Summary
Esse protocolo foi gerado como um meio de produzir organoides cerebrais de forma simplificada e de baixo custo sem fatores de crescimento exógenos ou matriz de membrana do porão, mantendo a diversidade de tipos de células cerebrais e muitas características da organização celular.
Abstract
Organoides cerebrais humanos diferenciados de células-tronco embrionárias oferecem a oportunidade única de estudar interações complicadas de múltiplos tipos de células em um sistema tridimensional. Aqui apresentamos um método relativamente simples e barato que produz organoides cerebrais. Neste protocolo, as células-tronco pluripotentes humanas são divididas em pequenos aglomerados em vez de células únicas e cultivadas na mídia básica sem uma matriz de membrana de porão heterologous ou fatores de crescimento exógenos, permitindo que as pistas de desenvolvimento intrínsecas modelem o crescimento organoide. Este sistema simples produz uma diversidade de tipos de células cerebrais, incluindo células gliais e microgliais, células-tronco e neurônios do cérebro, cérebro médio e cérebro traseiro. Organoides gerados a partir deste protocolo também exibem marcas de organização temporal e espacial apropriada demonstrada por imagens de campo brilhante, histologia, imunofluorescência e reação quantitativa quantitativa da cadeia de polimerase em tempo real ( qRT-PCR). Como esses organoides contêm tipos de células de várias partes do cérebro, eles podem ser utilizados para estudar uma infinidade de doenças. Por exemplo, em um artigo recente demonstramos o uso de organoides gerados a partir deste protocolo para estudar os efeitos da hipóxia no cérebro humano. Essa abordagem pode ser usada para investigar uma série de condições de estudo difíceis de estudar, como deficiências neurodesenvolvimentista, distúrbios genéticos e doenças neurológicas.
Introduction
Devido a uma miríade de limitações práticas e éticas, houve muita dificuldade em estudar o cérebro humano. Embora estudos que utilizam roedores tenham sido críticos para nossa compreensão do cérebro humano, o cérebro do rato tem muitas diferenças1,2. Curiosamente, os camundongos têm uma densidade neuronal que é pelo menos 7 vezes menor que o cérebro primata3,4. Embora os primatas estejam mais próximos dos humanos do que os roedores do ponto de vista evolutivo, não é prático para a maioria dos pesquisadores trabalhar com eles. O objetivo deste protocolo era recapitular muitas características importantes do cérebro humano usando um método simplificado e menos caro sem a necessidade de uma matriz de membrana de porão heterologous ou fatores de crescimento exógenos, mantendo a diversidade celular cerebral e a organização celular.
O trabalho formativo do laboratório Sasai utilizou a cultura livre de soro do método de corpos embrionários (SFEBq) para gerar tipos de células neuronais bidimensionais bidimensionais de células-tronco sinalizadas (ESCs)5,6. Muitos métodos organoides cerebrais humanos seguiram um caminho relativamente semelhante das ESCs sinalizadas7,8. Em contraste, este protocolo começa com clusters de ESCs humanos destacados (HESCs), semelhantes aos passos iniciais do trabalho seminal dos laboratórios Thomson e Zhang antes das etapas de revestimento9,10, bem como o passo inicial do protocolo organoide cerebral do laboratório Pasca antes da adição de fatores de crescimento exógenos11. Matrizes de membrana do porão (por exemplo, matrigel) têm sido utilizadas em muitos protocolos organoides cerebrais e tem se mostrado um andaime eficaz8. No entanto, as matrizes de membrana do porão mais comumente utilizadas não vêm sem complicações, pois copurificam com quantidades desconhecidas de fatores de crescimento com variabilidade em lote a lote durante a produção12. Além disso, essas matrizes podem complicar a imagem e aumentar o risco de contaminação e custo.
Embora os organoides cerebrais humanos possam ser usados para responder a muitas perguntas, há certas limitações a ter em mente. Por um ano, a partir de células-tronco embrionárias, os organoides se assemelham mais a cérebros imaturos do que cérebros idosos e, como tal, podem não ser modelos ideais para doenças que ocorrem na velhice, como a doença de Alzheimer. Segundo, enquanto nosso protocolo encontrou marcadores de desenvolvimento cerebral, cérebro médio e hindbrain que são úteis para estudar o efeito de um tratamento ou doença em células de múltiplas regiões cerebrais em concerto, outros protocolos podem ser seguidos para se concentrar em regiões cerebrais específicas13,14. Finalmente, outra limitação dos modelos organoides é a de tamanho, enquanto o comprimento médio de um cérebro humano aproximadamente 167 mm, organoides cerebrais feitos com o uso de agitação crescem até 4 mm8 e os organoides formados por este protocolo crescem para 1-2 mm por 10 semanas. No entanto, este protocolo fornece uma ferramenta importante para estudar o tecido cerebral humano e a interação de múltiplos tipos de células.
