל פרוייקט חדש ולאחר מכן בתקן גודל חדש.
      2. תן לתקן הגודל שם (לדוגמה, ABI_600).
      3. בתיבה בשם הזן הגדרה סטנדרטית בגודל חדש: הזן את הפרטים הבאים: 60, 80, 100, 120, 140, 160, 180, 200, 225, 250, 275, 300, 325, 350, 375, 400, 425, 450, 475, 500, 550, 600. לאחר מכן לחץ על הוסף גודל (ים).
        הערה: המספרים שהוזנו יופיעו מתחת לתיבה שבצד ימין, הנקרא הגדרת תקן סטנדרטי (ראה איור 5).
      4. לחץ על שמור.
    3. לייבוא ולניתוח קובץ, לחצו על ' הוסף קבצים' ובחרו בקובץ fsa לניתוח. לחץ על הוסף קבצים נבחרים ולאחר מכן על אישור. לאחר מכן בצע את השלבים הבאים:
      1. אתר את העמודה גודל רגיל ובחר באפשרות ABI_600 (או באיזה שם שניתן לתקן הגודל).
      2. תחת שיטת ניתוח, לחץ על גודל ברירת מחדל-npp ולאחר מכן לחץ על כפתור ירוק לנתח .
      3. הקובץ מוכן כעת לתצוגה. כוונן את אפשרויות הצפייה כדי להציג את הנתונים כרצונך.
    4. שיטת פתרון בעיות
      הערה: התוכנה עלולה לעתים להיכשל בזיהוי פסגות וליישר אותן כראוי. זה קורה כאשר הפסגות נמוכות מדי או גבוהות מדי. שתי שיטות הניתוח הבאות יכולות לתקן זאת ויש לנסות לפני שמדגם נבדק מחדש.
      1. שיטת ניתוח 1 לפסגות גבוהות:
        1. לחץ על שיטת ניתוח חדשה והשם אותו פסגות גבוה (או שם אחר לפי העדפה אישית).
        2. לחץ על טווח ולאחר מכן על טווח חלקי עבור ניתוח ושינוי גודל. לאחר מכן הקלד ב- 100 עבור נקודת ההתחלה וגודל ההתחלה.
        3. עבור נקודת העצירה, הזן 10,000. עבור גודל העצירה, הזן 1000.
        4. לאחר מכן לחץ על מינימום שיא גבהים ולשנות את המספרים כגון סף שיא עבור הצבעים הוא כדלקמן: כחול: 50; ירוק: 50; צהוב: 20; אדום: 100; כתום: 5000.
        5. שמור את שיטת הניתוח החדשה.
      2. שיטת ניתוח 2 לפסגות נמוכות:
        1. לחצו על ' שיטת ניתוח חדשה ' והשם לו ' פסגות נמוכות ' (או שם אחר לפי העדפה אישית).
        2. לחץ על טווח ולאחר מכן על טווח חלקי עבור ניתוח ושינוי גודל. לאחר מכן הקלד ב- 100 עבור נקודת ההתחלה וגודל ההתחלה.
        3. עבור נקודת העצירה, הזן 10,000. עבור גודל העצירה, הזן 1000.
        4. לאחר מכן לחץ על דגלי איכות ולשנות את טווח המעבר כך שהוא קורא מ 0.5 ל 1. שנה את טווח האיכות הנמוכה כך שהיא קוראת מ 0.0 עד 0.0. שינוי להניח יניאריות להלן: מ (bp) 100.0 (bp) 800.0.
        5. שמור את שיטת הניתוח החדשה.
          הערה: עכשיו אפשר לנתח מחדש את הקובץ על ידי בחירת פסגות נמוך או פסגות גבוהה תחת שיטת ניתוח ולאחר מכן לחיצה על כפתור ירוק לנתח .

Figure 5
איור 5: מסך המציג את העורך הסטנדרטי גודל. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.

2. הזרמה הציקיתיים

  1. בחירת בלוק האידיאל FFPE
    1. באמצעות שקופיות H & E ומיקרוסקופ קל, בחר בלוק FFPE בעל כ-50-70% מרקמות המורכב מקורות חיים.
      הערה: איור 6 הוא דוגמה מייצגת של בלוק המתאים לניתוח cy, שהוא מורכב מ50% קורות חיים (המחצית הימנית של המקטע) ו 50% רקמות אימהי (שמאל חצי). הנוכחות של רקמות אימהי חשוב כי הם משמשים כשליטה פנימית לפסגת דיפלואידי.
    2. עבור בלוקים שאין להם את הכמות האידיאלית של קורות חיים, להעשיר עבור קורות חיים כמו הציבור מבוצע. כדי לעשות זאת, לזהות איזה צד של סעיפים לחתוך טרי מכיל יותר קורות חיים על פי השקופית המתאימה H & E. בהתבסס על זה, להשתמש להב כדי לחתוך את החצי השני צריך להיות מושלך כדי להעשיר עבור קורות חיים.
      הערה: איור 7 מציג בלוק שאין לו קורות חיים מספיקים עבור הזרימה cy, try. עבור בלוקים כגון זה, הסעיפים צריכים להיות גזור כזה כי החצי המכיל פחות קורות חיים מקבל נמחק על מנת להגדיל את כמויות של קורות חיים ביחס לרקמות אימהי, כפי שמוצג בדמות. הקפד לגזור חלקים נוספים כדי לפצות על מה שנמחק.

Figure 6
איור 6: H &Amp; E מקטע המייצג בלוק POC כי הוא אידיאלי עבור cy try זרימה. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.

Figure 7
איור 7: H &Amp; E סעיף המייצג בלוק קשה יותר עבור cy, הזרימה הציטונסה. מקטע H & E של נציג זה מראה שרק במחצית התחתונה של סעיף זה יש להשתמש עבור הניתוח cy, לצורך זרימה, במטרה להעשיר את קורות החיים. אזור החלוקה לאזורים, המסומנת על-ידי קורות חיים, מורכב ברובו מקורות חיים. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.

