Summary

Статический самостоятельно направленный метод генерации органов мозга из эмбриональных стволовых клеток человека

Published: March 04, 2020
doi:

Summary

Этот протокол был создан в качестве средства для производства органов мозга в упрощенной, низкой стоимости образом без экзогенных факторов роста или подвальной мембранной матрицы, сохраняя при этом разнообразие типов клеток мозга и многие особенности клеточной организации.

Abstract

Органоиды мозга человека, отличающиеся от эмбриональных стволовых клеток, дают уникальную возможность изучать сложные взаимодействия нескольких типов клеток в трехмерной системе. Здесь мы представляем относительно простой и недорогой метод, который дает органоиды мозга. В этом протоколе человека плюрипотентных стволовых клеток разбиваются на небольшие кластеры вместо одиночных клеток и выращиваются в основных средствах массовой информации без гетерологичной матрицы мембраны подвала или экзогенных факторов роста, что позволяет внутреннее развитие сигналов для формирования рост органоида. Эта простая система производит разнообразие типов клеток мозга, включая глиальные и микроглиальные клетки, стволовые клетки и нейроны передового мозга, среднего мозга и заднего мозга. Органоиды, генерируемые в этом протоколе, также отображают признаки соответствующей временной и пространственной организации, продемонстрированной яркими изображениями поля, гистологией, иммунофлуоресценцией и в режиме реального времени количественной реверсивной транспрессионной цепной реакцией ( qRT-PCR). Поскольку эти органоиды содержат типы клеток из различных частей мозга, они могут быть использованы для изучения множества заболеваний. Например, в недавней работе мы продемонстрировали использование органоидов, полученных из этого протокола, для изучения влияния гипоксии на человеческий мозг. Этот подход может быть использован для изучения массива в противном случае трудно изучить условия, такие как нейроразвития гандикапы, генетические расстройства, и неврологические заболевания.

Introduction

Из-за множества практических и этических ограничений, было много трудностей в изучении человеческого мозга. Хотя исследования с использованием грызунов имеют решающее значение для нашего понимания человеческого мозга, мыши мозг имеет много различий1,2. Интересно, что мыши имеют плотность нейронов, что, по крайней мере в 7 раз меньше, чем приматов мозга3,4. Хотя приматы ближе к человеку, чем грызуны с эволюционной точки зрения, это не практично для большинства исследователей, чтобы работать с ними. Цель этого протокола состояла в том, чтобы резюмировать многие важные особенности человеческого мозга с помощью упрощенного и менее дорогостоящего метода без необходимости гетерологичной матрицы мембраны подвала или экзогенных факторов роста при сохранении разнообразия клеток мозга и клеточной организации.

Формативная работа из лаборатории Сасай использовала сыворотку свободной культуры эмбриональных тел (SFEBq) метод для создания двух- и трехмерных нейронных типов клеток из сигнализированных эмбриональных стволовых клеток (ESCs)5,6. Многие органоидные методы мозга человека следовали относительно похожим путем от сигнализированных ESCs7,8. В отличие от этого, этот протокол начинается с кластеров отдельных человека ESCs (hESCs), похожие на начальные шаги семенной работы Лаборатории Томсона и Чжана до покрытия шаги9,10, а также начальный шаг мозга органоидпротокол лаборатории Паска до добавления экзогенных факторов роста11. Подвал мембраны матрицы (например, матригель) были использованы во многих мозг органоидных протоколов и было показано, что эффективный эшафот8. Однако, наиболее часто используемые мембранные матрицы подвала не приходят без усложнений по мере того как они co-purify с неизвестными количествами факторов роста с партией к изменчивости партии во время продукции12. Кроме того, эти матрицы могут осложнить визуализацию и увеличить риск загрязнения и стоимости.