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Protocol
1. Manutenção de células-tronco
- Mantenha hESCs em uma camada de fator de crescimento reduzido matriz de membrana do porão (ver a Tabela de Materiais, a partir de agora simplesmente referida como matriz) de acordo com as instruções do fabricante.
- Para revestir uma placa de 6 poços ou um prato de 10 cm, misture 100 μL de matriz com 5,9 mL de meio Águia modificado de Dulbecco (DMEM)/F12. Enrole as placas em filme de parafina e armazene durante a noite a 4°C. Use-as no dia seguinte para passar células depois que o excesso de matriz/mídia é aspirado.
- Cultura as células semana a semana a aproximadamente uma proporção dividida de 1:12 a cada 7 dias. Mantenha as células usando mídia mTESR-1 em 37 °C, incubadora de baixo oxigênio (5% O2,5% CO2). Atualize a mídia diariamente. Eliminaram células diferenciadas da cultura entre passagens usando ferramentas de vidro.
- As células H9 devem ser passagens de quatro a seis dias antes de utilizá-las para produzir organoides. As células devem ser passagens a aproximadamente uma proporção de 1:8 de aglomerados celulares. Para isso, comece enxaguando as células com mídia DMEM F12 e dissociar as células com protease neutra (por exemplo, dispase, a partir de agora referida simplesmente como protease), enxágue com DMEM/F-12, e placa como 30-60 aglomerados de células em 4 placas (6-well ou 10 cm) em ~20% confluência. Dois dias antes da colheita, a transição para uma incubadora regular (21% O2, 5% CO2). As placas devem atingir ~80% de confluência ao iniciar a formação organoide.
2. Dissociação dos ESCs para a Cultura Organoide
- Aliquot a solução de estoque protease (5 U/mL).
NOTA: Normalmente congelamos 1 mL aliquots a -20 °C para uso ao longo de vários meses. - Diluir a solução de estoque protease para a concentração de trabalho adicionando 1 mL da solução de estoque mais 5 mL de DMEM/F12 para cada placa de 6-well ou 10 cm de hESCs.
- Aspirar e remover a mídia da cultura celular, em seguida, cubra os hESCs com a solução protease. Coloque placas na incubadora por 10-15 min ou até que as bordas das colônias se recomam e comecem a se separar da matriz.
- Incline a placa, aspirar a solução protease e lave delicadamente as células com DMEM/F12 três vezes. Use 2 mL/bem para cada lavagem ao usar uma placa de 6 poços e 6 mL ao usar uma placa de 10 cm. Certifique-se de que as colônias permaneçam presas à matriz ao realizar este passo.
- Adicione cerca de 1,5 mL de mídia mTESR fresca a cada poço (ou 5 mL para uma placa de 10 cm) e lave as células da placa usando tubulação suave.
- Usando uma pipeta de 10 mL, gentilmente aspirado e dispense hESC dentro da placa até atingir aproximadamente 1/30th de seu tamanho original. Os aglomerados de colônias devem se assemelhar a praças de tamanho de ~250-350 μm na conclusão dessas etapas.
3. Geração de Organoides
- Transferir células para um único frasco T75 de fixação ultra-baixa contendo 30 mL de mídia mTESR sem fator básico de crescimento do fibroblasto (bFGF).
- No dia seguinte, incline o frasco de tal forma que as células ao vivo se agrupam no canto (isso pode levar de 5 a 10 min no primeiro dia, mas vai ficar mais rápido à medida que os aglomerados ficam maiores).
NOTA: Se houver um grande número de células que aderiram ao fundo do frasco nesta etapa ou quaisquer etapas subsequentes, transfira as células para um novo frasco. É normal ter uma alta população de células mortas nos dois primeiros dias. Ao realizar mudanças na mídia, certifique-se de remover o máximo possível de detritos celulares. - Uma vez que as células se instalem, aspiram a mídia e células mortas deixando cerca de 10 mL de mídia contendo as células vivas.
