Summary
Questo protocollo è stato generato come mezzo per produrre organoidi cerebrali in modo semplificato e a basso costo senza fattori di crescita esogeni o matrice di membrana seminterrato, pur mantenendo la diversità dei tipi di cellule cerebrali e molte caratteristiche dell'organizzazione cellulare.
Abstract
Gli organoidi cerebrali umani differenziati dalle cellule staminali embrionali offrono l'opportunità unica di studiare interazioni complicate di più tipi di cellule in un sistema tridimensionale. Qui vi presentiamo un metodo relativamente semplice e poco costoso che produce organoidi cerebrali. In questo protocollo le cellule staminali pluripotenti umane sono suddivise in piccoli ammassi invece di singole cellule e coltivate in supporti di base senza una matrice di membrana del seminterrato etesologa o fattori di crescita esogeni, consentendo ai segnali di sviluppo intrinseci di modellare il crescita dell'organoide. Questo semplice sistema produce una varietà di tipi di cellule cerebrali tra cui cellule gliali e microgliali, cellule staminali e neuroni del prosencefalo, del cervello medio e del cervello posteriore. Gli organoidi generati da questo protocollo mostrano anche segni distintivi di un'appropriata organizzazione temporale e spaziale dimostrati da immagini luminose, istologia, immunofluorescenza e reazione della catena di trascrizione inversa quantitativa in tempo reale ( qRT-PCR). Poiché questi organoidi contengono tipi di cellule da varie parti del cervello, possono essere utilizzati per studiare una moltitudine di malattie. Per esempio, in un recente articolo abbiamo dimostrato l'uso di organoidi generati da questo protocollo per studiare gli effetti dell'ipossia sul cervello umano. Questo approccio può essere utilizzato per studiare una serie di condizioni altrimenti difficili da studiare come gli handicap del neurosviluppo, i disturbi genetici e le malattie neurologiche.
Introduction
A causa di una miriade di limitazioni pratiche ed etiche, c'è stata una grande difficoltà nello studio del cervello umano. Mentre gli studi che utilizzano roditori sono stati fondamentali per la nostra comprensione del cervello umano, il cervello del topo ha molte differenze1,2. È interessante notare che i topi hanno una densità neuronale che è almeno 7 volte inferiore al cervello dei primati3,4. Anche se i primati sono più vicini agli esseri umani rispetto ai roditori da un punto di vista evolutivo, non è pratico per la maggior parte dei ricercatori lavorare con loro. Lo scopo di questo protocollo era quello di riassumere molte caratteristiche importanti del cervello umano utilizzando un metodo semplificato e meno costoso senza la necessità di una matrice di membrana seminterrato eterologa o fattori di crescita esogeni pur mantenendo la diversità delle cellule cerebrali e l'organizzazione cellulare.
Il lavoro formativo del laboratorio Sasai ha utilizzato la coltura senza siero dei corpi embrionali (SFEBq) per generare tipi di cellule neuronali bidimensionali e tridimensionali da cellule staminali embrionali (ESC) segnalate5,6. Molti metodi organoidi del cervello umano hanno seguito un percorso relativamente simile rispetto alle ESC segnalate7,8. Al contrario, questo protocollo inizia con cluster di ESC umani distaccati (hESC), simili ai primi passi del lavoro seminale dei laboratori Thomson e zhang prima delle fasi di placcatura9,10, così come la fase iniziale del protocollo organoide cerebrale del laboratorio Pasca prima dell'aggiunta di fattori di crescita esogeni11. Le matrici a membrana del seminterrato (ad esempio, matrigel) sono state utilizzate in molti protocolli organoidi cerebrali ed è stato dimostrato di essere un efficace scaffold8. Tuttavia, le matrici di membrana seminterrato più comunemente utilizzate non vengono senza complicazioni in quanto co-purificano con quantità sconosciute di fattori di crescita con variabilità batch a batch durante la produzione12. Inoltre, queste matrici possono complicare l'imaging e aumentare il rischio di contaminazione e costi.
