Microsatellite DNA genotypning och flödescytometri Ploidy analyser av formalin-fast paraffin-inbäddade Hydatidiform molar vävnader

Summary

Hydatidiform mullvadar är onormala mänskliga graviditeter med heterogena etiologier som kan klassificeras enligt deras morfologiska egenskaper och föräldrarnas bidrag till molar Genomes. Här beskrivs protokoll för multiplex mikrosatelliten DNA genotypning och flödescytometri av formalin-fast paraffin-inbäddade molar vävnader i detalj, tillsammans med resultat ' tolkning och integration.

Abstract

Hydatidiform Mole (HM) är en onormal mänsklig graviditet kännetecknas av överdriven trofoblastisk proliferation och onormal embryonal utveckling. Det finns två typer av HM baserat på mikroskopisk morfologisk utvärdering, komplett HM (CHM) och partiell HM (PHM). Dessa kan delas upp ytterligare baserat på föräldrarnas bidrag till molar genomerna. Sådan karakterisering av HM, genom morfologi och genotyp analyser, är avgörande för patientens ledning och för den grundläggande förståelsen av denna spännande patologi. Det är väl dokumenterat att Morfologisk analys av HM är föremål för stor interobserver variation och är inte tillräckligt på egen hand för att korrekt klassificera HM i CHM och PHM och skilja dem från och icke-molar aborter. Genotypning analys utförs främst på DNA och vävnader från formalin-fast paraffin-inbäddade (FFPE) produkter av befruktningen, som har mindre än optimal kvalitet och kan därför leda till felaktiga slutsatser. I denna artikel tillhandahålls detaljerade protokoll för multiplex genotypning och flödescytometri analyser av FFPE molar vävnader, tillsammans med tolkningen av resultaten av dessa metoder, deras felsökning, och integration med den morfologiska utvärderingen , P57^KIP2 immunohistokemi, och fluorescens in situ hybridisering (fisk) för att nå en korrekt och robust diagnos. Här delar författarna de metoder och lärdomar som har dragits under de senaste 10 åren från analysen av cirka 400 produkter av befruktningen.

Introduction

En hydatidiform mullvad (HM) är en onormal mänsklig graviditet kännetecknas av onormal embryonal utveckling, hyperproliferation av trofoblast, och och degeneration av korionvilli (CV). Historiskt, HM brukade delas in i två typer, komplett HM (CHM) och partiell HM (PHM) bygger endast på morfologisk utvärdering¹. Emellertid, det har visats att morfologisk utvärdering ensam är inte tillräckligt för att klassificera HM i de två subtyperna (chm och PHM) och skilja dem från icke-molar missfall^2,3,4.

Eftersom chm och PHM har olika benägenhet att maligniteter, är det därför viktigt att exakt bestämma genotypisk typ av HM för att ge lämplig uppföljning och förvaltning till patienterna. Under de senaste decennierna har därför flera metoder utvecklats och utvecklats i syfte att identifiera föräldra bidraget till molar vävnaderna och nå en korrekt klassificering av HM. Dessa inkluderar karyotyp analys, kromosomala banding polymorfism, humant leukocyt antigen (HLA) serologiska typning, begränsning fragment längd polymorfism, varierande antal tandem upprepningar, mikrosatelliten genotypning, flödescytometri, och P57 ^KIP2 immunohistokemi. Detta har tillåtit korrekt indelning av HM föreställningar baserat på föräldrarnas bidrag till deras genom, enligt följande: CHM, som är diploida Androgenetisk monospermic eller diploida Androgenetisk dispermic, och PHM, som är triploida, dispermic i 99% och monospermic i 1% av fallen^5,6,7,8. Dessutom finns det en annan genotypisk typ av HM som dök upp under de senaste två decennierna, som är diploida biparental. Det sistnämnda är oftast återkommande och kan påverka en enda familjemedlem (simplex-fall) eller minst två familjemedlemmar (familjella fall). Dessa diploida biföräldra mullvadar orsakas främst av recessiva mutationer i NLRP7 eller KHDC3L hos patienterna^9,10,11,12. Diploid från HM hos patienter med recessiva mutationer i NLRP7 kan diagnostiseras som chm eller PHM av Morfologisk analys och detta verkar vara förknippat med svårighetsgraden av mutationer i patienterna^13,14. Förutom klassificeringen av HM enligt deras genotyper tillät införandet och användningen av flera genotypningsmetoder distinktionen mellan de olika molar-enheterna från icke-molara missfall, såsom aneuploida diploida biföräldrars befruktningar och andra typer av befruktningar^5,15. Sådana föreställningar kan ha vissa trofoblastproliferation och onormal villösa morfologi som härma, i viss mån, några morfologiska egenskaper hos HM.

Syftet med denna artikel är att tillhandahålla detaljerade protokoll för multiplex genotypning och flödescytometri av formalin-fast paraffin-inbäddade (FFPE) vävnader, och omfattande analyser av resultaten av dessa metoder och deras integration med andra metoder för korrekt och avgörande diagnos av molar vävnader.

Protocol

Denna forskningsstudie godkändes av McGill institutions granskningsnämnd. Alla patienter gav skriftligt medgivande till att delta i studien och att få sina FFPE-produkter av befruktningen (POCs) hämtade från olika patologi avdelningar.

Anmärkning: Även om det finns flera metoder för genotypning och ploidi bestämning av flödescytometri, beskriver de protokoll som här beskrivs en analysmetod med en plattform för varje.