- Adicione ~20 mL de mídia bFGF baixa (DMEM/F12 complementado com 1x N2, 1x B27, 1x L-glutamina, 1x NEAA, 0,05% de albumina de soro bovino (BSA) e 0,1 mM monothioglicerol (MTG) complementado com 30 ng/mL bFGF).
- Verifique as celas no dia 2. Se a maioria das células parecer saudável e brilhante, não há necessidade de fazer nada. No entanto, se mais de um terço das células parecerem escuras, substitua a mídia (usando a mesma técnica de inclinação da etapa 3.2) por ~20 mL de mídia bFGF baixa complementada com 20 ng/mL bFGF.
- No dia 3, substitua metade da mídia (usando a técnica de inclinação na etapa 3.2) por 20 mL de mídia bFGF baixa complementada com 10 ng/mL bFGF.
- No dia 5, substitua metade do meio (usando a técnica de inclinação na etapa 3.2) por 20 mL de mídia de indução neural (NIM: DMEM/F12, suplemento 1x N2, 0,1 mM MEM NEAA, 2 μg/mL heparin).
NOTA: Se houver grandes aglomerados de células ou organoides muito maiores que os outros, eles devem ser removidos da cultura. O tamanho é estimado pela aparência o microscópio; por exemplo, usando um oftalmologista com retícula. A maioria dos organoides são de tamanho similar (cerca de 100 ± 20 μm). Removemos organoides que eram aproximadamente 2x menores ou maiores que os outros. - Substitua metade do meio (~15 mL) (usando a técnica de inclinação) por NIM a cada dois dias.
- Após 3 semanas na cultura, adicione 100x penicilina/estreptomia à mídia (NIM: DMEM/F12, suplemento 1x N2, 0,1 mM MEM NEAA, 2 μg/mL heparin) em uma concentração final de 1x se desejar. Atualize a mídia a cada dois dias.
NOTA: Dessa forma, mantivemos os organoides por até 6 meses na cultura.
4. Extração e Preparação do RNA
- Extrair suavemente aproximadamente 15 organoides (dependendo do tamanho) do frasco usando uma pipeta de 10 mL e coloque em um tubo de 1,5 mL.
- Desmonte delicadamente os organoides na centrífuga (200 x g por 1 min), e enxágue com 1x PBS (DPBS) de Dulbecco três vezes.
- Extrair RNA utilizando sistema ou protocolo validado (por exemplo, kit RNeasy).
- Meça o valor de densidade óptica de cada amostra em 260 e 280 nm.
- Prepare o cDNA usando um sistema ou protocolo validado (por exemplo, kit de síntese de cDNA iScript).
- Executar qRT-PCR usando primers pré-validados (Tabela 1) incluindo pelo menos um gene de limpeza.
5. Imunohistoquímica
- Fixação
- Prepare uma solução de 4% paraformaldeído (PFA) e coloque-a em 4°C.
- Usando uma navalha estéril, corte a ponta de uma pipeta de transferência estéril.
- Extrair organoides suavemente usando a pipeta de transferência de corte, pois eles podem ser facilmente separados, especialmente quando crescem grandes, e colocá-los em uma placa de 6 poços com mídia adicional ou DPBS.
- Incline a placa, aspirar a mídia e substituir por 1x DPBS. Enxágüe as células com 1x DPBS duas vezes adicionais.
- Substitua o DPBS por 4% de solução PFA e coloque em um shaker a 4 °C.
NOTA: Enquanto fixamos por 2 dias (para pequenos organoides) a 7 dias (para organoides >3 meses), os tempos mais curtos (por exemplo, 16-24 h) também podem ser possíveis. - Prepare 30%, 20% e 10% soluções de sacarose na DPBS.
- Após fixação na PFA, substitua com a solução de sacarose de 10% e coloque em um shaker a 4 °C por 24 h.
- Substitua a sacarose de 10% por 20% de sacarose e coloque em um shaker a 4 °C por 24 h.
- Substitua a sacarose de 20% por 30% de sacarose e coloque em um shaker a 4 °C por 24 h.
- Seções congeladas
- Prepare uma camada plana de gelo seco e coloque um molde de plástico rotulado em cima dele.