  1. חלוקתה
    1. להשאיר את הבלוקים על הקרח 15 דקות כדי להקל על המחסומים.
    2. באמצעות לחסום ffpe הטוב ביותר, לחתוך ארבעה סעיפים כי הם 50 יקרומטר עבה (או 2 100 יקרומטר סעיפים עבים) באמצעות microtome.
      הערה: כדי להזרים cy, עדיף להיות חלקים עבים יותר.
    3. במקרה שבלוק FFPE אידיאלי אינו זמין, המטרה לשמור על היחס של קורות חיים לרקמות אימהי בכל זאת. לדוגמה, אם רק 30% של הבלוק מורכב קורות חיים בעוד השאר יש רקמות אימהי, ולאחר מכן להסיר לפחות חצי מהמקטע המכיל את רקמות אימהי ולהשתמש בסעיפים נוספים כדי לפצות (ראה איור 7).
    4. מניחים את המקטעים בשפופרות 15 מ ל.
      הערה: הקפד להקליט מעל התוויות מכיוון שהריאגנטים האורגני המשמש בשלב הבא יכול להמיס ולהסיר דיו.
  2. הפרוטוקול הציטוטרי של זרימה מרקמות FFPE
    1. לחות והתחדשות
      1. בצע את השטף הבא (שולחן 3) תחת מכסה המנוע.
      2. ממלאים את הצינור 15 מ"ל עם 6 מ ל של הכימית המתאימה, בעקבות ההזמנה שהוצגה בטבלה 3, להשאיר את הסעיפים הריאגנטים עבור הזמן המתאים, ולאחר מכן להסיר את החומרים מגיב באמצעות שאיבה ואקום זכוכית פסטר.
      3. בין כל שלב, טבול את הפיפטה הפסטר הראשון ב-70% אתנול, ואז במים מזוקקים, ולאחר מכן המשך לשלב הבא.
      4. להיזהר מאוד לא להסיר פיסות רקמה יחד עם הכימית. להטות את השפופרת 15 מ ל לזווית 60 מעלות כדי להקל על שאיבה של מגיב נוזלי ללא רקמות הציור.
        זהירות: הנוזלים הנמחקים מכילים קסילן ויש להיפטר ממיכלי פסולת קסילן.
    2. הכנה לפתרון
      1. הכינו את התמיסה הציטראט על ידי המסת 2 גרם של חומצת לימון ב-1 ל של מים מזוקקים כפולים. . הביאי את ה-pH ל -6 חנות ב -4 ° c.
      2. להכין פתרון פפסין על ידי המסת 0.01 g של פפסין ב 2 מ ל 9 חלקים לאלף הנאל, pH 1.64. . זה לדוגמא אחת
        זהירות: פפסין רעיל ויכול בקלות להתפזר ולהיות מוטס. לחבוש מסכה בעת טיפול פפסין בצורת אבקה ולנגב את כל אזור העבודה לאחר השימוש בו.
      3. Propidium יודיד (PI)-ribonuclease הכנה פתרון למדגם אחד.
        1. מערבבים 50 μL של PI עם 450 μL של PBS (כדי לדלל 10x).
        2. הוסף 50 μl של ריבונוקלאז A (1 מ"ג/mL) לתערובת. המשיכו לעטוף בנייר כסף כל הזמן.
    3. עיכול וכתמים
      1. הוסיפו מענה של 4 ° c מעלות ציטראט ל-15 הצינורות mL ומשם באמבט מים בגובה 80 ° c במשך 2 שעות.
      2. תנו לפתרון להתקרר לטמפרטורת החדר (15 דקות). הסר את התמיסה הציטראט.
      3. הוסף 6 מ ל של 1 x PBS, ומערבולת, והמתן 1 כדי 2 דקות כדי לאפשר לרקמות להתיישב בתחתית. הסירו את ה-PBS 1x באמצעות שאיבה ואקום וזכוכית פסטר.
      4. הוסף 1 מ ל של פתרון פפסין (מחומם ל37 ° c) ומניחים באמבט יבש בגודל 37 ° c למשך 30 דקות.. מערבולת כל 10 דקות הכן את ה-PI-ribonuclease פתרון ב -10 הדקות האחרונות של הדגירה.
      5. הוסף 6 מ ל של 1 x PBS, ומערבולת, והמתן 1 כדי 2 דקות כדי לאפשר לרקמות להתיישב בתחתית. הסירו את ה-PBS 1x באמצעות שאיבה ואקום וזכוכית פסטר.
      6. הוסף 550 μL של PI-ribonuclease פתרון ומניחים את הדגימות באמבטיה יבש 37 ° c עבור 30 דקות.
        הערה: בשלב זה, ניתן לעטוף את הדגימות בנייר כסף ולהשאיר את הלילה בארבע מעלות צלזיוס עד הבוקר שלמחרת.
      7. סנן את הפתרון באמצעות רשת סינון של 48-μm. לאסוף את פילטרט פוליסטירן התחתון שפופרות עגול, אשר ניתן להשתמש עם cytometer זרם. השתמש מלקחיים למקום 5 ס"מ על 5 ס מ פיסת סינון של רשת בחלק העליון של הצינור, כך הנוזל יכול להיות מצינור דרך הרשת לתוך הצינור.
        הערה: הדגימות מוכנות כעת לפעול. עם הציטומטר הזורם השאר אותם עטופים בנייר כסף עד שהם מוכנים לפעול.
    4. הפעל דגימות עם cytometer זרם עם העזרה של הארגון cy, לנסות את טכנאי פלטפורמת.
      הערה: ערוץ PE משמש כדי לזהות את ה-DNA מוכתם PI ואת קצב הזרימה צריך להיות איטי במהלך הרכישה. ודא כי המתח נבחר כך השיא דיפלואידי הוא בערך ב 200 לאורך הציר PE-A-x כדי להקל על ניתוח ופרשנות. המטרה להקליט מינימום של 20,000 אירועים לכל מדגם.
מגיב בשימוש (6 מ ל כל אחד) משך
1) קסילן 2 x 10 דקות
2) 100% אתנול 2 x 10 דקות
3) 95% אתנול 10 דקות
4) 70% אתנול 10 דקות
5) 50% אתנול 10 דקות
6) מים מזוקקים 2 x 10 דקות

שולחן 3: ריאגנטים ומשכי זמן לדפסיזציה ולחות מחדש.