1. genotypning

1. Urval av de bästa FFPE blocket
   1. För varje FFPE produkt av befruktning (POC), Förbered 4 μm-tjock hematoxylin och eosin (H & E) färgade sektioner som beskrivs i avsnitten 1,2 och 1,3, en för varje tillgängligt block, för morfologisk utvärdering av mikroskopi.
   2. Med hjälp av H & E diabilder och ett ljusmikroskop, Välj den FFPE blocket som har den största mängden koriongonadotropin villi (CV), och om möjligt, blocket som har CV skild från, och inte blandas med, moderns vävnader.
2. Snittning
   1. Placera det valda blocket på isen i 15 min för att underlätta snittning.
   2. Justera mikrotomen för att skära sektioner som är 4 μm tjocka för mikroskopisk morfologisk utvärdering och 10 μm tjock för DNA-extraktion.
   3. Placera kylblocket i mikrotomen och skär ett avsnitt från varje block för H & E färgning och 10 − 30 sektioner från det valda blocket, beroende på mängden CV i blocket, för DNA-extraktion.
      Anmärkning: För block som är fulla av CV, 10 sektioner är tillräckliga för DNA-extraktion. Om endast cirka 10% av blocket innehåller CV medan resten är moderns vävnader, då 20 − 30 sektioner behövs för att säkerställa tillräckliga mängder av DNA.
   4. Med hjälp av pinps, överföra varje sektion till en 45 ° c vattenbad. Plocka upp avsnittet från vattenbadet med en positivt laddad bild (tabell över material) som tidigare märkts med provet identifikationsnummer med hjälp av en penna.
   5. Placera bilderna som innehåller sektionerna i en ugn vid 65 ° c så att sektionerna kan följa bilderna. Förvara bilderna för H & E i ugnen i 25 min. Förvara bilderna för DNA-extraktion i ugnen i 20 minuter.
      Anmärkning: Den kortare inkubationstiden gör vävnaderna något mindre anhängare till diabilderna och därmed underlättar avlägsnande av moderns vävnader.
3. H & E färgning
   1. Låt bilderna svalna till rumstemperatur (10 min).
   2. Beredning av reagens
      1. Förbered eosin Y arbetslösning (0,25%) per tabell 1. Blanda väl och förvara i rumstemperatur.
      2. Förbered arbetande hematoxylin lösning genom att späda stamlösning av hematoxylin 5x i vatten (dvs., blanda 80 mL vatten med 20 mL hematoxylin).
         Anmärkning: Wrap Stock lösning av hematoxylin i folie för lagring.
   3. Förbered färgning burkar med rätt reagens under ett draghuv enligt tabell 2.
   4. Utför H & E-färgning genom att dränka bilderna i lämpliga Färgnings bur kar under rätt tidsperiod enligt tabell 2.
   5. Montera 4 μm-sektionerna för Morfologisk analys med monteringsmedel och täckslip med glas täckband (tabell över material).
      Anmärkning: De 10 μm avsnitten för genotypning bör inte täckglas.
   6. Lämna 10 μm-sektionerna under draghuven i minst 3 timmar för att de giftiga xylenodorerna ska försvinna.
      Försiktighet: Alla färgning steg måste utföras under en draghuv. Xylenprodukter måste alltid hållas under huven eftersom xylenlukter är giftiga. Dessutom måste xylen och hematoxylin kasseras i särskilda behållare. När dessa behållare är fulla, de måste kasseras som rekommenderas av laboratoriets säkerhetsorganisation.

Reagens	Kvantitet
Eosin Y stamlösning (1%)	250 mL
80% etanol	750 mL
Koncentrerad ättiksyra	5 mL

Tabell 1: eosin Y-arbetslösning (0,25%) förberedelse.

Reagens som används (100 mL per bin)	Varaktighet
1) xylen	5 min
2) xylen	5 min
3) 100% etanol	2 min
4) 95% etanol	2 min
5) 70% etanol	2 min
6) 50% etanol	2 min
7) destillerat vatten	5 min
8) hematoxylin	4 minuters
9) destillerat vatten	5 min
10) eosin	1 min
11) 95% etanol	5 min
12) 100% etanol	5 min
13) xylen	5 min
14) xylen	5 min

Tabell 2: reagenser och varaktigheter för H & E-färgningsprotokollet.

4. Isolering av CV
   1. Under en ljus stereomikroskop, använda tång och små bitar av vatten-fuktade papper våtservetter (tabell över material) att skrapa bort oönskade moderns vävnader från H & E-färgade 10 μm tjocka sektioner.
      Anmärkning: Slutmålet är att hålla ingenting annat än CV eller foster membran (när det finns) på bilderna och därmed ta bort alla andra vävnader. Detta steg kan behöva mycket tid och tålamod, beroende på blocket, eftersom det kräver noggrann uppmärksamhet på Detaljer.
   2. Ha en andra person dubbelkolla bilderna efter rengöringen för att säkerställa att de är fria från moderns vävnader.
   3. Ta bilder av de rensade bilderna eller dokumentera följande för att hjälpa till med data tolkning: 1) om vävnaden var svår att rengöra, hemorragisk, eller mycket ren, 2) antalet sektioner som används, och 3) den ungefärliga mängden rengjorda vävnader.
      Bild 1 innehåller ett exempel på en bild som är lätt att rengöra. För ett block som innehåller ungefär denna mängd CV, 10 sektioner är tillräckliga för DNA-extraktion. Bilden i figur 2 har mycket få CV som blandas med moderns vävnader, vilket gör det mycket svårt och tidskrävande att rengöra. För ett block som innehåller ungefär denna mängd CV behövs 30 sektioner för DNA-extraktion.
   4. Samla in CV med hjälp av små fuktade bitar av papper våtservetter. Med hjälp av pincett, Riva en liten bit av den fuktade papper våtservetter och använda den för att samla in CV.
   5. Placera bitarna av pappersservetter med tillhörande CV i en märkt 1,5 mL tub.
   6. Minimera mängden papper våtservetter som används i detta steg som för mycket kan täppa till kolumnen DNA-extraktion och därmed minska den slutliga mängden insamlade DNA. I genomsnitt syftar till att använda mindre än sju små bitar av pappersservetter per prov. Om detta inte är möjligt på grund av närvaron av stora mängder CV, dela provet mellan två rör för att underlätta extraktionen.

Figur 1: representativ bild för genotypning. Överst: en bild som behöver rengöras för att bli fri från moders vävnad. Botten: samma bild som visas efter att den har rengjorts och innehåller nu inget annat än CV för DNA-extraktion. Vänligen klicka här för att se en större version av denna siffra.

Figur 2: representativ bild för genotypning. Överst: en bild som behöver rengöras för att bli fri från moders vävnad. Botten: samma bild som visas efter att den har rengjorts och innehåller nu inget annat än CV för DNA-extraktion. Vänligen klicka här för att se en större version av denna siffra.