Mentre gli organoidi del cervello umano possono essere utilizzati per rispondere a molte domande, ci sono alcune limitazioni da tenere a mente. Per uno, a partire dalle cellule staminali embrionali, gli organoidi assomigliano più da vicino acerrimi cerebrali immaturi rispetto ai cervelli invecchiati e come tali potrebbero non essere modelli ideali per malattie che si verificano nella vecchiaia, come il morbo di Alzheimer. In secondo luogo, mentre il nostro protocollo ha trovato marcatori di prosencefalo, sviluppo del cervello e del cervello posteriore che sono utili per studiare l'effetto di un trattamento o di una malattia sulle cellule di più regioni cerebrali in concerto, altri protocolli possono essere seguiti per concentrarsi su specifiche regioni del cervello13,14. Infine, un'altra limitazione dei modelli organoidi è quella delle dimensioni, mentre la lunghezza media di un cervello umano di circa 167 mm, gli organoidi cerebrali fatti con l'uso di agitazione crescono fino a 4 mm8 e gli organoidi formati da questo protocollo crescono a 1-2 mm di 10 settimane. Ciò nonostante, Questo protocollo fornisce uno strumento importante per studiare il tessuto cerebrale umano e l'interazione di più tipi di cellule.
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Protocol
1. Manutenzione delle cellule staminali
- Mantenere H9 hESC su uno strato di fattore di crescita ridotto matrice della membrana seminterrato (vedere la Tabella dei materiali, d'ora in poi semplicemente indicato come matrice) secondo le istruzioni del produttore.
- Per rivestire una piastra di 6 pozzetti o un piatto da 10 cm, unire 100 l-L di matrice con 5,9 mL di supporto Eagle modificato a freddo ghiaccio (DMEM)/F12. Avvolgere le piastre in pellicola di paraffina e conservarle durante la notte a 4 gradi centigradi. Usali il giorno successivo per passare le cellule dopo che la matrice/supporto in eccesso è stato aspirato.
- Coltura le celle da settimana a settimana a circa un rapporto di divisione 1:12 ogni 7 giorni. Mantenere le cellule utilizzando supporti mTESR-1 in un'incubatrice a 37 gradi centigradi (5% O2, 5% CO2). Aggiornare i file multimediali ogni giorno. Elimina le cellule dalla coltura tra i passaggi usando strumenti di vetro.
- Le cellule H9 devono essere passaggiate da quattro a sei giorni prima di utilizzarle per produrre organoidi. Le cellule devono essere passaggiate approssimativamente a un rapporto 1:8 dei cluster cellulari. Per fare questo, iniziare risciacquando le cellule con il supporto DMEM F12 e dissociare le cellule con una proteasi neutra (ad esempio, dispase, d'ora in poi indicata semplicemente come proteasi), risciacquare con DMEM/F-12, e piastra come 30-60 gruppi di cellule su 4 piastre (6-well o 10 cm) a 20 %. Due giorni prima della raccolta, passarli a un'incubatrice regolare (21% O2, 5% CO2). Le piastre dovrebbero raggiungere l'80% di confluenza quando iniziano la formazione di organoidi.
2. Dissociazione degli hESC per la cultura organoide
- Aliquota la soluzione di stock proteasi (5 U/mL).
NOTA: In genere congeliamo 1 aliquota a -20 gradi centigradi per l'uso per diversi mesi. - Diluire la soluzione di riserva proteasi alla concentrazione di lavoro aggiungendo 1 mL della soluzione di stock più 5 mL di DMEM/F12 per ogni piastra di 6 o 10 cm di hESC.
- Aspirati e rimuovi i supporti di coltura cellulare, quindi copri gli hESC con la soluzione protease. Posizionare le piastre nell'incubatrice per 10-15 min o fino a quando i bordi delle colonie arrotondano e iniziano a separarsi dalla matrice.
- Inclinare la piastra, aspirare la soluzione di proteasi e lavare delicatamente le cellule con DMEM/F12 tre volte. Utilizzare 2 mL/po' per ogni lavaggio quando si utilizza una piastra a 6 pozze tramite e 6 mL quando si utilizza una piastra da 10 cm. Assicurarsi che le colonie rimangano attaccate alla matrice quando si esegue questo passaggio.
