Summary

Un método autodirigido estático para generar organoides cerebrales a partir de células madre embrionarias humanas

Published: March 04, 2020
doi:

Summary

Este protocolo se generó como un medio para producir organoides cerebrales de una manera simplificada y de bajo costo sin factores de crecimiento exógenos o matriz de membrana de sótano sin dejar de mantener la diversidad de tipos de células cerebrales y muchas características de la organización celular.

Abstract

Los organoides cerebrales humanos diferenciados de las células madre embrionarias ofrecen la oportunidad única de estudiar interacciones complicadas de múltiples tipos de células en un sistema tridimensional. Aquí presentamos un método relativamente sencillo y barato que produce organoides cerebrales. En este protocolo las células madre pluripotentes humanas se dividen en pequeños racimos en lugar de células individuales y se cultivan en medios básicos sin una matriz de membrana de sótano hetróloga o factores de crecimiento exógenos, lo que permite que las señales intrínsecas de desarrollo crecimiento del organoide. Este sistema simple produce una diversidad de tipos de células cerebrales incluyendo células gliales y microgliales, células madre y neuronas del cerebro forebrain, cerebro medio y cerebro trasero. Los organoides generados a partir de este protocolo también muestran señas de identidad de una organización temporal y espacial adecuada demostrada por imágenes de campo brillante, histología, inmunofluorescencia y reacción en cadena cuantitativa de transcripción inversa en tiempo real ( qRT-PCR). Debido a que estos organoides contienen tipos celulares de varias partes del cerebro, se pueden utilizar para estudiar una multitud de enfermedades. Por ejemplo, en un artículo reciente demostramos el uso de organoides generados a partir de este protocolo para estudiar los efectos de la hipoxia en el cerebro humano. Este enfoque se puede utilizar para investigar una serie de condiciones difíciles de estudiar, como discapacidades del neurodesarrollo, trastornos genéticos y enfermedades neurológicas.

Introduction

Debido a innumerables limitaciones prácticas y éticas, ha habido una gran dificultad en el estudio del cerebro humano. Mientras que los estudios que utilizan roedores han sido críticos para nuestra comprensión del cerebro humano, el cerebro del ratón tiene muchas diferencias1,2. Curiosamente, los ratones tienen una densidad neuronal que es al menos 7 veces menor que el cerebro de primate3,4. Aunque los primates están más cerca de los seres humanos que los roedores desde un punto de vista evolutivo, no es práctico para la mayoría de los investigadores trabajar con ellos. El propósito de este protocolo era recapitular muchas características importantes del cerebro humano usando un método simplificado y menos costoso sin la necesidad de una matriz de membrana de sótano hetróloga o factores de crecimiento exógenos mientras se mantiene la diversidad de células cerebrales y la organización celular.

El trabajo formativo del laboratorio Sasai utilizó el método de cultivo libre de suero de cuerpos embrionarios (SFEBq) para generar tipos de células neuronales bidimensionales y tridimensionales a partir de células madre embrionarias señaladas (ESC)5,6. Muchos métodos organoides del cerebro humano han seguido un camino relativamente similar de esCs 8señalizado. Por el contrario, este protocolo comienza con grupos de ESC sinfunciones humanas (HESC), similares a los pasos iniciales del trabajo seminal de los laboratorios Thomson y Zhang antes de los pasos9,10, así como el paso inicial del protocolo organoide cerebral del laboratorio Pasca antes de la adición de factores de crecimiento exógenos11. Las matrices de membranas de sótano (por ejemplo, matrigel) se han utilizado en muchos protocolos de organoides cerebrales y se ha demostrado que es un andamio eficaz8. Sin embargo, las matrices de membrana de sótano más utilizadas no vienen sin complicaciones, ya que co-purifican con cantidades desconocidas de factores de crecimiento con la variabilidad lote a lote durante la producción12. Además, estas matrices pueden complicar la toma de imágenes y aumentar el riesgo de contaminación y costo.

Mientras que los organoides del cerebro humano se pueden utilizar para responder a muchas preguntas, hay ciertas limitaciones a tener en cuenta. Por un lado, a partir de las células madre embrionarias, los organoides se asemejan más a los cerebros inmaduros que los cerebros envejecidos y, como tal, pueden no ser modelos ideales para enfermedades que ocurren en la vejez, como la enfermedad de Alzheimer. En segundo lugar, mientras que nuestro protocolo encontró marcadores de desarrollo de cerebro súbdito, cerebro medio y cerebro trasero que son útiles para estudiar el efecto de un tratamiento o enfermedad en las células de múltiples regiones cerebrales en concierto, otros protocolos se pueden seguir para concentrarse en regiones cerebrales específicas13,14. Finalmente, otra limitación de los modelos organoides es la del tamaño, mientras que la longitud media de un cerebro humano de aproximadamente 167 mm, organoides cerebrales hechos con el uso de agitación crecen hasta 4 mm8 y los organoides formados por este protocolo crecen a 1-2 mm por 10 semanas. Sin embargo, este protocolo proporciona una herramienta importante para estudiar el tejido cerebral humano y la interacción de múltiples tipos de células.