Хотя человеческий мозг органоиды могут быть использованы для ответа на многие вопросы, Есть определенные ограничения, чтобы иметь в виду. С одной стороны, начиная с эмбриональных стволовых клеток, органоиды больше напоминают незрелые мозги, чем в возрасте мозга и как таковой не может быть идеальным и моделям для заболеваний, которые происходят в пожилом возрасте, как болезнь Альцгеймера. Во-вторых, в то время как наш протокол нашел маркеры развития головного мозга, среднего и заднего мозга, которые полезны для изучения влияния лечения или болезни на клетки из нескольких областей мозга в согласии, другие протоколы могут быть соблюдены, чтобы сосредоточиться на конкретных областях мозга13,14. Наконец, еще одним ограничением органоидных моделей является то, что размер, в то время как средняя длина человеческого мозга около 167 мм, мозг органоидов, сделанных с использованием агитации вырастают до 4 мм8 и органоиды, сформированные этим протоколом, вырастают до 1-2 мм на 10 недель. Тем не менее, этот протокол является важным инструментом для изучения тканей мозга человека и взаимодействия нескольких типов клеток.

Protocol

1. Обслуживание стволовых клеток Поддерживать H9 hESCs на слое фактора роста снижение подвала мембранной матрицы (см. Таблица материалов, отныне просто называют матрицы) в соответствии с инструкциями производителя. Чтобы покрыть одну 6-колодую тарелку или одну тарелку 10 ?…

Representative Results

На рисунке 1 показаны репрезентативные яркие изображения нескольких точек времени, чтобы продемонстрировать, как выглядят клетки/органоиды на разных этапах протокола. HESCs были удалены из ткани культуры пластины, разбиты на мелкие кусочки, и помещены в T75 ультра-низкой к?…

Discussion

Как и другие модели органоидов, это искусственная система, которая поставляется с несколькими оговорками. Хотя было мало партии партии изменения с точки зрения общего уровня выражения, отдельные органоиды действительно проявлять различия. Например, расположение положительных област?…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Мы благодарим ядро стволовых клеток йельского университета (YSCC) и онкологический центр (YCC) за помощь. Мы благодарим доктора Чжон Кима за его невропатологию обзора. Эта работа была поддержана Коннектикут регенеративной медицины научно-исследовательский фонд, марта Dimes, и NHLBI R01HL131793 (S.G.K.), онкологический центр йельского и йельского онкологического биологии Учебная программа NCI CA193200 (E.B.) и щедрый неограниченный подарок от Джозефа и Люсиль Мадри.

Materials

Alexa Fluor 488 goat anti-mouse Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, USA A11029
Alexa Fluor 546 goat anti-rabbit Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, USA A11035
B27 Supplement Gibco, Waltham, MA, USA 17504-044
bFGF Life Technologies, Carlsbad, CA, USA PHG0263
BSA Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA A9647
BX43 microscope Olympus, Shinjuku, Tokyo, Japan
DAPI stain Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, USA D1306
Dispase STEMCELL Technologies, Vancouver, Canada 07913
DMEM/F12 Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, USA 11330-032
DPBS Gibco, Waltham, MA, USA 10010023
FluroSave MilliporeSigma, Burlington, MA 345789
GFAP antibody NeuroMab, Davis, CA N206A/8
Growth Factor Reduced Matrigel (Matrix) Corning, Corning, NY, USA 356231
H9 hESCs WiCell, Madison, WI, USA WA09
Heparin Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA 9041-08-1
iQ SYBR Green Supermix Bio-Rad, Hercules, CA, USA 1708880
iScript cDNA Synthesis Kit Bio-Rad, Hercules, CA, USA 1708891
L-glutamine Gibco, Waltham, MA, USA 25030-081
Monothioglycerol Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA M6145
mTESR media STEMCELL Technologies, Vancouver, Canada 85850
N2 NeuroPlex Gemini Bio Products, West Sacramento, CA, USA 400-163
Nanodrop Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, USA ND-2000
NEAA Gibco, Waltham, MA, USA 11140-050
Normal Donkey Serum (NDS) ImmunoResearch Laboratories Inc., West Grove, PA, USA 017-000-121
OCT Sakura Finetek, Torrance, CA, USA 25608-930
PFA Electron Microscopy Sciences, Hatfield, PA RT15710
qPCR machine Bio-Rad, CFX96, Hercules, CA, USA 1855196
RNeasy kit Qiagen, Hilden, Germany 74104
Sox2 MilliporeSigma, Burlington, MA AB5603
TMS-F microscope Nikon, Melville, NY, USA
Triton X-100 Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA T8787-100ML
Ultra-low attachment T75 flasks Corning, Corning, NY, USA 3814