- Aggiungere indietro circa 1,5 mL di supporti mTESR freschi ad ogni pozzo (o 5 mL per una piastra da 10 cm) e lavare le cellule dalla piastra utilizzando una leggera pipettatura.
- Utilizzando una pipetta da 10 mL, aspirare delicatamente e erogare hESC all'interno della piastra fino a raggiungere circa 1/30th della loro dimensione originale. I grappoli di colonia dovrebbero assomigliare a quadrati di dimensioni pari a 250-350 m al termine di questi passaggi.
3. Generazione di organoidi
- Trasferire le cellule in un singolo accessorio ultra-basso T75 contenente 30 mL di supporti mTESR senza fattore di crescita fibroblasto di base (bFGF).
- Il giorno successivo, inclinare il fiaschetta (s) in modo che la piscina di cellule vive in un angolo (questo può richiedere 5-10 min il primo giorno, ma otterrà più veloce come i cluster si ingrandiscono).
NOTA: Se ci sono un gran numero di cellule che hanno aderito alla parte inferiore del pallone in questa fase o in eventuali passaggi successivi, trasferire le celle in una nuova flacone. È normale avere un'alta popolazione di cellule morte per i primi due giorni. Quando si eseguono modifiche multimediali, assicurarsi di rimuovere la maggior parte dei detriti cellulari possibile. - Una volta che le cellule si depositano, aspirare i media e le cellule morte lasciando circa 10 mL di supporti contenenti le cellule vive.
- Aggiungere 20 mL di supporto bFGF basso (DMEM/F12 integrato con 1x N2, 1x B27, 1x L-glutamine, 1x NEAA, 0.05% biondo albumina (BSA) e 0,1 mM monothioglycerol (MTG) integrato con 30 ng/mL bFGF).
- Controllare le celle il giorno 2. Se la maggior parte delle cellule sembrano sane e luminose, non c'è bisogno di fare nulla. Tuttavia, se più di un terzo delle cellule appaiono scure, sostituire il supporto (utilizzando la stessa tecnica di inclinazione del passaggio 3.2) con 20 mL di supporto bFGF basso integrato con 20 ng/mL bFGF.
- Il giorno 3, sostituire metà del supporto (utilizzando la tecnica di inclinazione al punto 3.2) con 20 mL di supporto bFGF basso integrato con 10 ng/mL bFGF.
- Il giorno 5, sostituire metà del mezzo (utilizzando la tecnica di inclinazione al punto 3.2) con 20 mL di supporto di induzione neurale (NIM: DMEM/F12, 1x supplemento N2, 0,1 mM MEM NEAA, 2 g/mL di eparina).
NOTA: Se ci sono grandi gruppi di cellule o organoidi che sono molto più grandi degli altri, dovrebbero essere rimossi dalla coltura. La dimensione è stimata per aspetto al microscopio; ad esempio, utilizzando un oculare con reticolo. La maggior parte degli organoidi sono di dimensioni simili (circa 100 x 20 m). Abbiamo rimosso organoidi che erano circa 2x più piccoli o più grandi degli altri. - Sostituire metà del mezzo (15 mL) (utilizzando la tecnica di inclinazione) con NIM a giorni alterni.
- Dopo 3 settimane di coltura, aggiungere 100x penicillina/streptomicina ai media (NIM: DMEM/F12, 1x supplemento N2, 0,1 mM MEM NEAA, 2 g/mL di eparina) ad una concentrazione finale di 1x se lo si desidera. Aggiornare i file multimediali a giorni alterni.
NOTA: In questo modo, abbiamo mantenuto gli organoidi per un massimo di 6 mesi di cultura.
4. Estrazione e preparazione dell'RNA
- Estrarre delicatamente circa 15 organoidi (a seconda delle dimensioni) dal flacone utilizzando una pipetta da 10 mL e metterli in un tubo da 1,5 mL.