- Despeje uma fina camada de média de temperatura de corte ideal (OCT) no molde e deixe-a começar a endurecer (dentro de alguns segundos).
- Coloque alguns organoides na parte superior do OCT no molde usando uma pipeta de transferência com a ponta cortada e preste muita atenção à localização dos organoides.
- Adicione lentamente em OUT até que o molde esteja cheio e os organoides estejam cobertos. Deixe endurecer completamente por mais 10 min.
NOTA: Embora o congelamento de mais de 10 min ajude a garantir a colocação relativa ideal de múltiplos organoides para secagem, é possível usar uma mistura de gelo seca de etanol ou nitrogênio líquido para congelar mais rapidamente. - Marque a localização relativa dos organoides com um marcador para facilitar a localização deles ao cortar.
- Coloque os moldes em uma bolsa ou caixa e armazene a -80 °C até ficar pronto para cortar as seções.
- Usando um criostat, corte seções de 10 μm e coloque o tecido em lâminas rotuladas e carregadas positivamente.
- Mancha
- Prepare a solução de bloqueio (0,3% Triton X-100, 4% do soro de burro normal na PBS).
- Use uma caneta hidrofóbica para desenhar ao redor do perímetro do tecido.
- Enxágüe os slides com PBS 3 vezes por 5 min cada.
- Substitua o PBS por solução de bloqueio por 1h à temperatura ambiente.
- Substitua a solução de bloqueio por solução de anticorpos (anticorpo em concentração adequada, 0,1% Triton X-100, 4% de soro de burro normal na PBS) a 4 °C durante a noite.
- No dia seguinte, lave o slide 3 vezes com PBS por 10 min cada.
- Substitua o PBS pelo anticorpo secundário apropriado (na concentração apropriada) diluído na solução de anticorpos por 1h à temperatura ambiente.
- Enxágüe 3 vezes por 10 min cada vez com 1x PBS.
- Aplique a mancha de 4',6-diamidino-2-phenillindole (DAPI) e enxágue três vezes por 10 min cada com 1x PBS.
- Os covers afixos para a frente dos slides com solução de montagem, deixem secar à temperatura ambiente no escuro, e armazenem no escuro a 4 °C.
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Representative Results
A Figura 1 mostra imagens representativas de campo brilhante de vários pontos de tempo para demonstrar como são as células/organoides ao longo dos diferentes estágios do protocolo. Os hESCs foram removidos da placa de cultura do tecido, quebrados em pequenos pedaços, e colocados em um frasco de fixação ultra-baixo T75 onde formavam esferas. É importante notar que as células parecem brilhantes e semelhantes em tamanho, sem células escuras e moribundas nos centros desses aglomerados. As células foram gradualmente desmadas do bFGF. No dia 5, eles foram colocados em mídia de indução neural e permaneceram nesta mídia durante todo o período cultural. Embora os organoides fiquem maiores e, portanto, mais escuros com o tempo, é importante tomar nota das estruturas neurais semelhantes à roseta (flechas pretas) que estão presentes em todo o desenvolvimento organoide cerebral e expandir. As rosetas indicam a iniciação da diferenciação neural e contêm características do tubo neural embrionário, exibindo características epiteliais e ao redor de um lúmen apical15.
A coloração dos organoides com hematoxilina e eosina aos 5 meses de cultura indicou que não havia grandes quantidades de necrose mesmo nos centros, o que era de preocupação inicial dado o sistema cultural estagnado (Figura 2A). Esses organoides demonstraram uma morfologia histológica semelhante ao córtex humano baseado na avaliação microscópica da luz por um neuropatologista experiente(Figura 2B). Por histologia, muitas morfologias celulares únicas foram observadas semelhantes a glia (cabeça de flecha azul), neurônios (ponta da flecha vermelha), células com morfologia Cajal-Retzius (flechas pretas) e neuropil (cabeça de flecha laranja) (Figura 2B,C).