5. Följ protokollet från DNA-extraktion från FFPE Kit (tabell över material) för att utföra DNA-extraktion.
   Anmärkning: Vissa kit rekommenderar att du använder 15 − 20 μL elueringbuffert för den slutliga elueringen. Från erfarenhet fungerar eluering med 15 μL elueringbuffert bra för de flesta prover. Spädningar kan framställas från beståndet DNA efter behov.

6. DNA-kvantifiering
   1. Använd en laboratorietspektrofotometer-apparat och fyll på 1 μL DNA och mät absorbans vid 260 Nm för kvantifiering.
   2. Fyll på 1 μL DNA på en 2-procentig agangel och kör gel-elektrofores med en spänning på 80 − 100 V för kvalitativ utvärdering.
   3. Baserat på resultaten av steg 1.6.1 och 1.6.2, Välj den volym av DNA som ska användas i multiplex kort tandem REPEAT (Str) polymeras kedjereaktion (PCR) amplifiering. Sträva efter att använda minst 1000 ng av DNA i den PCR-amplifiering som följer.
      Anm.: figur 3 visar representativa exempel på geler tillsammans med koncentrationerna av DNA (baserat på resultaten av spektrofotometer) och den volym av DNA-lösningen som rekommenderas för MULTIPLEX-Str PCR som följer.

Figur 3: representativ gel för DNA-kvantifiering. I detta ingår koncentrationerna av varje DNA, mätt med en spektrofotometer, och de kvantiteter som används för Multiplex-PCR. Vänligen klicka här för att se en större version av denna siffra.

7. PCR-amplifiering
   1. Utför fluorescerande mikrosatelliten genotypning med hjälp av ett multiplex Str system (tabell över material).
   2. Använd PCR-villkoren som visas i figur 4 för PCR-amplifiering med hjälp av MULTIPLEX Str-systemet (tabell över material).
      Anmärkning: Följande primers används i detta multiplex STR system: D18S51, D21S11, TH01, D3S1358, Penta E, FGA, TPOX, D8S1179, vWA, amelogenin, CSF1PO, D16S539, D7S820, D13S317, D5S818, och Penta D.

Figur 4: PCR-cykelvillkor för multiplex Str-systemet. Vänligen klicka här för att se en större version av denna siffra.

8. Lös PCR-produkterna genom kapillärelektrofores.
   1. Suspendera 1 μL av varje amplifierat prov i 0,5 μL av multiplex-systemets interna standard-Lane och 9,5 μL högavjoniserad formamid (tabell över material).
   2. Kör prover genom ett kapillärelektrofores instrument (tabell över material) med hjälp av en lämplig separations mat ris (tabell över material) för instrumentet och multiplex systemets färguppsättning.

9. Data analys
   1. Analysera data med en DNA-fragment analysprogramvara och jämföra POC alleler till föräldrarnas alleler att bestämma deras ursprung.
   2. Ställ in en storleks standard.
      Anmärkning: Detta gör att programvaran för att känna igen stegen som används i multiplex Str-systemet, och att tilldela basepairs till amplikonerna baserat på stegen. Följande steg är för en specifik programvara (tabell över material) men kan vara till hjälp för att ställa in andra typer av programvara också.
      1. Öppna programvaran. Klicka på Starta nytt projekt och sedan på ny storlek standard.
      2. Ge storleks standarden ett namn (t. ex. ABI_600).
      3. I rutan som heter Ange ny storlek standard definition: Ange följande: 60, 80, 100, 120, 140, 160, 180, 200, 225, 250, 275, 300, 325, 350, 375, 400, 425, 450, 475, 500, 550, 600. Klicka sedan på Lägg till storlek (er).
         ANMÄRKNINGAR: siffrorna som anges kommer att visas under rutan till höger, som heter aktuell storleks standard definition (se figur 5).
      4. Klicka på Spara.
   3. För att importera och analysera en fil, klicka på Lägg till fileroch välj FSA-filen som ska analyseras. Klicka på Lägg till valda filer och sedan på OK. Följ sedan dessa steg:
      1. Leta reda på kolumnen storlek standard och välj ABI_600 (eller vilket namn som har getts till storleks standarden).
      2. Under analysmetod, klicka på dimensionering default-NPP och klicka sedan på den gröna Analyze -knappen.
      3. Filen är nu klar för visning. Justera visningsalternativen för att visa data efter behov.
   4. Felsökning-analysmetod
      Anmärkning: Programvaran kan ibland misslyckas med att identifiera toppar och anpassa dem korrekt. Detta händer när topparna är antingen för låga eller för höga. Följande två analysmetoder kan korrigera för detta och bör prövas innan ett prov testas igen.
      1. Analysmetod 1 för höga toppar:
         1. Klicka på ny analysmetod och namnge den höga toppar (eller ett annat namn enligt personliga preferenser).
         2. Klicka på räckvidd och sedan på delområde för analys och dimensionering. Skriv sedan in 100 för startpunkten och Start storleken.
         3. För stopp punkten, ange 10 000. För stopp storlek, ange 1000.
         4. Klicka sedan på minsta topphöjder och ändra siffrorna så att topp tröskeln för färgerna är följande: blå: 50; Grön: 50; Gul: 20; Röd: 100; Orange: 5000.
         5. Spara den nya analysmetoden.
      2. Analysmetod 2 för låga toppar:
         1. Klicka på ny analysmetod och namnge den låga toppar (eller ett annat namn enligt personliga preferenser).
         2. Klicka på räckvidd och sedan på delområde för analys och dimensionering. Skriv sedan in 100 för startpunkten och Start storleken.
         3. För stopp punkten, ange 10 000. För stopp storlek, ange 1000.
         4. Klicka sedan på kvalitets flaggor och ändra pass intervallet så att det läser från 0,5 till 1. Ändra det låga kvalitets intervallet så att det läser från 0,0 till 0,0. Ändra anta linearity till följande: från (BP) 100,0 till (BP) 800,0.
         5. Spara den nya analysmetoden.
            Anmärkning: Det är nu möjligt att omanalysera en fil genom att välja låga toppar eller höga toppar under analysmetod och sedan klicka på den gröna Analyze -knappen.

Bild 5: skärmbild som visar storleks standard redigeraren. Vänligen klicka här för att se en större version av denna siffra.