- Pellere delicatamente gli organoidi nella centrifuga (200 x g per 1 min) e risciacquare con 1x PBS di Dulbecco (DPBS) tre volte.
- Estrarre l'RNA utilizzando un sistema o un protocollo convalidato (ad esempio, kit RNeasy).
- Misurare il valore di densità ottica di ogni campione a 260 e 280 nm.
- Preparare il cDNA utilizzando un sistema o un protocollo convalidato (ad esempio, iScript cDNA synthesis kit).
- Eseguire qRT-PCR utilizzando primer pre-convalidati (Tabella 1) includendo almeno un gene di pulizia.
5. Immunoistochimica
- Fissazione
- Preparare una soluzione di paraformaldeide (PFA) del 4% e posizionarla a 4 gradi centigradi.
- Utilizzando un rasoio sterile, tagliare la punta di una pipetta di trasferimento sterile.
- Estrarre delicatamente gli organoidi utilizzando la pipetta di trasferimento tagliato, in quanto possono essere facilmente separati, soprattutto quando crescono grandi, e metterli in una piastra a 6 pozze con supporti aggiuntivi o DPBS.
- Inclinare la piastra, aspirare il supporto e sostituirlo con 1x DPBS. Sciacquare le cellule con 1x DPBS altre due volte.
- Sostituire il DPBS con una soluzione PFA del 4% e posizionarlo su uno shaker a 4 gradi centigradi.
NOTA: Mentre abbiamo fissato per 2 giorni (per piccoli organoidi) a 7 giorni (per organoidi >3 mesi), possono anche essere possibili tempi più brevi (ad esempio, 16-24 h). - Prepara soluzioni per il 30%, il 20% e il 10% di saccarosio in DPBS.
- Dopo la fissazione in PFA, sostituire con la soluzione di saccarosio del 10% e mettere su uno shaker a 4 gradi centigradi per 24 ore.
- Sostituire il saccarosio del 10% con il 20% di saccarosio e mettere su uno shaker a 4 gradi centigradi per 24 h.
- Sostituire il saccarosio 20% con il 30% di saccarosio e mettere su uno shaker a 4 gradi centigradi per 24 h.
- Sezioni congelate
- Preparare uno strato piatto di ghiaccio secco e posizionare uno stampo di plastica etichettato su di esso.
- Versare un sottile strato di mezzo di temperatura di taglio ottimale (OCT) nello stampo e lasciarlo iniziare a indurirsi (in pochi secondi).
- Posizionare alcuni organoidi sulla parte superiore dello stampo dello stampo nello stampo utilizzando una pipetta di trasferimento con la punta tagliata e prestare molta attenzione alla posizione degli organoidi.
- Aggiungere lentamente in OCT fino a quando lo stampo è pieno e gli organoidi sono coperti. Lasciare indurire completamente per altri 10 min.
NOTA: Mentre il congelamento di oltre 10 min aiuta a garantire il posizionamento relativo ideale di più organoidi per la sezionamento, è possibile utilizzare un mix di ghiaccio etanolo-secco o azoto liquido per congelare più rapidamente. - Contrassegnare la posizione relativa degli organoidi con un pennarello per facilitarne la ricerca durante il taglio.
- Mettete gli stampi in un sacchetto o in una scatola e conservate a -80 gradi fino a quando non saranno pronti a tagliare le sezioni.
- Utilizzando un criostato, affettare sezioni da 10 m e posizionare il tessuto su diapositive etichettate e caricate positivamente.
- Colorazione
- Preparare la soluzione di blocco (0,3% Triton X-100, 4% siero d'asino normale in PBS).
- Utilizzare una pap pen idrofobica per disegnare intorno al perimetro del tessuto.
- Sciacquare le diapositive con PBS 3 volte per 5 min ciascuno.
- Sostituire PBS con soluzione di blocco per 1 h a temperatura ambiente.
- Sostituire la soluzione di blocco con una soluzione anticorpale (anticorpo a concentrazione appropriata, 0,1% Triton X-100, 4% siero d'asino normale in PBS) a 4 gradi durante la notte.
