Summary

Genotipado de ADN microsatélite y análisis de ploidía de citometría de flujo de tejidos molares de parafina incorporados en parafina-involuntaria-incrustadas

Published: October 20, 2019
doi:

Summary

Los lunares hidatidiformes son embarazos humanos anormales con etiologías heterogéneas que se pueden clasificar según sus características morfológicas y la contribución parental a los genomas molares. Aquí, los protocolos de genotipado de ADN microsatélite multiplex y citometría de flujo de tejidos molares de parafina incrustados fijados por formalina se describen en detalle, junto con la interpretación e integración de los resultados.

Abstract

El lunar hidatidiformo (HM) es un embarazo humano anormal caracterizado por una proliferación trofoblástica excesiva y un desarrollo embrionario anormal. Existen dos tipos de HM basados en la evaluación morfológica microscópica, HM completa (CHM) y HM parcial (PHM). Estos pueden subdividirse aún más en función de la contribución parental a los genomas molares. Tal caracterización de HM, por morfología y análisis de genotipos, es crucial para el manejo del paciente y para la comprensión fundamental de esta patología intrigante. Está bien documentado que el análisis morfológico de HM está sujeto a una amplia variabilidad interobservador y no es suficiente por sí solo para clasificar con precisión hm en CHM y PHM y distinguirlos de abortos hidropicos no molares. El análisis de genotipado se realiza principalmente en EL ADN y los tejidos de los productos de concepción de parafina fijados en formalina (FFPE), que tienen una calidad inferior a la óptima y, por lo tanto, pueden conducir a conclusiones erróneas. En este artículo, se proporcionan protocolos detallados para el genotipado multiplex y análisis de citometría de flujo de los tejidos molares FFPE, junto con la interpretación de los resultados de estos métodos, su solución de problemas y la integración con la evaluación morfológica , inmunohistoquímica p57KIP2 e hibridación in situ por fluorescencia (FISH) para llegar a un diagnóstico correcto y robusto. Aquí, los autores comparten los métodos y lecciones aprendidas en los últimos 10 años del análisis de aproximadamente 400 productos de concepción.

Introduction

Un lunar hidatidiformo (HM) es un embarazo humano anormal caracterizado por un desarrollo embrionario anormal, hiperproliferación del trofototo y degeneración hidrográfica de vellosidades coriónicas (CV). Históricamente, HM solía dividirse en dos tipos, HM completo (CHM) y HM parcial (PHM) basado únicamente en la evaluación morfológica1. Sin embargo, se ha demostrado que la evaluación morfológica por sí sola no es suficiente para clasificar HM en los dos subtipos (CHM y PHM) y distinguirlos de los abortos espontáneos no molares2,3,4.

Debido a que CHM y PHM tienen diferentes propensiones a las neoplasias malignas, por lo tanto, es importante determinar con precisión el tipo genotípico de HM para proporcionar un seguimiento y un manejo adecuados a los pacientes. En consecuencia, en las últimas décadas, se han desarrollado y evolucionado varias metodologías con el fin de identificar la contribución parental a los tejidos molares y alcanzar una clasificación correcta de HM. Estos incluyen análisis de cariotipo, polimorfismo de bandas cromosómicas, tilometría serológica de antígeno leucocito humano (HLA), polimorfismo de longitud de fragmento de restricción, número variable de repeticiones en tándem, genotipado de microsatélites, citometría de flujo y p57 Inmunohistoquímica KIP2. Esto ha permitido una subdivisión precisa de las concepciones hm basadas en la contribución de los padres a sus genomas, de la siguiente manera: CHM, que son diploides androgenéticos androgenéticos o diploides dispermicos androgenéticos, y PHM, que son triploide, disperménico en 99% y monobrímico en el 1% de los casos5,6,7,8. Además, hay otro tipo de HM genotípico que surgió en las últimas dos décadas, que es diploide biparental. Este último es en su mayoría recurrente y puede afectar a un solo miembro de la familia (casos simplex) o al menos a dos miembros de la familia (casos familiares). Estos lunares biparentales diploides son causados principalmente por mutaciones recesivas en NLRP7 o KHDC3L en los pacientes9,10,11,12. Diploid biparental HM en pacientes con mutaciones recesivas en NLRP7 puede ser diagnosticado como CHM o PHM por análisis morfológico y esto parece estar asociado con la gravedad de las mutaciones en los pacientes13,14. Además de la clasificación de HM según sus genotipos, la introducción y el uso de varios métodos de genotipado permitieron distinguir las diversas entidades molares de los abortos espontáneos no molares, tales como concepciones biparentales diploides aneuploides y otros tipos de concepciones5,15. Tales concepciones pueden tener alguna proliferación de trofoblastos y morfología villosa anormal que imitan, hasta cierto punto, algunas características morfológicas de HM.