Para dar uma olhada mais aprofundada na expressão genética dentro das células, qRT-PCR foi realizado. Para os resultados apresentados na Figura 3,cada barra representa 3 lotes separados de células cultivadas de forma independente e colhidas no ponto de tempo especificado. Estas amostras foram então executadas em triplicado com um par primer para o gene indicado, além do gene de limpeza, GAPDH. O transportador glutamato, Vglut1 (Figura 3A), foi expresso em 2,5 semanas, aumentou em 5 semanas e permaneceu consistente ao longo de 5 meses na cultura. Um marcador de cérebro anterior, Foxg1 (Figura 3B), foi expresso em níveis baixos até 5 semanas na cultura. O marcador de camada profunda, Tbr1 (Figura 3C),atingiu o pico em torno de 5 semanas e diminuiu posteriormente, enquanto o marcador de camada superior, Satb2 ( Figura3D),aumentou com o tempo.
A expressão do marcador ventral Engrailed1 (Eng1) (Figura 3E),o marcador de medula traseira/medula espinhal Hoxb4 (Figura 3F),bem como o marcador oligodendrocyte, Olig2 (Figura 3G),todos aumentaram com o tempo. Em contraste, o marcador de células-tronco, Sox2 (Figura 3H), diminuiu com o tempo. O marcador glial, FAP (Figura 3I),atingiu o pico em 5 semanas e permaneceu relativamente constante posteriormente. Além disso, os dados de imunofluorescência foram consistentes com os dados qRT-PCR. Às 10 semanas houve uma expressão robusta de Foxg1 (Figura 4A). A expressão Sox2 estava mais confinada a áreas semelhantes à zona subventricular (SVZ) (Figura 4B,C). Curiosamente, houve também alguma expressão do marcador de células gliais radiais externas, HopX (Figura 4D).
Figura 1: Visão geral das condições de crescimento organoide e morfologia. (A)Esquema de mudanças na mídia. (B-M) Imagens representativas de organoides enquanto amadureciam. (B-M) H9 hESCs(B)foram utilizados para formar os organoides cerebrais. Organoides em (C) dia 2 em 20 ng/mL bFGF mídia, e (D) dia 3 e (E) dia 4 em 10 ng/mL bFGF mídia. (F-M) Organoides em mídia de indução neural (NIM) nos dias 5 (F), 8(G), 10 (H), 17 (I) 35(J,K) e 70 (L,M). Flechas apontam para rosetas neurais. Barra de escala = 200 μm. Clique aqui para ver uma versão maior deste valor.
Figura 2: Organoides compartilhavam semelhanças histológicas com tecido cerebral humano. Coloração de H&E dos organoides aos 5 meses(A)com algumas camadas semelhantes ao córtex humano(B). Na maior ampliação, foram observadas muitas morfologias celulares, incluindo glia (cabeça de flecha azul), neurônios (ponta da flecha vermelha), neuropil (cabeça de flecha laranja) e células com morfologia Cajal-Retzius (flechas pretas)(B,C). Clique aqui para ver uma versão maior deste valor.
Figura 3: Expressão de genes neurodesenvolvimentativos dentro dos organoides cerebrais ao longo do tempo. Dados quantitativos RT-PCR utilizando o verde SYBR avaliando a expressão de Vglut1 (A),Foxg1 (B),Tbr1(C),Satb2(D),En1(E),Hoxb4(F),Olig2(G),Sox2(H)e GFAP (I). Barras de erro = média ± desvio padrão (n ≥ 3). Este número foi modificado a partir de16. Consulte a Tabela 1 para obter informações sobre primer. Clique aqui para ver uma versão maior deste valor.
Figura 4: Expressão de proteínas neurodesenvolvimentais dentro dos organoides cerebrais em 10 semanas. A imunofluorescência revelou uma expressão robusta de Foxg1 (A),expressão localizada de Sox2 (B,C) e a presença de HopX(D). Clique aqui para ver uma versão maior deste valor.