2. flödescytometri

1. Att välja det ideala FFPE-blocket
   1. Använd H & E diabilder och ett lätt Mikroskop för att välja ett FFPE-block som har ca 50 − 70% av dess vävnader som består av CV.
      Anm.: figur 6 är ett representativt exempel på ett lämpligt block för flödescytometri, eftersom det består av ungefär 50% CV (högra halvan av sektionen) och 50% moderns vävnader (vänster halva). Närvaron av moderns vävnader är viktigt eftersom de fungerar som en intern kontroll för diploida topp.
   2. För block som inte har den idealiska mängden CV, berika för CV som snittning utförs. För att göra detta, identifiera vilken sida av de Nyskurna avsnitten innehåller mer CV enligt motsvarande H & E Slide. Baserat på det, Använd ett blad för att skära av den andra halvan som måste kasseras för att berika för CV.
      Anm.: figur 7 visar ett block som inte har tillräckligt med CV för flödescytometrianalys. För block som denna, avsnitten måste skäras så att den halva som innehåller mindre CV får kasseras för att öka beloppen av CV med avseende på moderns vävnader, som visas i figuren. Var noga med att skära fler sektioner för att kompensera för vad som kasseras.

Figur 6: H &Amp; E sektion som representerar ett POC-block som är idealiskt för flödescytometri. Vänligen klicka här för att se en större version av denna siffra.

Figur 7: H &Amp; E avsnitt som representerar ett svårare block för flödescytometri. Denna representativa H & E avsnitt visar att endast den nedre halvan av detta avsnitt bör användas för flödescytometri analys, med målet att berika för CV. Det skisserade området, märkt "CV," är mestadels består av CV. Klicka här för att se en större version av denna siffra.

2. Snittning
   1. Låt blocken på is för 15 min för att underlätta snittning.
   2. Med bästa möjliga FFPE block, skära fyra sektioner som är 50 μm tjocka (eller 2 100 μm tjocka sektioner) med hjälp av en mikrotom.
      Anmärkning: För flödescytometri är det bättre att ha tjockare snitt.
   3. I det fall att en idealisk FFPE block är inte tillgänglig, syftar till att bibehålla förhållandet mellan CV till moders vävnad ändå. Till exempel, om endast 30% av blocket består av CV medan resten har moderns vävnader, sedan ta bort minst hälften av den sektion som innehåller moderns vävnader och använda fler sektioner för att kompensera (se figur 7).
   4. Placera sektionerna i märkta 15 mL-rör.
      Anmärkning: Se till att tejpa över etiketterna eftersom de organiska reagenser som används i nästa steg kan lösa upp och ta bort bläck.
3. Flödescytometri protokoll från FFPE vävnader
   1. Deparaffinization och rehydrering
      1. Utför följande tvättar (tabell 3) under ett draghuv.
      2. Fyll 15 mL-röret med 6 mL av lämplig reagens, enligt den ordning som anges i tabell 3, lämna avsnitten i reagenser för respektive varaktighet, och ta sedan bort reagensen med vakuumsugning och ett glas Pasteur-pipett.
      3. Mellan varje steg, doppa Pasteur pipetten först i 70% etanol, sedan i destillerat vatten, och sedan gå vidare till nästa steg.
      4. Var mycket noga med att inte ta bort bitar av vävnad tillsammans med reagensen. Luta 15 mL-röret till en 60-graders vinkel för att underlätta sugningen av den flytande reagensen utan att rita vävnader.
         Försiktighet: De kasserade vätskorna innehåller xylen och ska kasseras i behållare för xylenavfall.
   2. Beredning av lösningen
      1. Bered citratlösning genom att lösa upp 2 g citronsyra i 1 liter dubbelt destillerat vatten. Ta pH till 6. Förvaras vid 4 ° c.
      2. Förbered pepsin lösning genom att lösa upp 0,01 g pepsin i 2 mL 9 delar per tusen NaCl, pH 1,64. Detta är för ett prov.
         Försiktighet: Pepsin är giftigt och kan lätt skingra och bli luftburna. Använd en mask vid hantering av pepsin i pulverform och torka ner hela arbetsområdet efter att ha använt det.
      3. Propidium Iodide (PI)-ribonuclease en lösning beredning för ett prov.
         1. Blanda 50 μL PI med 450 μL PBS (för att späda 10X).
         2. Tillsätt 50 μl av ribonukleas a (1 mg/ml) till blandningen. Hålla insvept i folie hela tiden.
   3. Matsmältning och färgning
      1. Tillsätt 4 ° c citratlösning till 15 mL-rören och placera sedan i en 80 ° c vattenbad för 2 h.
      2. Låt lösningen svalna till rumstemperatur (15 min). Ta bort citratlösningen.
      3. Tillsätt 6 mL 1x PBS, Vortex, och vänta 1 − 2 min så att vävnaderna att bosätta sig i botten. Ta bort 1x PBS med hjälp av vakuumsugning och en glas Pastavpipett.
      4. Tillsätt 1 mL pepsinlösning (förvärmd till 37 ° c) och placera i en 37 ° c torrt bad i 30 min. Vortex varje 10 min. Förbered PI-ribonuclease en lösning under de senaste 10 min av denna inkubering.
      5. Tillsätt 6 mL 1x PBS, Vortex, och vänta 1 − 2 min så att vävnaderna att bosätta sig i botten. Ta bort 1x PBS med hjälp av vakuumsugning och en glas Pastavpipett.
      6. Tillsätt 550 μL av PI-ribonuclease en lösning och placera proverna i en 37 ° c torrt bad i 30 min.
         Anmärkning: Vid denna punkt kan proverna förpackas i folie och lämnas över natten vid 4 ° c till nästa morgon.
      7. Filtrera lösningen genom ett filtrerings nät på 48 μm. Samla upp filtratet i polystyren runda botten rör, som kan användas med flödescytometern. Använd tång för att placera en 5 cm med 5 cm bit filtrerings nät i den övre delen av röret, så att vätskan kan pipetteras genom mesh och in i röret.
         Anmärkning: Proverna är nu klara att köras med flödescytometern. Håll dem insvepta i folie tills de är redo att köras.
   4. Kör prover med en flödescytometer med hjälp av organisationens Flow flödescytometrianalys-plattformstekniker.
      Anmärkning: PE-kanalen används för att detektera det PI-färgade DNA och flödeshastigheten ska vara inställd på att sakta under förvärvet. Se till att spänningen väljs så att diploida topp är ungefär vid 200 längs PE-A x-axeln för att underlätta analys och tolkning. Målet är att registrera minst 20 000 händelser per prov.