El propósito de este artículo es proporcionar protocolos detallados para el genotipado multiplex y la citometría de flujo de los tejidos de parafina incrustada en formalina-fijación (FFPE), y análisis exhaustivos de los resultados de estos métodos y su integración con otros métodos para diagnóstico correcto y concluyente de los tejidos molares.

Protocol

Este estudio de investigación fue aprobado por la Junta de Revisión Institucional de McGill. Todos los pacientes dieron su consentimiento por escrito para participar en el estudio y para que sus productos FFPE de concepción (POC) se recuperaran de varios departamentos de patología. NOTA: Si bien existen varios métodos para el genotipado y la determinación de la ploidía por citometría de flujo, los protocolos proporcionados aquí describen un método de análisis utiliz…

Representative Results

La complejidad de los tejidos molares y el hecho de que puedan tener varios genotipos requieren un análisis riguroso y el uso de varios métodos como la evaluación morfológica, la inmunohistoquímica p57, el genotipado de microsatélites, la citometría de flujo y el FISH. Por ejemplo, un paciente (1790) fue referido con dos PHM que se encontró triploide por el análisis de microarray de los POC solamente. Por lo tanto, el paciente fue diagnosticado con PHM recurrente. El genotipado m…

Discussion

Los HM son embarazos humanos anormales con etiologías heterogéneas y tienen diferentes tipos histológicos y genotípicos, lo que hace que su clasificación y diagnóstico precisos sean desafiantes. La evaluación morfológica histopatológica a menudo se demostró inexacta y, por lo tanto, no es fiable por sí sola para clasificar a HM en CHM y PHM y distinguirlos de los abortos espontáneos no molares. Por lo tanto, un diagnóstico preciso de HM requiere el uso de otros métodos como el genotipado de ADN multix micro…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Los autores agradecen a Sophie Patrier y Marianne Parésy por compartir el protocolo original de citometría de flujo, y Promega y Qiagen por proporcionar suministros y reactivos. Este trabajo fue apoyado por el Réseau Québécois en Reproduction y el Instituto Canadiense de Investigación Sanitaria (MOP-130364) a R.S.

Materials

BD FACS Canto II BD BioSciences 338960
Capillary electrophoresis instrument: Genomes Applied Biosystems 3730xl DNA Analyzer Applied biosystems 313001R Service offered by the Centre for Applied Genomics
(http://www.tcag.ca)
Citric acid Sigma 251275
Cytoseal 60, histopathology mounting medium Fisher 23244257
Eosin Y stock solution (1%) Fisher SE23-500D
FCSalyzer – flow cytometry analysis software SourceForge https://sourceforge.net/projects/fcsalyzer/
FFPE Qiagen kit Qiagen 80234
Forceps Fine Science Tools 11295-51 For sectioning and for the cleaning process
Glacial Acetic Acid (Concentrated) Sigma A6283-500mL
Glass coverslips: Cover Glass Fisher 12-541a
Hematoxylin Fisher CS401-1D
Highly deionized formamide: Hi-Di Formamide Thermofisher 4311320
IHC platform: Benchmark Ultra Roche
Kimwipes Ultident 30-34120
Microtome Leica RM2135
Microtome blades Fisher 12-634-1C
Nitex filtering mesh, 48 microns Filmar 74011 http://www.filmar.qc.ca/index.php?filet=produits&id=51&lang=en ; any other filter is suitable, but this is an inexpensive and effective option from a non-research company
p57 antibody Cell Marque 457M
Pasteur pipette VWR 53499-632
PCR machine Perkin Elmer, Applied Biosystems GeneAmp PCR System 9700
PeakScanner 1.0 Applied Biosystems 4381867 Software for genotyping analysis.
Pepsin from porcine gastric mucosa Sigma P7012
Polystyrene round-bottom tubes BD Falcon 352058
Positively charged slides: Superfrost Plus 25x75mm Fisher 1255015
PowerPlex 16 HS System Promega Corporation DC2102
Propidium Iodide Sigma P4864
Ribonuclease A from bovine pancreas Sigma R4875
Separation matrix: POP-7 Polymer Thermofisher 4352759
UltraPure Agarose Fisher 16500-500
Xylene Fisher X3P1GAL

References

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Cite This Article
Khawajkie, Y., Mechtouf, N., Nguyen, P., Slim, R. Microsatellite DNA Genotyping and Flow Cytometry Ploidy Analyses of Formalin-fixed Paraffin-embedded Hydatidiform Molar Tissues. J. Vis. Exp. (152), e60366, doi:10.3791/60366 (2019).

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