- Il giorno successivo, lavare la diapositiva 3 volte con PBS per 10 min ciascuno.
- Sostituire PBS con l'anticorpo secondario appropriato (alla concentrazione appropriata) diluito nella soluzione anticorpale per 1 h a temperatura ambiente.
- Risciacquare 3 volte per 10 min ogni volta con 1x PBS.
- Applicare la colorazione 4',6-diamidino-2-fenylindole (DAPI) e risciacquare tre volte per 10 min ciascuno con 1x PBS.
- Affisso coprelips sulla parte anteriore dei vetrini con soluzione di montaggio, lasciare asciugare a temperatura ambiente al buio, e conservare al buio a 4 gradi centigradi.
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Representative Results
La figura 1 mostra immagini rappresentative di diversi punti temporali per dimostrare l'aspetto delle celle/organoidi in tutte le diverse fasi del protocollo. Gli HESC sono stati rimossi dalla piastra di coltura dei tessuti, spezzati in piccoli pezzi, e collocati in una fiaschetta di attacco ultra-bassa T75 dove formavano sfere. È importante notare che le cellule sembrano luminose e simili in termini di dimensioni, senza cellule scure e morenti nei centri di questi ammassi. Le cellule sono state gradualmente svezzate fuori bFGF. Il giorno 5, sono stati collocati in mezzi di induzione neurale e sono rimasti in questo media per tutto il periodo della coltura. Anche se gli organoidi diventano più grandi e quindi più scuri nel tempo, è importante prendere nota delle strutture neurali simili a rosetta (frecce nere) che sono presenti in tutto lo sviluppo degli organiidi cerebrali ed espandersi. Le rosette indicano l'avvio della differenziazione neurale e contengono caratteristiche del tubo neurale embrionale, mostrando caratteristiche epiteliali e circondando un lume apicale15.
La colorazione degli organoidi con ematossilina ed eosina a 5 mesi di cultura ha indicato che non c'erano grandi quantità di necrosi anche nei centri, che era di preoccupazione iniziale dato il sistema di coltura stagnante (Figura 2A). Questi organoidi hanno dimostrato una morfologia istologica simile alla corteccia umana basata sulla valutazione microscopica leggera da parte di un neuropatologo esperto (Figura 2B). Per istologia, molte morfologie cellulari uniche sono state osservate simili a glia (testa di freccia blu), neuroni (punta di freccia rossa), cellule con morfologia Cajal-Retzius (frecce nere), e neuropil (testa di freccia arancione) (Figura 2B,C).
Per esaminare in modo più approfondito l'espressione genica all'interno delle cellule, è stato eseguito qRT-PCR. Per i risultati illustrati nella Figura 3,ogni barra rappresenta 3 lotti separati di celle coltivate in modo indipendente e raccolte nel punto temporale specificato. Questi campioni sono stati poi eseguiti in triplice copia con una coppia di primer al gene indicato in aggiunta al gene delle pulizie, GAPDH. Il trasportatore del glutammato, Vglut1 ( Figura 3A), è stato espresso a 2,5 settimane, aumentato a 5 settimane, ed è rimasto costante attraverso 5 mesi incoltura. Un marcatore del prosencefalo, Foxg1 (Figura 3B), è stato espresso a bassi livelli fino a 5 settimane di coltura. Il marcatore di livello profondo, Tbr1 (Figura 3C), ha raggiunto il picco di circa 5 settimane e successivamente è diminuito, mentre il marcatore di livello superiore, Satb2 (Figura 3D), è aumentato nel tempo.
L'espressione del marcatore ventrale Engrailed1 (Eng1) (Figura 3E), il marcatore hustralico/midollo spinale Hoxb4 (Figura 3F), nonché il marcatore oligodendrocite, Olig2 (Figura 3G), sono aumentati nel tempo. Al contrario, il marcatore delle cellule staminali, Sox2 (Figura 3H), è diminuito nel tempo. Il marcatore gliale, FAP (Figura 3I), ha raggiunto il picco di 5 settimane ed è rimasto relativamente costante successivamente. Inoltre, i dati sull'immunofluorescenza erano coerenti con i dati qRT-PCR. A 10 settimane c'era una robusta espressione di Foxg1 (Figura 4A). L'espressione Sox2 era più limitata ad aree simili alla zona subventricolare (SV) (Figura 4B,C). È interessante notare che c'era anche qualche espressione del marcatore di cella glialradiale esterno, HopX (Figura 4D).