  1. הזרמת מידע
    1. ניתוח נתונים בעזרת התוכנה לניתוח cy,שולחן חומרים.
      הערה: השלבים הבאים מוגדרים עבור תוכנה ספציפית אחת (טבלת חומרים) אך עשויה לסייע להקמת סוגי תוכנה אחרים גם כן.
      1. לאחר הפעלת דגימות על cytometer זרימה, להוריד FCS 2.0 קבצים לניתוח.
      2. פתח את זרימת תוכנת ניתוח cy, לחץ על הקובץ | מסמך חדש.
      3. לחץ על סמל ההיסטוגרמה () ולאחר מכן גרור את המצביע כדי ליצור מלבן.
      4. אתר את הקובץ FCS ולאחר מכן לחץ על פתוח. לאורך ציר ה-x, לחץ על Fcs-a ולאחר מכן בחר PE-a.
      5. לחץ על הסמל נקודה התוויה () ולאחר מכן גרור את המצביע כדי ליצור מלבן אחר מתחת להתוויה של ההיסטוגרמה. לאחר מכן אתר את אותו קובץ FCS שנבחר עבור ההיסטוגרמה.
      6. שנה את ציר ה-x של מגרש הנקודה ל- pe-A ואת ציר ה-y ל- pe-W.
        הערה: איור 8A ממחיש את המראה של המגרשים בשלב זה.
      7. לחץ על סמל האזור () וצייר תיבה על העלילה נקודה שמתחילה לפני שיא דיפלואידי (סביב 100 על ציר ה-x באיור 8ב) וזה מסתיים סביב 700 על ציר ה-x, כפי שמוצג בהתוויה נקודה באיור 8 ב.
        הערה: שיא דיפלואידי באיור 8 הוא בערך ב 200 על ציר ה-x. זה נבחר באופן שרירותי כפי הדגימות מוקלטות דרך cytometer הזרימה, פשוט כדי להקל על ניתוח ופרשנות של התוצאות.
      8. לחץ על העלילה | ערוך אזורים/שערים, ולאחר מכן הקלד R0 בתא הנמצא ליד התא G0 תחת אסטרטגיה. לאחר מכן לחץ על סגור.
      9. לחץ במקום כלשהו על ההיסטוגרמה, ולאחר מכן על העלילה | עיצוב מגרש/שכבת-על. תחת שער, בחר G0 = R0 ולאחר מכן לחץ על אישור.
        הערה: זהו הצעד המאפשר לאדם להמחיש טוב יותר את פסגות הפלואידיות. כעת ההיסטוגרמה תיראה כמו ההיסטוגרמה באיור 8B. ניתן לשחק עם השער שנוצר (על ידי הזזת התיבה שצוירה בשלב 2.4.1.7) כדי להתמקד באזורים מסוימים של העלילה נקודה.
      10. כדי לתייג את החלקות, לחץ על סמל אזור הטקסט () ולאחר מכן גרור את המצביע כדי ליצור תיבה בחלק העליון של המסמך ולאחר מכן הקלד את המידע הבא: מזהה מטופל, POC id והבלוק המשמש (כיוון שייתכן שיהיו מספר בלוקים עבור POC אחד) , אחוז קורות חיים נוכח בבלוק, מתח המשמש להפעלת המדגם, ואת התאריך.

Figure 8
איור 8: תמונת מסך המציגה היסטוגרמה ומגרש נקודה של מדגם מייצג שאינו מגודר (a) ומגודרת (ב). אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

המורכבות של רקמות טוחנת והעובדה כי יש להם גנוטיפים שונים מחייב ניתוח קפדני ושימוש בשיטות מסוימות כגון הערכה מורפולוגית, p57 אימונוהיסטוכימיה, גנוזה מיקרולווין, זרימה cy, ודגים. לדוגמה, מטופל אחד (1790) הופנה עם שני PHM שנמצאו להיות triploid על ידי ניתוח microarray של POCs בלבד. המטופל אובחן אפוא עם PHM חוזרות ונשנות. מיקרולוווין גנוטיפ של שני שלה "PHM" יחד עם ה-DNA של החולה והשותף שלה גילה כי בעוד השומה הראשונה של המטופל הוא triploid הדימיק (איור 9א), שלה השני "phm" יש גנוtype digynic דייינאיד (איור 9 B) ולכן הוא לא PHM, אלא הפלה שאינה טוחנת.

הסמן הראשון באיור 9א (בשחור) מציג שתי פסגות ב-POC. השיא הראשון נובע האם, כי רק האם יש שיא של גודל זה. בעקבות אותה ההיגיון, השיא השני נובע האב מאז הוא חולק את אותו allele. שים לב איך הפסגה השנייה היא הרבה יותר גבוה מאשר הראשון, המציין כי יש כנראה שתי מנות של אותו אלל אבהי באותה פסגה. זיהום אימהי, אשר יהיה מוסבר בפירוט רב יותר מאוחר יותר, הוא מאוד מינימלי ב POC זה כי POC מציג שיא זעיר מאוד במיקום של allele אימהי השני.