References

  1. Northcutt, R. G. Understanding vertebrate brain evolution. Integrative and Comparative Biology. 42 (4), 743-756 (2002).
  2. Roth, G. . The Long Evolution of Brains and Minds. , (2013).
  3. Herculano-Houzel, S. The human brain in numbers: a linearly scaled-up primate brain. Frontiers in Human Neuroscience. 3, 31 (2009).
  4. Roth, G., Dicke, U. Evolution of the brain and intelligence. Trends in Cognitive Sciences. 9 (5), 250-257 (2005).
  5. Eiraku, M., et al. Self-organized formation of polarized cortical tissues from ESCs and its active manipulation by extrinsic signals. Cell Stem Cell. 3 (5), 519-532 (2008).
  6. Watanabe, K., et al. Directed differentiation of telencephalic precursors from embryonic stem cells. Nature Neuroscience. 8 (3), 288-296 (2005).
  7. Kadoshima, T., et al. Self-organization of axial polarity, inside-out layer pattern, and species-specific progenitor dynamics in human ES cell-derived neocortex. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 110 (50), 20284-20289 (2013).
  8. Lancaster, M. A., et al. Cerebral organoids model human brain development and microcephaly. Nature. 501 (7467), 373-379 (2013).
  9. Li, X. J., et al. Specification of motoneurons from human embryonic stem cells. Nature Biotechnology. 23 (2), 215-221 (2005).
  10. Zhang, S. C., Wernig, M., Duncan, I. D., Brustle, O., Thomson, J. A. In vitro differentiation of transplantable neural precursors from human embryonic stem cells. Nature Biotechnology. 19 (12), 1129-1133 (2001).
  11. Pasca, A. M., et al. Functional cortical neurons and astrocytes from human pluripotent stem cells in 3D culture. Nat Methods. 12 (7), 671-678 (2015).
  12. Hughes, C. S., Postovit, L. M., Lajoie, G. A. Matrigel: a complex protein mixture required for optimal growth of cell culture. Proteomics. 10 (9), 1886-1890 (2010).
  13. Qian, X., et al. Brain-Region-Specific Organoids Using Mini-bioreactors for Modeling ZIKV Exposure. Cell. 165 (5), 1238-1254 (2016).
  14. Sloan, S. A., Andersen, J., Pasca, A. M., Birey, F., Pasca, S. P. Generation and assembly of human brain region-specific three-dimensional cultures. Nature Protocols. 13 (9), 2062-2085 (2018).
  15. Kelava, I., Lancaster, M. A. Stem Cell Models of Human Brain Development. Cell Stem Cell. 18 (6), 736-748 (2016).
  16. Boisvert, E. M., Means, R. E., Michaud, M., Madri, J. A., Katz, S. G. Minocycline mitigates the effect of neonatal hypoxic insult on human brain organoids. Cell Death and Disease. 10 (4), 325 (2019).
  17. Bergmann, S., et al. Blood-brain-barrier organoids for investigating the permeability of CNS therapeutics. Nature Protocols. 13 (12), 2827-2843 (2018).
  18. Mansour, A. A., et al. An in vivo model of functional and vascularized human brain organoids. Nature Biotechnology. 36 (5), 432-441 (2018).
  19. Pham, M. T., et al. Generation of human vascularized brain organoids. Neuroreport. 29 (7), 588-593 (2018).
  20. Boisvert, E. M., Denton, K., Lei, L., Li, X. J. The specification of telencephalic glutamatergic neurons from human pluripotent stem cells. Journal of Visualized Experiments. (74), (2013).

Play Video

Cite This Article
Boisvert, E. M., Means, R. E., Michaud, M., Thomson, J. J., Madri, J. A., Katz, S. G. A Static Self-Directed Method for Generating Brain Organoids from Human Embryonic Stem Cells. J. Vis. Exp. (157), e60379, doi:10.3791/60379 (2020).

View Video