Figura 1: Panoramica delle condizioni di crescita degli organiidi e della morfologia. (A) Schematica delle modifiche dei media. (B-M) Immagini rappresentative degli organoidi man mano che maturavano. (B-M) H9 hESCs (B) sono stati utilizzati per formare gli organoidi cerebrali. Organoids on (C) day 2 in 20 ng/mL bFGF media e (D) giorno 3 e (E) giorno 4 in 10 supporti ng/mL bFGF. (F-M) Organidi nei supporti di induzione neurale (NIM) nei giorni 5 (F), 8 (G), 10 (H), 17 (I) 35 (J,K) e 70 (L,M). Le frecce puntano a rosette neurali. Barra di scala 200 m. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 2: Gli organiidi condividevano le somiglianze istologiche con il tessuto cerebrale umano. Macchie H&E degli organoidi a 5 mesi (A) con alcune stratificazione simili alla corteccia umana (B). A un maggiore ingrandimento sono state osservate molte morfologie cellulari tra cui glia (testa di freccia blu), neuroni (testa di freccia rossa), neuropil (testa di freccia arancione) e celle con morfologia Cajal-Retzius (frecce nere) (B, C). Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 3: Espressione di geni del neurosviluppo all'interno degli organoidi cerebrali nel tempo. Quantitativi RT-PCR utilizzando il verde SYBR che valuta nol l'espressione di Vglut1 (A), Foxg1 (B), Tbr1 (C), Satb2 (D), En1 (E), Hoxb4 (F), Olig2 (G), Sox2 (H) e GFAP (I). Barre di errore: significa , media, deviazione standard (n - 3). Questa cifra è stata modificata a partire da16. Vedere la Tabella 1 per informazioni sui primer. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 4: Espressione delle proteine del neurosviluppo all'interno degli organoidi cerebrali a 10 settimane. L'immunofluorescenza ha rivelato una robusta espressione di Foxg1 (A), espressione localizzata di Sox2 (B,C) e la presenza di HopX (D). Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
| Gene | Sequenza (da 5' a 3') | Amplificatore | Essone | |
| En1 | F | GGACAATGACGTTGAAA CGCAGCA |
149 | 2 |
| R | AAGGTCGTAGCGGTTTT GGCTAGA |
2 | ||
| Foxg1 | F | AGAAGAACGGCAAGTAC Gaga |
188 | 1 |
| R | TGTTGAGGGACAGATTG TGGC |
1 | ||
| GAPDH | F | ACCACAGTCCATGCCATCATCAT Cac |
449 | 8 |
| R | CACCACCCTCTGTTGCTGT Agcc |
9 | ||
| Gfap | F | AGAGATCCGCAGCAGCAGT Atg |
80 | 4 |
| R | TCTGCAAACTTGGAGCG Gta |
5-Apr | ||
| Hoxb4 | F | AAAGCACCCTCTGHGHGGH CCAGATA |
80 | 2 |
| R | ATGGGCACGAAGATGA GGBABA |
2 | ||
| Olig2 | F | CCCTGAGGCTTTTCGGA Gcg |
451 | 1 |
| R | GCGGCTGTTGATCTCTGA GACGC |
2 | ||
| Satb2 | F | TAGCCAAGAAGAGCCCCCT Ctc |
94 | 6 |
| R | AAACTCCTGGCGGTGG Ttg |
7 | ||
| Sox2 | F | CCCAGCAGACTTCACAT Gt |
150 | 1 |
| R | CCTCC CATTTCTCGT Ttt |
1 | ||
| Tbr1 | F | GTCACCGCCTACCAGAA Cac |
101 | 4 |
| R | ACAGCCGGTAGATCG Tg |
6 | ||
| Vglut1 | F | CAGAGAGTTTTCGGCTTTG CTATTG |
183 | 5-Apr |
| R | GCGACTCCGTTCTCTAGG Gtg |
6 |
Tabella 1: sequenze di primer utilizzate per la quantitativa RT-PCR nella figura 3.