הסמן השני באיור 9א (בכחול) מציג שלוש פסגות ב-POC. שתיים מפסגות אלה מקורם האב ואחת מהאמא. לפיכך, ברור שוב מסמן זה כי יש שלושה אללים הנמצאים POC, שניים מן האב ואחד מן האם. הסמנים השלישי והרביעי באיור 9א דומים לסמן הראשון, וגם מראים שני אללים שבאים מאב ואחד מהאמא.

מאז כל ארבעת הסמנים בעקביות להראות שלושה אללים (לפי מינון או על ידי נוכחות של שלושה אללים בגדלים שונים), שניים שמקורם האב ואחד מן האם, אפשר להסיק כי POC זה הוא triploid מפזרים, ומאשרת את האבחנה של PHM.

כל ארבעת הסמנים באיור 9ב שוב להראות שלושה alleles: הסמן הראשון מראה שתי מנות בשיא הראשון שמקורם האם ומנה אחת בשיא השני שמקורו של האב. הסמנים השני והרביעי מראים שלוש פסגות שונות (כלומר, שלושה אללים שונים), שניים מהם הם מהאמא. הסמן השלישי מראה מנה אחת בשיא הראשון שמקורם האב ושתי מינונים בשיא השני שמקורם האם. לכן, POC זה הוא triploid digynic במקור מאז שני סטים של כרומוזומים באים האם וערכה אחת מגיע האב. לכן, הפלה שאינה טוחנת.

Figure 9
איור 9: התוצאות הייצוגיות של החולה 1790. (א) לבחור תוצאות הגנוטיפ של התפיסה הראשונה של המטופל מראה הטריפלואיד מדימת מיקרופון. (ב) לבחור את תוצאות ה-גנוטיפ מתוך התפיסה השנייה של המטופל מראה גנומית digynic. ציר ה-x ממוקם בזוגות בסיסים; התוויות וגדלי זוג הבסיסיים הושמטו לפשטות. ציר y מייצג את גובה השיא והוא מושמט באופן דומה מדמות לפשטות. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.

המטופל הזה היה מוטעה בתחילה עם שני PHM והיה חשש לגבי סיכון מוגבר של שומות יותר כאשר היה לה PHM אחת. במקרה זה מדגיש את המגבלה של מיקרו מערך SNP ב-POC לבד. מיקרוarray SNP היא שיטה רבת עוצמה, והוא הטוב ביותר לזהות aneuploidies של כרומוזום כלשהו (trisomies, מונוסודים, או גנוטיפים לא diploid); עם זאת, כאשר מבוצעת על POC לבד ללא ניתוח ה-DNA הורים, המקור של הטריפלויידי לא ניתן לקבוע. להסברים נוספים על ניתוח הגנוטיפ ופרשנות, נא לעיין במחקר של מרפי ואח '16.

תוצאות מייצגות המוצגות באיור 10A הן של ההתעברות הטרידואיד. הערכים של ציר ה-x מייצגים את תוכן ה-DNA הגרעיני. לדוגמה, 200 הוא מספר שרירותי הניתן לתאים המכילים כמות מסוימת של תוכן DNA גרעיני. לכן, שיא ב 400 מייצג תאים המכילים כפול את כמות התוכן DNA גרעיני לעומת הפסגה 200. השיא הקטן סביב 300 מייצג תוכן ה-DNA גרעיני כי הוא בין 200 ו 400 שיא ולכן הפסגה triploid. שימו לב כיצד תפיסת הדיפלואיד (איור 10ב) אינה מכילה כל שיא בערך 300.

במקרים מסוימים, פסגת triploid הוא מאוד עדין (איור 10ג). בכל פעם שניכרת שיא triploid בקושי, חשוב תחילה לשקול את כמות קורות החיים שהיו נוכחים בסעיפים המשמשים את הניתוח cy, try הזרימה. אם הסעיפים היו פחות מ -20% קורות חיים, אז סביר להניח שהוא מהווה טריפלויידי אמיתי שכן הוא צפוי להיות שיא נמוך מאוד. אם הסעיפים שנלקחו היו כמויות גדולות של קורות חיים, POC הופך לחשוד בפסיפס עם נוכחות של האוכלוסייה הסלולרית דיפלואידי אחר. זה יכול להיבדק על ידי סקירה מחדש של תוצאות ה-גנוהקלדה כדי לראות אם הם מתאימים triploid המושלם או יכול גם להיות מאושר על ידי דגים עם בדיקה מתוך X, Y, ו 18 כרומוזומים. כמו כן, באמצעות התוכנה המתוארת במאמר זה, ניתן להגדיר שערים מסוימים, כפי שמתואר בסעיף 2.4.1, המאפשרים למשתמש להתמקד באזור מסוים כדי להעשיר עבור תאים triploid אם הם באמת קיימים.

Figure 10
איור 10: הזרימה הייצוגית התוצאות הפגינו להפגין תפיסות triploid ב (א) ו (ג), ו התפיסה דיפלואידי ב (ב). אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

HM הם הריונות אנושיים חריגים עם חבלות הטרוגנית יש סוגים שונים היסטולוגית ו-genotypic, מה שהופך סיווג מדויק שלהם ואבחון מאתגרת. הערכה מורפולוגית היפואוולוגית הוכחה לעתים קרובות מדויק, ולכן לא אמין על עצמו לסווג HM לתוך CHM ו PHM ולהבדיל אותם מפני שאינם טוחנת הפלות. לכן, אבחנה מדויקת של HM דורש שימוש בשיטות אחרות כגון הגנוטיפים של DNA מיקרולוווין, ניתוח הפלואידי על ידי הזרמת cy, האנליזה הפלופית של דג, ו p57KIP2 אימונוהיסטוכימיה. לכל אחת מהשיטות הללו יש מגבלות ויתרונות משלה.