Protocol

1. Mantenimiento de células madre Mantener H9 hESCs en una capa de factor de crecimiento reducido matriz de membrana sótano (ver la Tabla de Materiales, a partir de ahora simplemente se conoce como matriz) de acuerdo con las instrucciones del fabricante. Para recubrir un plato de 6 pocillos o un plato de 10 cm, combine 100 ml de matriz con 5,9 ml de medio Eagle modificado (DMEM) /F12 modificado de Dulbecco en frío. Envuelva las placas en una película de parafina y guárdelas durante…

Representative Results

La Figura 1 muestra imágenes representativas de campo brillante de varios puntos de tiempo para demostrar cómo se ven las células/organoides a lo largo de las diferentes etapas del protocolo. Los hESC se extraían de la placa de cultivo de tejido, se dividieron en trozos pequeños y se colocaron en un matraz de fijación ultrabajo T75 donde formaron esferas. Es importante tener en cuenta que las células se ven brillantes y similares en tamaño, sin células oscuras y moribundas en los ce…

Discussion

Al igual que otros modelos de organoides, este es un sistema artificial que viene con varias advertencias. Aunque había poca variación de lote a lote en términos de niveles generales de expresión, los organoides individuales mostraban diferencias. Por ejemplo, la ubicación de las áreas positivas de Sox-2 no era idéntica en todos los organoides(Figura 3). Mientras que qPCR es adecuado para buscar cambios generales en lotes de células, técnicas adicionales como RNAseq de una sola célula se utiliz…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Agradecemos al Núcleo de Células Madre de Yale (YSCC, por sus principales servicios) por su ayuda. Agradecemos al Dr. Jung Kim por su revisión de neuropatología. Este trabajo fue apoyado por Connecticut Regenerative Medicine Research Fund, March of Dimes y NHLBI R01HL131793 (S.G.K.), el Yale Cancer Center y el Yale Cancer Biology Training Program NCI CA193200 (E.B.) y un generoso regalo sin restricciones de Joseph y Lucille Madri.

Materials

Alexa Fluor 488 goat anti-mouse Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, USA A11029
Alexa Fluor 546 goat anti-rabbit Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, USA A11035
B27 Supplement Gibco, Waltham, MA, USA 17504-044
bFGF Life Technologies, Carlsbad, CA, USA PHG0263
BSA Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA A9647
BX43 microscope Olympus, Shinjuku, Tokyo, Japan
DAPI stain Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, USA D1306
Dispase STEMCELL Technologies, Vancouver, Canada 07913
DMEM/F12 Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, USA 11330-032
DPBS Gibco, Waltham, MA, USA 10010023
FluroSave MilliporeSigma, Burlington, MA 345789
GFAP antibody NeuroMab, Davis, CA N206A/8
Growth Factor Reduced Matrigel (Matrix) Corning, Corning, NY, USA 356231
H9 hESCs WiCell, Madison, WI, USA WA09
Heparin Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA 9041-08-1
iQ SYBR Green Supermix Bio-Rad, Hercules, CA, USA 1708880
iScript cDNA Synthesis Kit Bio-Rad, Hercules, CA, USA 1708891
L-glutamine Gibco, Waltham, MA, USA 25030-081
Monothioglycerol Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA M6145
mTESR media STEMCELL Technologies, Vancouver, Canada 85850
N2 NeuroPlex Gemini Bio Products, West Sacramento, CA, USA 400-163
Nanodrop Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, USA ND-2000
NEAA Gibco, Waltham, MA, USA 11140-050
Normal Donkey Serum (NDS) ImmunoResearch Laboratories Inc., West Grove, PA, USA 017-000-121
OCT Sakura Finetek, Torrance, CA, USA 25608-930
PFA Electron Microscopy Sciences, Hatfield, PA RT15710
qPCR machine Bio-Rad, CFX96, Hercules, CA, USA 1855196
RNeasy kit Qiagen, Hilden, Germany 74104
Sox2 MilliporeSigma, Burlington, MA AB5603
TMS-F microscope Nikon, Melville, NY, USA
Triton X-100 Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA T8787-100ML
Ultra-low attachment T75 flasks Corning, Corning, NY, USA 3814

References

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Cite This Article
Boisvert, E. M., Means, R. E., Michaud, M., Thomson, J. J., Madri, J. A., Katz, S. G. A Static Self-Directed Method for Generating Brain Organoids from Human Embryonic Stem Cells. J. Vis. Exp. (157), e60379, doi:10.3791/60379 (2020).

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