Reagens som används (6 mL vardera)	Varaktighet
1) xylen	2 x 10 min
2) 100% etanol	2 x 10 min
3) 95% etanol	10 min
4) 70% etanol	10 min
5) 50% etanol	10 min
6) destillerat vatten	2 x 10 min

Tabell 3: reagenser och varaktigheter för deparaffinisering och rehydrering.

4. Dataanalys för flödescytometri
   1. Analysera data med ett flödescytometri analysprogram (tabell över material).
      Anmärkning: Följande steg är för en specifik programvara (tabell över material) men kan vara till hjälp för att ställa in andra typer av programvara också.
      1. Efter att ha kört proverna på en flödescytometer, Ladda ner FCS 2,0 filer för analys.
      2. Öppna flödet flödescytometrianalys analysprogramvara, klicka på Arkiv | Nytt dokument.
      3. Klicka på histogramikonen () och dra sedan pekaren för att skapa en rektangel.
      4. Bläddra efter FCS-filen och klicka sedan på Öppna. Längs x-axeln, klicka på FCS-a och välj sedan PE-a.
      5. Klicka på dot Plot-ikonen () och dra sedan pekaren för att skapa en annan rektangel under histogramdiagrammet. Bläddra sedan efter samma FCS-fil som valdes för histogrammet.
      6. Ändra punkt komplotten x-axeln till PE-A och y-axeln till PE-W.
         Anmärkning: figur 8A visar utseendet på tomterna vid denna punkt.
      7. Klicka på region ikonen () och rita en ruta på dot Plot som börjar innan diploida Peak (ca 100 på x-axeln i figur 8B) och som slutar runt 700 på x-axeln, som visas i dot Plot i figur 8 B.
         Anmärkning: Den diploida topp i figur 8 är ungefär på 200 på x-axeln. Detta väljs godtyckligt eftersom proverna registreras genom flödescytometern, helt enkelt för att underlätta analys och tolkning av resultaten.
      8. Klicka på Plot | Redigera regioner/grindar, skriv sedan R0 i cellen som är bredvid den G0 cell under strategi. Klicka sedan på Stäng.
      9. Klicka var som helst på histogrammet, sedan på Plot | Format Plot/overlay. Under grind, Välj G0 = R0 och klicka sedan på OK.
         Anmärkning: Detta är den gating steg som tillåter en att bättre visualisera ploiditeten toppar. Histogrammet ska nu se ut som histogrammet i figur 8b. Det är möjligt att leka med grinden skapas (genom att flytta rutan dras i steg 2.4.1.7) för att fokusera på specifika regioner i dot Plot.
      10. För att märka tomterna, klicka på text områdes ikonen (), dra sedan pekaren för att skapa en ruta överst i dokumentet och skriv sedan in följande information: patient-ID, POC-ID och blocket som används (eftersom det kan finnas flera block för en POC) , procent CV som finns på blocket, spänning som används för att köra provet och datum.

Figur 8: skärmbild som visar ett histogram och en punktplot av ett representativt prov som är ungated (a) och gated (B). Vänligen klicka här för att se en större version av denna siffra.

Representative Results

Komplexiteten i molar vävnader och det faktum att de kan ha olika genotyper kräver noggrann analys och användning av flera metoder såsom morfologisk utvärdering, P57 immunohistokemi, mikrosatelliten genotypning, flödescytometri, och fisk. Till exempel, en patient (1790) remitterades med två PHM som konstaterades vara triploid av Microarray analys av POCs bara. Patienten diagnostiserades därför med recidiverande PHM. Mikrosatellit genotypning av hennes två "PHM" tillsammans med DNA av patienten och hennes partner avslöjade att medan patientens första mullvad är triploid dispermic (figur 9A), hennes andra "PHM" har en triploid digynic genotyp (figur 9 B) och är därför inte en PHM, men en icke-molar missfall.

Den första markören i figur 9a (i svart) visar två toppar i POC. Den första toppen härstammar från mamman, eftersom endast mamman har en topp av denna storlek. Efter samma resonemang kommer den andra toppen från Fadern sedan han delar samma allel. Lägg märke till hur den andra toppen är mycket högre än den första, vilket indikerar att det förmodligen finns två doser av samma paternal allel i denna topp. Maternell kontaminering, som kommer att förklaras mer i detalj senare, är mycket minimal i detta POC eftersom POC visar en mycket liten topp vid positionen för den andra moderns allel.

Den andra markören i figur 9a (i blått) visar tre toppar i POC. Två av dessa toppar härstammar från Fadern och en från modern. Således är det tydligt igen från denna markör att det finns tre alleler närvarande i POC, två från Fadern och en från modern. Den tredje och fjärde markörer i figur 9A liknar den första markören, och även visa två alleler som kommer från Fadern och en från modern.

Eftersom alla fyra markörer genomgående visar tre alleler (med dos eller genom närvaron av tre alleler av olika storlekar), två från Fadern och en från modern, kan man dra slutsatsen att detta POC är triploid dispermic, och bekräftar diagnosen av PHM.

Alla fyra markörer i figur 9B visar igen tre alleler: den första markören visar två doser i den första toppen som kommer från mamman och en dos i den andra toppen som härstammar från fadern. Den andra och fjärde markörer visar tre olika toppar (dvs tre olika alleler), varav två är från modern. Den tredje markören visar en dos i den första toppen som kommer från Fadern och två doser i den andra toppen med ursprung från mamman. Därför är detta POC triploid digynic i Origin eftersom två uppsättningar av kromosomer kommer från mamman och en uppsättning kommer från fadern. Det är därför en icke-molar missfall.

Figur 9: representativa genotypresultat av patient 1790. (A) Välj genotypning resultat av patientens första föreställning som visar en triploida dispermic genotyp. (B) Välj genotypning resultat från patientens andra föreställning som visar en triploid digynic genotyp. X-axeln är i basepairs; etiketterna och basepair storlekar har utelämnats för enkelhetens skull. Y-axeln representerar topphöjd och utelämnas på samma sätt från figuren för enkelhetens skull. Vänligen klicka här för att se en större version av denna siffra.