מגבלות ויתרונות של מולטיטפלקס והזרמה של הציטומה

זיהום אימהי הוא אחד הבעיות הנפוצות ביותר כאשר עובדים עם רקמות FFPE ועלול להוביל לאבחון מוטעה, ובכך להדגיש את החשיבות של הפרדת האימהי מ POC רקמות. חשוב לזהות זיהום אימהי כדי לקבל מושג למה לצפות מפסגות הקלדה ולעזור עם הפרשנות שלהם. אם רמת הזיהום הוא גדול מדי ומונע פרשנות אמינה של התוצאות, ואז לחזור על בידוד DNA והפקת, לקיחת טיפול נוסף בהסרת כל רקמות אימהי אפשרי. באזורים שבהם המבנה של הרקמות אינו ברור, עדיף להסיר אזורים כאלה כדי למזער את הסיכוי לזיהום אימהי. היתרון הראשון של השיטה המתוארת בפרוטוקול זה, בנוסף לעלותו הנמוכה יותר, הוא שרקמות אימהי מוסרות מהשקופיות, בעוד ששיטות אחרות מורכבות מאיסוף רקמות POC (על-ידי כיסוי הפתרון הפילמור כאשר הם חשופים לאוויר והרמת הרקמות) ללא הסרת רקמות אמהי. השיטה המתוארת כאן מאפשרת לקחת מבט שנייה על רקמות POC הנותרים, לנקות אותם מחדש במידת הצורך, כפי שקורה לעתים קרובות, ולאחר מכן לאסוף ולחלץ דנ א מהם. היתרון השני הוא שאנחנו לנקות רקמות על uncoverslipped H & E חלקים ויטראז ', אשר מאוד מקלה על הסרת רקמות אימהי, בניגוד לשימוש בסעיפים מוכתם ומחליק מפה שמיכות. עם זאת, את הצביעת הנוסף עשוי לבזות עוד יותר את ה-DNA, וזה מפוצה על ידי הוספת סעיפים נוספים.

הזמינות של הדנ א של ההורים לניתוח היא אתגר נוסף. הנוכחות של שני ההורים מאוד מקלה על ניתוח ופרשנות של תוצאות הגנוזות. למרבה הצער, עם זאת, זה לעתים קרובות למדי את המקרה של ה-DNA של האב אינו זמין, אשר עשוי לפעמים לסבך את הניתוח, במיוחד במקרים שבהם האיכות של ה-DNA POC הוא עני עקב קיבעון מראש או אחסון לטווח ארוך (תכופים יותר כאשר עובדים עם HM חוזרות ונשנות). יתר על כן, דם אימהי יכול להיות לא תמיד זמין עבור חילוץ DNA. במקרים כאלה, ה-DNA אימהית ניתן לחלץ רקמות רירית הרחם אימהי נוכח בלוקים FFPE כפי שתוארו בעבר16. כמו כן, אפיון רקמות מולרי שנבעו מהשימוש בטכנולוגיות הרבייה בסיוע עשוי לסבך את ניתוח גנוטיפ של microsatellite משום, ברוב המקרים, DNA מן התורמים (זכרים או נקבות) הוא בדרך כלל לא זמין.

לבסוף, העובדה כי פסגות גדולות נוטים להיות קצרים יותר במונחים של גובה השיא הוא מקור אפשרי אחר של בלבול, במיוחד כאשר השיא הגבוה צריך לשמש כדי לקבוע אם יש שתי מנות או מנה אחת בפסגה אחת. אחת הדרכים להתגבר על זה היא תמיד לזכור כי פסגות של הגודל אלל גדול (מספר זוגות בסיס) נוטים להיות קצרים יותר, בשל האופי המום של ה-dna מרקמות ffpe, אשר עושה פחות dna זמין עבור הגברה של אלל גדול. בנוסף, הגברה קצרה יותר של מקטע ה-PCR אורכת פחות זמן מאשר אחת גדולה יותר, והגברה מעריכית של הדנ א מובילה לפחות כמויות גדולות יותר של אלולים גדולים יותר.

החיסרון העיקרי של הזרימה cy, מנסה להיות החמיץ לפעמים להחמיץ, וזה יכול להיות עקב כמויות מספיקות של קורות חיים בבלוק. עם זאת, הנוכחות של שיא הטריפלואיד היא אינדיקציה חותכת לטריפלויידי. שים לב כי שיטה זו אינה רגישה מספיק כדי לזהות trisomies, הטטרדואיד תפיסות, או aneuploiaatatttaat אחרים באמצעות פרוטוקול זה. תפיסות טטרפלואיד אינן מגילוי על-ידי פרוטוקול זה מכיוון ששיא הטטרפלואיד תואם לאותה הפסגה של תאי דיפלואידי בשלב G2 של מחזור התא.

הכרת המגבלות והאתגרים הללו מסייעת בהפחתת טעויות. לכן חשוב ולעיתים הכרחי לנתח את אותה רקמה עם שיטות שונות, להשוות את התוצאות, ולוודא שהם מconcordant אחד עם השני. אם הם לא, התוצאות צריך להיות שקלת משקל וניתוחים צריך לחזור. עבור מספר המקרים שהראו תוצאות סותרות, הסתירות נפתרו פשוט על ידי חזרה על הניסויים ולקחת טיפול הולם כדי למנוע את הבעיה המקורית. במקרים אחרים, הסתירות נפתרו על-ידי ביצוע שיטות נוספות כגון דגים על גבי מקטעי רקמות או על-ידי ביצוע הקלדה נוספת עם סמנים מתאימים.

זיהוי של זיהום אימהי

ביחס לזיהוי הזיהום של ה-dna POC עם דנ א אימהי, רמת הזיהום יהיה משתקף או מוכר על ידי נוכחות של כל אללים אימהי בכל המקום ב POC, בנוסף אללים אימהי (s) המשודרים POC.