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Discussion
Simile ad altri modelli organoidi, questo è un sistema artificiale che viene fornito con diversi avvertimenti. Anche se c'era poco batch di variazione batch in termini di livelli di espressione complessiva, organidi singoli ha mostrato differenze. Ad esempio, la posizione delle aree positive Sox-2 non era identica in ogni organoide (Figura 3). Mentre qPCR è adatto a cercare cambiamenti complessivi in lotti di cellule, tecniche aggiuntive come gli RNA a cella singola saranno utilizzati in studi futuri per raccogliere ulteriori informazioni su base cellulare per cellula. Un'altra limitazione di questo sistema, è che non integra la vascolatura all'interno degli organoidi come è stato fatto in alcuni degli studi più recenti17,18,19. Tuttavia, la transizione degli HESC da un ambiente a basso e alto ossigeno può assomigliare più da vicino alla transizione anaerobica a aerobica in un embrione in via di sviluppo.
I passaggi critici all'interno di questo protocollo sono la formazione delle neurosfere, nonché la manutenzione appropriata, compresi i cambiamenti mediatici con i mezzi di coltura appropriati per garantire cellule sane e sostanze nutritive adeguate agli organoidi in crescita senza sovraffollamento . Per risolvere la proliferazione o la differenziazione cellulare inadeguata, si consiglia di iniziare con un nuovo lotto di ESC a basso passaggio e supporti appena preparati, inclusi gli integratori. Occasionalmente ci può essere variazione batch di reagenti e materiali. Così, si consiglia l'acquisto di più bottiglie di reagenti come N2 e accessori ultra-bassi che sono dallo stesso lotto, purché possano essere utilizzati in un ragionevole lasso di tempo.
A differenza di molti altri protocolli organoidi cerebrali, questo metodo non utilizza un bioreattore; invece le cellule rimangono relativamente stagnanti a parte i cambiamenti dei media. Questo è simile al lavoro precedente con le neurosfere, che alla fine sono state divise per fare colture neuronali 2D20. In questo modello le cellule sono mantenute in un formato 3D e possono crescere fino a 6 mesi di coltura. Si è scoperto che quando si utilizzano piccoli cluster invece di aggregare singole cellule che gli organoidi sembravano più luminosi, che abbiamo interpretato come meno necrotico. Come riportato in precedenza, quando gli ammassi organoidi cerebrali sono stati valutati dall'istologia e dall'immunofluorescenza a 5 mesi, non c'erano aree ovvie di necrosi16. Anche se a partire da piccoli gruppi di cellule introduce una piccola varietà nelle dimensioni degli organoidi formati, la maggior parte degli organoidi erano di dimensioni più o meno simili.
L'uso di una matrice di membrana seminterrato etetologo e un bioreattore hanno sia vantaggi che svantaggi. Alcuni tipi di cellule, o organoidi cerebrali più grandi potrebbero preferire la crescita in una condizione o nell'altra. Matrici di membrana seminterrato o altri idrogel potrebbero essere utili per aggiungere selettivamente fattori di crescita a particolari regioni o creare stampi specifici. Anche se le matrici di membrana seminterrato hanno dimostrato di sostenere l'organizzazione tridimensionale e la differenziazione15, vale la pena sottolineare che alcuni di questi prodotti hanno una composizione mal definita e variabile che include quantità di fattori di crescita12. Oltre a semplificare il flusso di lavoro durante la coltura degli organoidi cerebrali, l'assenza di una matrice di membrana seminterrato potrebbe anche migliorare le tecniche di imaging tridimensionale.