Denna patient var initialt fel diagnos med två PHM och var oroande om en ökad risk för mer mullvadar medan hon hade en enda PHM. Detta fall belyser begränsningen av SNP microarray på POC ensam. SNP microarray är en kraftfull metod och är det bästa att upptäcka aneuploidies av någon kromosom (trisomies, monosomies, eller icke-diploida genotyper); men när det utförs på POC ensam utan att analysera föräldrarnas DNA, kan ursprunget till triploidi inte bestämmas. För ytterligare förklaringar om genotyp analys och tolkning hänvisas till studien av Murphy et al.¹⁶.

Representativa resultat som visas i figur 10a är av triploida befruktningen. X-axelns värden representerar kärn-DNA-halten. Till exempel är 200 ett godtyckligt nummer som ges till celler som innehåller en viss mängd kärn-DNA-innehåll. Därför representerar en topp på 400 celler som innehåller dubbelt så mycket kärn-DNA-innehåll som jämfört med 200-toppen. Den lilla toppen runt 300 representerar kärn-DNA-innehåll som är mellan 200 och 400 topp och är därför triploid topp. Lägg märke till hur en diploida befruktning (figur 10B) inte innehåller någon topp vid 300-värdet.

I vissa fall är triploida toppen mycket subtil (figur 10C). När en knappt märkbar triploid topp noteras, är det viktigt att först överväga hur mycket CV som fanns i de avsnitt som används för flödescytometri analys. Om avsnitten hade mindre än ca 20% CV, då det kommer sannolikt att vara en sann triploidi eftersom det förväntas vara en mycket låg topp. Om de avsnitt som tagits hade stora mängder CV, blir POC misstänksam mot mosaicism med närvaron av en annan diploida cellulära befolkningen. Detta kan kontrolleras genom förnyad översyn av genotypning resultat för att se om de passar en perfekt triploid dispermy eller kan också bekräftas av fisk med sonder från X, Y, och 18 kromosomer. Även med hjälp av programvaran som beskrivs i denna artikel, är det möjligt att ställa in specifika grindar, som beskrivs i avsnitt 2.4.1, som tillåter användaren att fokusera på en viss region för att berika för triploid celler om de verkligen existerar.

Figur 10: representativa flödescytometriresultat som visar triploida föreställningar i (a) och (C), och en diploida befruktning i (B). Vänligen klicka här för att se en större version av denna siffra.

Discussion

HM är onormala mänskliga graviditeter med heterogena etiologier och har olika histologiska och genotypiska typer, vilket gör deras korrekta klassificering och diagnos utmanande. Histopatologisk morfologisk utvärdering har ofta visat sig vara felaktig och är därför opålitlig på egen hand för att klassificera HM i CHM och PHM och särskilja dem från icke-molara missfall. Därför kräver en korrekt diagnos av HM användning av andra metoder såsom multiplex mikrosatelliten DNA genotypning, ploiditeten analys av flödescytometri, ploiditeten analys av fisk, och P57^KIP2 immunohistokemi. Var och en av dessa metoder har sina egna begränsningar och fördelar.

Begränsningar och fördelar med multiplex genotypning och flödescytometri

Maternell kontaminering är en av de vanligaste problemen när man arbetar med FFPE vävnader och kan leda till fel diagnos, vilket belyser vikten av att separera mödrar från POC vävnader. Det är viktigt att identifiera maternell kontaminering för att få en uppfattning om vad man kan förvänta sig av genotypning toppar och att hjälpa till med deras tolkning. Om graden av kontaminering är för stor och förhindrar tillförlitlig tolkning av resultaten, sedan upprepa DNA isolering och utvinning, ta extra omsorg för att ta bort alla möjliga moderns vävnader. I regioner där morfologin av vävnaderna är oklart, är det bättre att ta bort sådana regioner för att minimera risken för maternell kontaminering. Den första fördelen med den metod som beskrivs i detta protokoll, utöver dess lägre kostnad, är att moderns vävnader avlägsnas från bilderna medan andra metoder består av att samla POC vävnader (genom att täcka dem med lösning som polymeriserar när de utsätts för luft och lyfta vävnaderna) utan att ta bort moderns vävnader. Den metod som beskrivs här tillåter alltså en att ta en andra titt på de återstående POC vävnader, åter rengöra dem om det behövs, vilket ofta är fallet, och sedan samla in och extrahera DNA från dem. Den andra fördelen är att vi rengör vävnader på uncoverslipped H & E färgade delar, vilket avsevärt underlättar avlägsnande av moderns vävnader, i motsats till användning av ofodrade sektioner och en täckglas karta bild. Den ytterligare infärgning kan dock försämra DNA ytterligare, och detta kompenseras genom att lägga till fler sektioner.

Tillgången till föräldra-DNA för analysen är en annan utmaning. Närvaron av båda föräldrarna underlättar i hög grad analys och tolkning av genotypning resultat. Tyvärr är det dock ganska ofta så att Faderns DNA inte är tillgängligt, vilket ibland kan försvåra analysen, särskilt i de fall där kvaliteten på POC DNA är dålig på grund av tidigare fixering eller långtidslagring (oftare när man arbetar med återkommande HM). Dessutom är moderns blod eventuellt inte alltid tillgängligt för DNA-extraktion. I sådana fall kan moderns DNA extraheras från endometrievävnader från moderdjuret som finns i FFPE-blocken som tidigare beskrivits¹⁶. Också, karakterisera molar vävnader som härrör från användningen av assisterad befruktning kan komplicera mikrosatellit genotyp analys eftersom, i de flesta fall, DNA från givarna (män eller kvinnor) är vanligtvis inte tillgänglig.

Slutligen är det faktum att större toppar tenderar att vara kortare när det gäller topphöjd en annan möjlig källa till förvirring, särskilt när topp höjderna måste användas för att avgöra om det finns två doser eller en dos i en enda topp. Ett sätt att övervinna detta är att alltid ha i åtanke att toppar stora allel storlek (antal bas par) tenderar att vara kortare, på grund av den försämrade karaktären av DNA från FFPE vävnader, vilket gör mindre DNA tillgängliga för förstärkning av större alleler. Dessutom tar en kortare PCR-fragmentförstärkning mindre tid än en större, och den exponentiella amplifieringen av DNA leder till färre mängder större alleler.