| Gene | Sequência (5' a 3') | Amplicon | Exon | |
| En1 | F | GGACAATGACGTGaAA CGCAGCA |
149 | 2 |
| R | AAGGTCGTAAGCGGTTTT GGCTAGA |
2 | ||
| Foxg1 | F | AGAAGAACGGCAAGTAC Gaga |
188 | 1 |
| R | TGTTGAGGGACAGATTG TGGC |
1 | ||
| GAPDH | F | ACCACAGTCCATGCCAT Cac |
449 | 8 |
| R | CACCACCCTGTTGCTGT Agcc |
9 | ||
| GFAP | F | AGAGATCCGCACGCAGT Atg |
80 | 4 |
| R | TCTGCAAACTTGGAGCG Gta |
5-Abr | ||
| Hoxb4 | F | AAAGCACCCTCTGACTG CCAGATA |
80 | 2 |
| R | ATGGGCACGAAGATGA GGGAGA |
2 | ||
| Olig2 | F | CCCTGAGGCTTTCGGA Gcg |
451 | 1 |
| R | GCGGCTGTTGATCTTGA GACGC |
2 | ||
| Satb2 | F | TAGCCAAAGAATGCCCT Ctc |
94 | 6 |
| R | AAACTCCTGGCACTTGG Ttg |
7 | ||
| Sox2 | F | CCCAGCAGACTTCACAT Gt |
150 | 1 |
| R | CCTCCCATTTCCCTCGT Ttt |
1 | ||
| Tbr1 | F | GTCACCGCCTACCAGAA Cac |
101 | 4 |
| R | ACAGCCGGTGTAGATCG Tg |
6 | ||
| Vglut1 | F | CAGAGTTTCGGCTTTG CTATTG |
183 | 5-Abr |
| R | GCGACTCCGTTCTAAGG Gtg |
6 |
Tabela 1: Sequências primer usadas para RT-PCR quantitativo na Figura 3.
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Discussion
Semelhante a outros modelos organoides, este é um sistema artificial que vem com várias ressalvas. Embora houvesse pouca variação de lote a lote em termos de níveis gerais de expressão, organoides individuais apresentaram diferenças. Por exemplo, a localização das áreas positivas Sox-2 não era idêntica em cada organoide(Figura 3). Embora o qPCR seja adequado para procurar mudanças globais em lotes de células, técnicas adicionais como a RNAseq de célula única serão utilizadas em estudos futuros para coletar mais informações em uma base celular. Outra limitação desse sistema, é que ele não integra vasculatura dentro dos organoides como tem sido feito em alguns dos estudos mais recentes17,18,19. No entanto, a transição dos HESCs de um ambiente de baixo para alto oxigênio pode se assemelhar mais de perto à transição anaeróbica para aeróbica em um embrião em desenvolvimento.
Os passos críticos dentro deste protocolo são a formação das neuroesferas, bem como a manutenção adequada, incluindo mudanças na mídia com a mídia de cultura adequada para garantir células saudáveis e nutrientes adequados aos organoides em crescimento sem superlotação . Para solucionar a proliferação ou diferenciação inadequada das células, recomendamos começar com um novo lote de ESCs de baixa passagem e mídia recém-preparada, incluindo suplementos. Ocasionalmente, pode haver variação de lote de reagentes e materiais. Assim, recomendamos a compra de várias garrafas de reagentes como N2 e frascos de fixação ultra-baixo que são do mesmo lote, desde que possam ser utilizados em uma quantidade razoável de tempo.
Ao contrário de muitos outros protocolos organoides cerebrais, este método não usa um bioreator; em vez disso, as células permanecem relativamente estagnadas, além das mudanças na mídia. Isso é semelhante ao trabalho anterior com neuroesferas, que acabaram sendo quebradas para fazer culturas neuronais 2D20. Neste modelo, as células são mantidas em formato 3D e podem crescer por até 6 meses na cultura. Verificou-se que ao utilizar pequenos aglomerados em vez de agregar células únicas que os organoides pareciam mais brilhantes, que interpretamos como menos necrosados. Como relatado anteriormente, quando os agrupamentos organoides cerebrais foram avaliados por histologia e imunofluorescência aos 5 meses, não havia áreas óbvias de necrose16. Embora a partir de pequenos aglomerados de células introduza um pouco de variedade no tamanho dos organoides formados, a maioria dos organoides eram de um tamanho aproximadamente semelhante.
O uso de uma matriz de membrana de porão heterologous e um bioreator têm vantagens e desvantagens. Certos tipos de células, ou organoides cerebrais maiores podem preferir crescimento uma condição ou outra. Matrizes de membrana do porão ou outros hidrogéis podem ser benéficos para adicionar seletivamente fatores de crescimento a determinadas regiões ou criar moldes específicos. Embora as matrizes de membrana do porão tenham sido demonstradas para apoiar a organização tridimensional e a diferenciação15,vale ressaltar que alguns desses produtos têm uma composição mal definida e variável que inclui quantidades de fatores de crescimento12. Além de simplificar o fluxo de trabalho enquanto culicula os organoides cerebrais, a ausência de uma matriz de membrana do porão também pode melhorar as técnicas de imagem tridimensional.