Lo sviluppo di questo sistema di modelli organoidi cerebrali offre un nuovo approccio per molte potenziali applicazioni. Per esempio, insulti tossici come ipossia, iperglicemia, ipercapnia, e l'infezione tra gli altri, possono essere testati con questo sistema. Inoltre, i disturbi del neurosviluppo possono essere studiati con questo sistema iniziando con cellule staminali geneticamente modificate o cellule staminali pluripotenti indotte dall'uomo specifiche del paziente (hPSC). La capacità di aggiungere diversi tipi di cellule durante la coltura organoide offre anche la possibilità di studiare le interazioni tumora-cervello. Data la semplicità del protocollo e la mancanza di materiali costosi e speciali speriamo che questo approccio possa essere considerato dai laboratori sia all'interno che all'esterno del campo come un metodo potenziale con i propri vantaggi unici per avanzare ulteriormente questo rapidamente una disciplina progressiva ed emozionante.
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Disclosures
S.G.K. è un membro SAB per Dansar IT e Gene-in-Cell.
Acknowledgments
Ringraziamo lo Yale Stem Cell Core (YSCC) e lo Yale Cancer Center (YCC) per l'assistenza. Ringraziamo il dottor Jung Kim per la sua recensione neurologica. Questo lavoro è stato sostenuto dal Connecticut Regenerative Medicine Research Fund, March of Dimes, e NHLBI R01HL131793 (S.G.K.), lo Yale Cancer Center e il Yale Cancer Biology Training Program NCI CA193200 (E.B.) e un generoso dono senza restrizioni da parte di Joseph e Lucille Madri.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Alexa Fluor 488 goat anti-mouse | Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, USA | A11029 | |
| Alexa Fluor 546 goat anti-rabbit | Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, USA | A11035 | |
| B27 Supplement | Gibco, Waltham, MA, USA | 17504-044 | |
| bFGF | Life Technologies, Carlsbad, CA, USA | PHG0263 | |
| BSA | Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA | A9647 | |
| BX43 microscope | Olympus, Shinjuku, Tokyo, Japan | ||
| DAPI stain | Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, USA | D1306 | |
| Dispase | STEMCELL Technologies, Vancouver, Canada | 07913 | |
| DMEM/F12 | Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, USA | 11330-032 | |
| DPBS | Gibco, Waltham, MA, USA | 10010023 | |
| FluroSave | MilliporeSigma, Burlington, MA | 345789 | |
| GFAP antibody | NeuroMab, Davis, CA | N206A/8 | |
| Growth Factor Reduced Matrigel (Matrix) | Corning, Corning, NY, USA | 356231 | |
| H9 hESCs | WiCell, Madison, WI, USA | WA09 | |
| Heparin | Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA | 9041-08-1 | |
| iQ SYBR Green Supermix | Bio-Rad, Hercules, CA, USA | 1708880 | |
| iScript cDNA Synthesis Kit | Bio-Rad, Hercules, CA, USA | 1708891 | |
| L-glutamine | Gibco, Waltham, MA, USA | 25030-081 | |
| Monothioglycerol | Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA | M6145 | |
| mTESR media | STEMCELL Technologies, Vancouver, Canada | 85850 | |
| N2 NeuroPlex | Gemini Bio Products, West Sacramento, CA, USA | 400-163 | |
| Nanodrop | Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, USA | ND-2000 | |
| NEAA | Gibco, Waltham, MA, USA | 11140-050 | |
| Normal Donkey Serum (NDS) | ImmunoResearch Laboratories Inc., West Grove, PA, USA | 017-000-121 | |
| OCT | Sakura Finetek, Torrance, CA, USA | 25608-930 | |
| PFA | Electron Microscopy Sciences, Hatfield, PA | RT15710 | |
| qPCR machine | Bio-Rad, CFX96, Hercules, CA, USA | 1855196 | |
| RNeasy kit | Qiagen, Hilden, Germany | 74104 | |
| Sox2 | MilliporeSigma, Burlington, MA | AB5603 | |
| TMS-F microscope | Nikon, Melville, NY, USA | ||
| Triton X-100 | Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA | T8787-100ML | |
| Ultra-low attachment T75 flasks | Corning, Corning, NY, USA | 3814 |
References
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