Den största nackdelen med flödescytometri är att triploida föreställningar ibland kan missas, och detta kan bero på otillräckliga mängder CV i blocket. Emellertid, närvaron av en triploida topp är en avgörande indikation på en triploidi. Observera att denna metod inte är tillräckligt känslig för att upptäcka trisomies, gräsart föreställningar, eller andra aneuploidies med detta protokoll. Gräsart föreställningar är inte detekterbara av detta protokoll eftersom gräsart toppen motsvarar samma topp av diploida celler i G2 fasen av cellcykeln.

Att känna till dessa begränsningar och utmaningar bidrar till att minska misstag. Det är därför viktigt och ibland nödvändigt att analysera samma vävnad med olika metoder, jämföra resultaten, och se till att de är samstämmiga med varandra. Om de inte är det måste resultaten omprövas och analyserna måste upprepas. För de många fall som visade motstridiga resultat löstes avvikelser genom att helt enkelt upprepa experimenten och vidta lämpliga åtgärder för att undvika det ursprungliga problemet. I andra fall har avvikelser lösts genom att utföra ytterligare metoder såsom fisk på vävnad sektioner eller genom att utföra ytterligare simplex genotypning med lämpliga markörer.

Identifiering av maternell kontaminering

När det gäller att identifiera kontaminering av POC DNA med moderns DNA kommer kontaminations nivån att återspeglas eller erkännas av närvaron av alla maternella alleler på alla loci i POC, utöver den maternella allelen (s) som överförs till POC.

I figur 11Amärks toppar som härrör från maternell DNA-kontamination med "c". Lägg märke till hur varje topp märkt med en "c" är också närvarande i modern, och vi ser dessa "c" toppar i alla tre markörer. Observera att för den andra markören (i blått) är den maternella kontaminations topp som indikeras med en "c" högre än varje "c"-topp vid den första markören eftersom modern är homozygot för den andra markören. höjden på det främmande ämnet är därför fördubblats för denna markör. I denna POC, det finns inga materally härledda toppar. Med andra ord, detta POC inte ärver någon alleler från modern. Det finns bara en riktig topp vid varje markör och denna topp är inte närvarande i modern. Vi vet därför att de verkliga topparna måste ha kommit från fadern. Med ploidi information från antingen karyotyp eller flödescytometri analys visar diploidi, är det möjligt att dra slutsatsen att detta POC är både androgen i Origin och diploid.

Dessutom visar dessa tre markörer i figur 11A att det alltid bara finns en verklig topp för varje markör. Endast tre markörer illustreras här, men multiplex kit kommer ofta med många fler markörer som också kommer att avslöja samma mönster. Eftersom detta POC är diploid, det måste finnas två doser i varje topp. Med denna information kan vi konstatera att detta POC är androgen monospermic och är homozygot vid varje enskild markör.

Figur 11B representerar en diploida biföräldra POC. Den lilla svarta stapeln över den första toppen av den första markören (i grönt) representerar den uppskattade mängden föroreningar som finns inom denna verkliga topp. Den "R" indikerar den verkliga delen av denna topp som kommer från POC DNA; "c" representerar den främmande delen av denna topp som kommer från moderns DNA. Hur kan man identifiera föroreningsnivån? Det är möjligt, i detta fall, när en markör är heterozygot i modern eftersom en av moderns alleler är frånvarande i POC. Den lilla topp i den första markören märkt med "c", till exempel, indikerar att detta är den föroreningsnivå som bör förväntas för den andra materneliga ärvda toppen. Följaktligen, alla POC toppar som är av moderns ursprung är något högre än de paternally ärvda toppar på grund av den lilla extra mängd förorening. För den tredje markören (i svart) i figur 11Bförväntas kontaminations nivån vara dubbelt så stor som vanligt (eftersom modern är homozygot för denna specifika markör), och man kan därför dra slutsatsen att det bara finns en dos i den första toppen i POC.

Figur 11C illustrerar en triploid dispermic POC. Den första markören (i grönt) visar tre toppar i POC. Eftersom dessa tre toppar har liknande höjder, är det möjligt att dra slutsatsen att detta POC är sannolikt triploid. Observera att den tredje toppen i denna markör är kortare än den första. Detta förväntas eftersom, som en allmän trend, större toppar tenderar att vara kortare. Den andra toppen är något högre än den första, och detta kan redovisas av en liten mängd av maternell kontaminering, vilket indikeras av baren och "c." Dessutom är två av dessa tre toppar inte närvarande i modern, och måste därför ha kommit från fadern. Hittills visar denna markör att POC kan vara triploid (eller en trisomi) och att ursprunget till den extra uppsättning av kromosomer är faderlig. Det indikerar också att det är en dispermic befruktning, sedan POC övertog två olika alleler från fadern.

Den andra markören (i blått) i figur 11C har bara två toppar. Efter att ha redovisat nivån av kontaminering, den andra toppen visas högre än den första, och detta är trots den allmänna trenden för större toppar att vara mindre (en trend som alltid måste hållas i åtanke under analysen). Det är därför troligt att det finns två doser i en stor topp. Detta stöds också av det faktum att den första markören är ett tecken på triploidi.

Slutligen visar den tredje markören (i svart) i figur 11C tre toppar, återigen tyder på triploidi. Eftersom de flesta markörer i multiplex kit kommer från olika kromosomer, är det möjligt att sluta med tillförsikt om att en POC är triploid efter att ha observerat samma trend av tre alleler över flera olika markörer. Observera också från denna markör att två av de tre topparna härstammar från Fadern, bekräftar dispermic ursprung.

Figur 11: Genotypande resultat som illustrerar effekten av maternell kontaminering. De översta panelerna visar alleler som tillhör POC och botten panelerna visar de som tillhör modern. I (a), POC är Androgenetisk monospermic och graden av kontaminering är markerad med en pil och bokstaven "c." I (B), POC är diploida biparental, och graden av kontaminering är markerad med bokstaven "c." I (C), POC är triploid dispermic och graden av kontaminering är markerad med bokstaven "C." De små svarta staplarna visar hur mycket av topp höjderna som kommer från maternell kontaminering och bör därför beaktas när man jämför topphöjder. X-axeln är i basepairs; etiketterna och basepair storlekar har utelämnats för enkelhetens skull. Y-axeln representerar topphöjd och utelämnas på samma sätt från figuren för enkelhetens skull. Vänligen klicka här för att se en större version av denna siffra.