באיור 11A, פסגות שמקורם זיהום DNA אימהי מתויג עם "c". שים לב כיצד כל שיא המסומן ב-"c" נמצא גם אצל האם, ואנו רואים את פסגות "c" בכל שלושת הסמנים. שים לב כי עבור הסמן השני (בכחול), שיא הזיהום אימהי המצוין על ידי "c" הוא גבוה יותר מאשר כל "c" שיא בסמן הראשון כי האם היא homozygous עבור הסמן השני; לפיכך, גובה הזיהום מוכפל לסימון זה. בPOC הזאת, אין פסגות נגזרות maternally. במילים אחרות, POC זה לא ירש כל אללים מהאמא. יש רק פסגה אחת אמיתית בכל סמן והשיא הזה אינו נוכח האם. לפיכך, אנו יודעים שהפסגות האמיתיות. הגיעו מהאבא עם מידע פלויידי מן או קריוטיפ או זרם cy, ניתוח הוכחת דיפלויידי, אפשר להסיק כי POC זה הוא גם אנדרוגנטי ממוצא diploidy.

יתר על כן, אלה שלושה סמנים באיור 11לגלות כי יש תמיד רק שיא אחד אמיתי עבור כל סמן. רק שלושה סמנים מומחש כאן, עם זאת, ערכות הקולנוע מגיעים לעתים קרובות עם סמנים רבים יותר כי גם לחשוף את אותו דפוס. מאז POC זה diploid, חייבים להיות שתי מנות בכל שיא. עם מידע זה, אנחנו יכולים להסיק כי POC זה הוא אנדרוספרמיק הhomozygous, והוא כל סמן בודד.

איור 11ב' מייצג את הPOC של דיפלואיד. הבר השחור הקטן מעבר לשיא הראשון של הסמן הראשון (בירוק) מייצג את כמות הזיהום המשוערת הקיימת בתוך הפסגה האמיתית. "R" מציין את החלק האמיתי של השיא הזה מגיע DNA POC; ה-"c" מייצג את החלק הזיהום של הפסגה הבאה מן ה-DNA אימהי. איך אפשר לזהות את רמת הזיהום? זה אפשרי, במקרה זה, כאשר סמן מheterozygous האם כי אחד האללים אימהי נעדר POC. הפסגה הקטנה בסמן הראשון מתויג עם "c," למשל, מציין כי זוהי רמת הזיהום כי יש לצפות את השיא הmaternally בירושה השני. אפוא, כל הפסגות POC כי הם ממוצא אימהי הם מעט גבוה יותר מאשר הפסגות בירושה פטרלי בגלל כמות קטנה נוספת של זיהום. עבור הסמן השלישי (בשחור) באיור 11B, רמת הזיהום צפוי להיות כפול הסכום הרגיל (כי האם היא homozygous עבור סמן ספציפי זה), ולכן ניתן להסיק כי יש רק מנה אחת בפסגה הראשונה בPOC.

איור 11ג ממחיש הטריפלואיד מפזרים POC מיקרופון. הסמן הראשון (בירוק) מראה שלוש פסגות ב-POC. מאחר ששלושת הפסגות האלה הם בעלי גבהים דומים, ניתן להסיק כי POC זה עשוי להיות triploid. שים לב שהשיא השלישי בסמן זה קצר יותר מהראשון. זה צפוי כי, כמגמה כללית, פסגות גדולות נוטים להיות קצרים יותר. הפסגה השנייה היא מעט גבוהה יותר מהראשון, וזה יכול להיות שנלקחו על ידי כמות קטנה של זיהום אימהי, כפי שמצוין על ידי הבר ו-"c." יתרה מזאת, שתיים מתוך שלוש הפסגות הללו אינן נמצאות בתוך האם, ולכן כנראה הגיע מהאב. עד כה, סמן זה מציין כי POC יכול להיות triploid (או טריזומיה) וכי המקור של קבוצה נוספת של כרומוזומים הוא אבהי. זה גם מצביע על כך שהיא התפיסה מפזרים, מאז POC ירש שני אללים שונים מהאבא.

הסמן השני (בכחול) באיור 11ג יש רק שתי פסגות. לאחר החשבונאות לרמת הזיהום, הפסגה השנייה נראית גבוהה יותר מהראשון, וזה למרות המגמה הכללית של פסגות גדולות להיות קטן יותר (מגמה שיש לזכור תמיד במהלך הניתוח). לכן, סביר להניח שיש שתי מנות בפסגה הגדולה הזאת. זה נתמך גם על ידי העובדה הסמן הראשון מעיד על טריפלויידי.

לבסוף, הסמן השלישי (בשחור) באיור 11ג מראה שלוש פסגות, שוב מעיד על טריפלויידי. כיוון שרוב הסמנים במגה-פלקס מגיעים מכרומוזומים שונים, ניתן להסיק בביטחון כי POC הוא triploid לאחר התבוננות במגמה זהה של שלושה אללים על פני מספר סמנים שונים. כמו כן, שים לב מסמן זה כי שתיים מתוך שלוש הפסגות מקורם האב, המאשר את מקור הדימויקרופון.

Figure 11
איור 11: תוצאות הגנוהקלדה מחישות את ההשפעה של זיהום אימהי. הלוחות העליונים מראים את האללים השייכים לPOC והלוחות התחתונות מציגים את אלה השייכים לאם. ב (א), POC הוא אנדרוספרמיק ורמת הזיהום מודגשת על ידי חץ והאות "c." ב (ב), POC הוא דיפלואידי ביוורי, ורמת הזיהום מודגשת על ידי האות "c". ב (ג), POC הוא הטריפלואיד מפזרים ורמת הזיהום מודגשת על ידי האות "C." הבארים השחורים הקטנים מראים כמה מפסגות השיא נובע מזיהום אימהי, ולכן יש לקחת בחשבון בעת השוואת שיא הגבהים. ציר ה-x ממוקם בזוגות בסיסים; התוויות וגדלי זוג הבסיסיים הושמטו לפשטות. ציר y מייצג את גובה השיא והוא מושמט באופן דומה מדמות לפשטות. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.