O desenvolvimento deste sistema de modelo organoide cerebral oferece uma nova abordagem para muitas aplicações potenciais. Por exemplo, insultos tóxicos como hipóxia, hiperglicemia, hipercapnia e infecção, entre outros, podem ser testados com este sistema. Além disso, distúrbios neurodesenvolvimentivos podem ser estudados com este sistema, começando com células-tronco geneticamente modificadas ou células-tronco pluripotentes induzidas pelo paciente (hPSCs). A capacidade de adicionar diferentes tipos de células durante a cultura organoide também oferece a possibilidade de estudar interações tumorais-cerebrais. Dada a simplicidade do protocolo e a falta de materiais especiais caros, esperamos que essa abordagem possa ser considerada por laboratórios dentro e fora do campo como um método potencial com seus próprios benefícios únicos para avançar mais rapidamente. progredindo e disciplina emocionante.
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Disclosures
S.G.K. é membro da SAB para Dansar IT e Gene-in-Cell.
Acknowledgments
Agradecemos ao Yale Stem Cell Core (YSCC) e ao Yale Cancer Center (YCC) pela ajuda. Agradecemos ao Dr. Jung Kim por sua revisão da neuropatologia. Este trabalho foi apoiado pelo Connecticut Regenerative Medicine Research Fund, March of Dimes e NHLBI R01HL131793 (S.G.K.), o Yale Cancer Center e o Yale Cancer Biology Training Program NCI CA193200 (E.B.) e um generoso presente irrestrito de Joseph e Lucille Madri.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Alexa Fluor 488 goat anti-mouse | Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, USA | A11029 | |
| Alexa Fluor 546 goat anti-rabbit | Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, USA | A11035 | |
| B27 Supplement | Gibco, Waltham, MA, USA | 17504-044 | |
| bFGF | Life Technologies, Carlsbad, CA, USA | PHG0263 | |
| BSA | Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA | A9647 | |
| BX43 microscope | Olympus, Shinjuku, Tokyo, Japan | ||
| DAPI stain | Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, USA | D1306 | |
| Dispase | STEMCELL Technologies, Vancouver, Canada | 07913 | |
| DMEM/F12 | Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, USA | 11330-032 | |
| DPBS | Gibco, Waltham, MA, USA | 10010023 | |
| FluroSave | MilliporeSigma, Burlington, MA | 345789 | |
| GFAP antibody | NeuroMab, Davis, CA | N206A/8 | |
| Growth Factor Reduced Matrigel (Matrix) | Corning, Corning, NY, USA | 356231 | |
| H9 hESCs | WiCell, Madison, WI, USA | WA09 | |
| Heparin | Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA | 9041-08-1 | |
| iQ SYBR Green Supermix | Bio-Rad, Hercules, CA, USA | 1708880 | |
| iScript cDNA Synthesis Kit | Bio-Rad, Hercules, CA, USA | 1708891 | |
| L-glutamine | Gibco, Waltham, MA, USA | 25030-081 | |
| Monothioglycerol | Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA | M6145 | |
| mTESR media | STEMCELL Technologies, Vancouver, Canada | 85850 | |
| N2 NeuroPlex | Gemini Bio Products, West Sacramento, CA, USA | 400-163 | |
| Nanodrop | Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, USA | ND-2000 | |
| NEAA | Gibco, Waltham, MA, USA | 11140-050 | |
| Normal Donkey Serum (NDS) | ImmunoResearch Laboratories Inc., West Grove, PA, USA | 017-000-121 | |
| OCT | Sakura Finetek, Torrance, CA, USA | 25608-930 | |
| PFA | Electron Microscopy Sciences, Hatfield, PA | RT15710 | |
| qPCR machine | Bio-Rad, CFX96, Hercules, CA, USA | 1855196 | |
| RNeasy kit | Qiagen, Hilden, Germany | 74104 | |
| Sox2 | MilliporeSigma, Burlington, MA | AB5603 | |
| TMS-F microscope | Nikon, Melville, NY, USA | ||
| Triton X-100 | Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA | T8787-100ML | |
| Ultra-low attachment T75 flasks | Corning, Corning, NY, USA | 3814 |
References
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