Exempel på utmanande fall

För ett antal fall var det bara möjligt att komma fram till en slutsats genom att ha alla tre bedömningarna samtidigt (dvs Flow, P57^KIP2, och multiplex genotypning). Till exempel, ett fall (808) remitterades som en icke-molar missfall. Histopatologisk utvärdering leder till misstanke om en molar befruktning och genotypning analys av POC avslöjade en markör som tydligt visade tre toppar (två från Fadern och en från mamman). P57^KIP2 resultaten var inte entydiga. Flödescytometri analysen avslöjade en liten triploid topp som bekräftades med fisk analys, som också uteslöt närvaron av en annan diploida cellulära populationen. Med bekräftelse från fisk, var det möjligt att dra slutsatsen att POC är verkligen en triploid dispermic mullvad.

Ett annat fall (1192) var också kallad icke-molar missfall. CV av denna POC blandades med moderns vävnader och var mycket nekrotiska också, vilket gör reningsprocessen mycket utmanande. Följaktligen visade den första genotypningen en hög nivå av maternell kontaminering, så att varje maternell allel kunde ses i POC (en bra indikation på eventuell kontaminering). Dessutom var P57^KIP2 tyvärr tveksam, troligen på grund av den nekrotiska karaktären av vävnaden, kanske på grund av fördröjd fixering. Flödescytometri resultaten var dock indikativt för triploidi, som också bekräftades av fisk. DNA återextraherades med målet att minska kontaminations nivån och ta bort vävnader med oklar morfologi. Analys av de nya genotypande resultaten, medan redovisning för den sannolika närvaron av maternell kontaminering, tillät oss att dra slutsatsen att POC var en triploid dispermic XXY PHM.

Tabell 4 beskriver de typiska metoder som används för analys. Det rekommenderas att använda morfologisk utvärdering och P57^KIP2 immunohistokemi på alla vävnader misstänkta för HM och minst en genotypning metod. Bland genotypning metoder, den mest informativa är multiplex DNA genotypning. När resultaten mellan olika metoder inte är konkordans eller när vissa resultat är ofullständiga, andra genotypning metoder måste användas. Tabellen visar förväntade samstämmiga resultat för varje möjlig HM typ tillsammans med sällsynta undantag och rekommendationer för att lösa dem.

Tabell 4: typisk analys ordning, förväntade resultat och sällsynta undantag tillsammans med rekommendationer för att lösa dem. P57^KIP2 immunohistokemi syftar till att upptäcka uttrycket av P57^KIP2, proteinet kodade av CDKN1C gen. Denna gen är paternally präglade i cytotrofoblast och villösa stroma av första trimestern moderkakan och uttrycks endast från moderns genomet. Det används därför som en extra markör för att upptäcka, på ett enkelt och billigt sätt, närvaron av moderns arvsmassa i POC. Det rekommenderas att utföra P57^KIP2 immunohistokemi för alla pocs misstänks vara HM parallellt med den morfologiska utvärderingen. I författarens laboratorium, den P57^KIP2 antikropp och plattformar som anges i tabellen av material används och författarna är mycket nöjda med kvaliteten på resultaten. Förkortningar: IHC = immunohistokemi; DIP och = diploida Androgenetic; DIP BIP = diploida biparental; Chr = kromosom; MC = missfall; och TP = trofoblastisk proliferation.

Till det bästa av författarna kunskap, är denna artikel den första att ge detaljerade protokoll för flödescytometri samt låg kostnad och högkvalitativ multiplex mikrosatelliten DNA genotypning av FFPE POC vävnader. Tolkningen av resultaten beskrivs också, tillsammans med deras felsökning och integration med andra metoder för att nå korrekta slutsatser och diagnoser av POCs och HM. Författarna hoppas uppriktigt att denna artikel kan vara till hjälp för forskare som försöker förstå denna komplexa enhet.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
BD FACS Canto II	BD BioSciences	338960
Capillary electrophoresis instrument: Genomes Applied Biosystems 3730xl DNA Analyzer	Applied biosystems	313001R	Service offered by the Centre for Applied Genomics (http://www.tcag.ca)
Citric acid	Sigma	251275
Cytoseal 60, histopathology mounting medium	Fisher	23244257
Eosin Y stock solution (1%)	Fisher	SE23-500D
FCSalyzer - flow cytometry analysis software	SourceForge	-	https://sourceforge.net/projects/fcsalyzer/
FFPE Qiagen kit	Qiagen	80234
Forceps	Fine Science Tools	11295-51	For sectioning and for the cleaning process
Glacial Acetic Acid (Concentrated)	Sigma	A6283-500mL
Glass coverslips: Cover Glass	Fisher	12-541a
Hematoxylin	Fisher	CS401-1D
Highly deionized formamide: Hi-Di Formamide	Thermofisher	4311320
IHC platform: Benchmark Ultra	Roche	-
Kimwipes	Ultident	30-34120
Microtome	Leica	RM2135
Microtome blades	Fisher	12-634-1C
Nitex filtering mesh, 48 μm	Filmar	74011	http://www.filmar.qc.ca/index.php?filet=produits&id=51&lang=en ; any other filter is suitable, but this is an inexpensive and effective option from a non-research company
p57 antibody	Cell Marque	457M
Pasteur pipette	VWR	53499-632
PCR machine	Perkin Elmer, Applied Biosystems	GeneAmp PCR System 9700
PeakScanner 1.0	Applied Biosystems	4381867	Software for genotyping analysis.
Pepsin from porcine gastric mucosa	Sigma	P7012
Polystyrene round-bottom tubes	BD Falcon	352058
Positively charged slides: Superfrost Plus 25x75mm	Fisher	1255015
PowerPlex 16 HS System	Promega Corporation	DC2102
Propidium Iodide	Sigma	P4864
Ribonuclease A from bovine pancreas	Sigma	R4875
Separation matrix: POP-7 Polymer	Thermofisher	4352759
UltraPure Agarose	Fisher	16500-500
Xylene	Fisher	X3P1GAL