דוגמאות למקרים מאתגרים

עבור מספר מקרים, ניתן היה להגיע למסקנה בלבד על-ידי הוספת כל שלוש ההערכות בו זמנית (כלומר, זרימה, p57KIP2ומולטיפלקס). לדוגמה, מקרה אחד (808) הופנה כהפלה שאינה טוחנת. הערכת histopathological מובילה לחשד לתפיסה טוחנת וניתוח גנוטיפ של POC חשף סמן אחד שהראה בבירור שלוש פסגות (שניים מהאבא ואחד מהאמא). התוצאות p57KIP2 לא היו מכרעת. הניתוח הזורם cy, התגלה בשיא הטרידואיד הקטן שאושר בניתוח הדגים, אשר שלטו גם בנוכחותם של אוכלוסיה תאית מדידואיד אחרת. עם אישור של דג, זה היה אפשרי להסיק כי POC הוא אכן מטריפיאיד מפזר שומה.

מקרה נוסף (1192) הכונה גם הפלה לא טוחנת. קורות החיים של POC זה היו התערבבו עם רקמות אימהי היו נמק מאוד גם, מה שהופך את תהליך הניקוי מאוד מאתגר. כתוצאה מכך, ניתוח הגנוזות הראשון הראה רמה גבוהה של זיהום אימהי, כך כל אלל אימהי ניתן לראות POC (אינדיקציה טובה של זיהום אפשרי). יתר על כן, p57KIP2 היה למרבה הצער, כנראה בשל האופי נמק של הרקמה, אולי בגלל קיבעון מתעכב. הזרם cy, התוצאות, היתה העיד על טריפלויידי, אשר אושר גם על ידי הדג. ה-DNA הופק מחדש עם המטרה של הפחתת רמת הזיהום והסרת רקמות עם מורפולוגיה לא ברורה. ניתוח של תוצאות גנוזה החדש, בעוד חשבונאות לנוכחות סביר של זיהום אימהי, איפשר לנו להסיק כי POC היה triploid מפזרים XXY PHM.

טבלה 4 מתווה את השיטות האופייניות המשמשות לניתוח. מומלץ להשתמש בהערכה מורפולוגית ו p57KIP2 אימונוהיסטוכימיה על כל הרקמות החשודות של HM ושיטת הקלדה אחת לפחות. בין שיטות הגנוגרפיות, האינפורמטיבי ביותר הוא הגנוטיפים DNA של מולטיפלקס. כאשר תוצאות בין שיטות שונות אינן מconcordant או כאשר תוצאות מסוימות אינן חד-משמעית, יש להשתמש בשיטות אחרות של הקלדה. הטבלה ממחישה תוצאות concordant צפויות עבור כל סוג HM אפשרי יחד עם חריגים נדירים והמלצות כדי לפתור אותם.

Table 4

טבלה 4: סדר הניתוח האופייני, תוצאות צפויות וחריגים נדירים יחד עם המלצות לפתרונן. P57KIP2 אימונוהיסטוכימיה שואפת לזהות את הביטוי של P57KIP2, חלבון מקודד על ידי CDKN1C גנים. גן זה הוא מוטבע בטבע בתוך ציטוטרופוטפיצוץ ו משתית villous של השליה השליש הראשון והוא מבוטא רק מן הגנום אימהית. לכן משמש סמן משניים כדי לזהות, בדרך קלה וזולה, נוכחות של הגנום אימהי ב POC. מומלץ לבצע p57KIP2 אימונוהיסטוכימיה עבור כל מדעי המידע החשודים להיות HM במקביל הערכה מורפולוגית. במעבדה של המחבר, הנוגדן p57KIP2 פלטפורמות המצוין בטבלה של חומרים משמשים והמחברים מאוד מרוצים עם איכות התוצאות. קיצורים: IHC = אימונוהיסטוכימיה; מטבל ו = דיפלואידי אנדרוגנטי; מטבל Bip = הורים ביפלואיד; Chr = כרומוזום; MC = הפלה; ו-TP = trophoblastic התפשטות.

למיטב הידע של המחברים, מאמר זה הוא הראשון לספק פרוטוקולים מפורטים לצורך זרימה cy, כמו גם בעלות נמוכה ובאיכות גבוהה מיקרולוווין DNA הקלדה של רקמות FFPE POC. הפרשנות של התוצאות מתוארת גם, יחד עם פתרון בעיות שלהם שילוב עם אלה של שיטות אחרות כדי להגיע למסקנות מדויקות ואבחנות של POCs ו-HM. המחברים מקווים בכנות כי מאמר זה יכול להועיל עבור חוקרים מנסים להבין את הישות המורכבת.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

. למחברים אין מה לגלות

Acknowledgments

המחברים מודים סופי Patrier מריאן Parésy עבור שיתוף את הפרוטוקול המקורי cy, לנסות הפרוטוקולים, פרונגה ו Qiagen לספק אספקה וריאגנטים. עבודה זו נתמכת על ידי הרבייה והמכון הקנדי לחקר בריאות (מגב-130364) לR.S.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
BD FACS Canto II BD BioSciences 338960
Capillary electrophoresis instrument: Genomes Applied Biosystems 3730xl DNA Analyzer Applied biosystems 313001R Service offered by the Centre for Applied Genomics
(http://www.tcag.ca)
Citric acid Sigma 251275
Cytoseal 60, histopathology mounting medium Fisher 23244257
Eosin Y stock solution (1%) Fisher SE23-500D
FCSalyzer - flow cytometry analysis software SourceForge - https://sourceforge.net/projects/fcsalyzer/
FFPE Qiagen kit Qiagen 80234
Forceps Fine Science Tools 11295-51 For sectioning and for the cleaning process
Glacial Acetic Acid (Concentrated) Sigma A6283-500mL
Glass coverslips: Cover Glass Fisher 12-541a
Hematoxylin Fisher CS401-1D
Highly deionized formamide: Hi-Di Formamide Thermofisher 4311320
IHC platform: Benchmark Ultra Roche -
Kimwipes Ultident 30-34120
Microtome Leica RM2135
Microtome blades Fisher 12-634-1C
Nitex filtering mesh, 48 μm Filmar 74011 http://www.filmar.qc.ca/index.php?filet=produits&id=51&lang=en ; any other filter is suitable, but this is an inexpensive and effective option from a non-research company
p57 antibody Cell Marque 457M
Pasteur pipette VWR 53499-632
PCR machine Perkin Elmer, Applied Biosystems GeneAmp PCR System 9700
PeakScanner 1.0 Applied Biosystems 4381867 Software for genotyping analysis.
Pepsin from porcine gastric mucosa Sigma P7012
Polystyrene round-bottom tubes BD Falcon 352058
Positively charged slides: Superfrost Plus 25x75mm Fisher 1255015
PowerPlex 16 HS System Promega Corporation DC2102
Propidium Iodide Sigma P4864
Ribonuclease A from bovine pancreas Sigma R4875
Separation matrix: POP-7 Polymer Thermofisher 4352759
UltraPure Agarose Fisher 16500-500
Xylene Fisher X3P1GAL

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Szulman, A. E., Surti, U. The syndromes of hydatidiform mole. II. Morphologic evolution of the complete and partial mole. American Journal of Obstetrics & Gynecology. 132 (1), 20-27 (1978).
  2. Fukunaga, M., et al. Interobserver and intraobserver variability in the diagnosis of hydatidiform mole. The American Journal of Surgical Pathology. 29 (7), 942-947 (2005).
  3. Gupta, M., et al. Diagnostic reproducibility of hydatidiform moles: ancillary techniques (p57 immunohistochemistry and molecular genotyping) improve morphologic diagnosis for both recently trained and experienced gynecologic pathologists. The American Journal of Surgical Pathology. 36 (12), 1747-1760 (2012).
  4. Howat, A. J., et al. Can histopathologists reliably diagnose molar pregnancy? Journal of Clinical Pathology. 46 (7), 599-602 (1993).
  5. Banet, N., et al. Characteristics of hydatidiform moles: analysis of a prospective series with p57 immunohistochemistry and molecular genotyping. Modern Pathology. 27 (2), 238-254 (2014).
  6. Lipata, F., et al. Precise DNA genotyping diagnosis of hydatidiform mole. Obstetrics & Gynecology. 115 (4), 784-794 (2010).
  7. Buza, N., Hui, P. Partial hydatidiform mole: histologic parameters in correlation with DNA genotyping. International Journal of Gynecologic Pathology. 32 (3), 307-315 (2013).
  8. Fisher, R. A., et al. Frequency of heterozygous complete hydatidiform moles, estimated by locus-specific minisatellite and Y chromosome-specific probes. Human Genetics. 82 (3), 259-263 (1989).
  9. Murdoch, S., et al. Mutations in NALP7 cause recurrent hydatidiform moles and reproductive wastage in humans. Nature Genetics. 38 (3), 300-302 (2006).
  10. Parry, D. A., et al. Mutations causing familial biparental hydatidiform mole implicate c6orf221 as a possible regulator of genomic imprinting in the human oocyte. American Journal of Human Genetics. 89 (3), 451-458 (2011).
  11. Nguyen, N. M., Slim, R. Genetics and Epigenetics of Recurrent Hydatidiform Moles: Basic Science and Genetic Counselling. Current Obstetrics and Gynecology Reports. 3, 55-64 (2014).
  12. Sebire, N. J., Savage, P. M., Seckl, M. J., Fisher, R. A. Histopathological features of biparental complete hydatidiform moles in women with NLRP7 mutations. Placenta. 34 (1), 50-56 (2013).
  13. Nguyen, N. M., et al. Comprehensive genotype-phenotype correlations between NLRP7 mutations and the balance between embryonic tissue differentiation and trophoblastic proliferation. Journal of Medical Genetics. 51 (9), 623-634 (2014).
  14. Brown, L., et al. Recurrent pregnancy loss in a woman with NLRP7 mutation: not all molar pregnancies can be easily classified as either "partial" or "complete" hydatidiform moles. International Journal of Gynecologic Pathology. 32 (4), 399-405 (2013).
  15. Colgan, T. J., Chang, M. C., Nanji, S., Kolomietz, E. A Reappraisal of the Incidence of Placental Hydatidiform Mole Using Selective Molecular Genotyping. The International Journal of Gynecological Cancer. 26 (7), 1345-1350 (2016).
  16. Murphy, K. M., McConnell, T. G., Hafez, M. J., Vang, R., Ronnett, B. M. Molecular genotyping of hydatidiform moles: analytic validation of a multiplex short tandem repeat assay. The Journal of Molecular Diagnostics. 11 (6), 598-605 (2009).

Tags

גנטיקה סוגיה 152 הפסדים הרבייה שומה מולה טוחנת ההריון הפלה הגנוהקלדה STR הזרמת cy האנאפולואידי דיפלואידי הורים אנדרוגנטי
דנ א של מיקרולוווין הגנוזות וזרימה Cy, בדיקות פלוטודיה של פורמאלין-קבוע פרפין-מוטבע רקמות טוחנת
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Khawajkie, Y., Mechtouf, N., Nguyen, … More

Khawajkie, Y., Mechtouf, N., Nguyen, P., Slim, R. Microsatellite DNA Genotyping and Flow Cytometry Ploidy Analyses of Formalin-fixed Paraffin-embedded Hydatidiform Molar Tissues. J. Vis. Exp. (152), e60366, doi:10.3791/60366 (2019).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter