Summary

İnsan Embriyonik Kök Hücrelerinden Beyin Organoidleri Üretmek için Statik Kendi Kendini Yöneten Bir Yöntem

Published: March 04, 2020
doi:

Summary

Bu protokol, beyin hücresi tiplerinin çeşitliliğini ve hücresel organizasyonun birçok özelliğini korurken, dışsal büyüme faktörleri veya bazal membran matrisi olmadan basitleştirilmiş, düşük maliyetli bir şekilde beyin organoidleri üretmek için bir araç olarak oluşturulmuştur.

Abstract

Embriyonik kök hücrelerden farklı laşan insan beyin organoidleri, üç boyutlu bir sistemde birden fazla hücre türünün karmaşık etkileşimlerini incelemek için eşsiz bir fırsat sunar. Burada beyin organoidleri verimleri nispeten basit ve ucuz bir yöntem salıyoruz. Bu protokolde insan pluripotent kök hücreleri tek hücreler yerine küçük kümelere ayrılır ve heterolog bir bazal membran matrisi veya eksojen büyüme faktörleri olmaksızın temel ortamda büyütülür ve içsel gelişimsel ipuçlarının organoid in büyümesi. Bu basit sistem glial ve mikroglial hücreler de dahil olmak üzere beyin hücresi türlerinin bir çeşitlilik üretir, kök hücreler, ve ön beyin nöronlar, orta beyin, ve arka beyin. Bu protokolden üretilen organoidler ayrıca brightfield görüntüleri, histolojisi, immünororesans ve gerçek zamanlı kantitatif ters transkripsiyon polimeraz zincir reaksiyonu ile gösterilen uygun zamansal ve mekansal organizasyonun işaretlerini de göstermektedirler ( qRT-PCR). Bu organoidler beynin çeşitli bölgelerinden hücre tipleri içerdiğinden, çok sayıda hastalığın incelenmesinde kullanılabilirler. Örneğin, yakın zamanda yayınlanan bir makalede, hipoksinin insan beyni üzerindeki etkilerini incelemek için bu protokolden üretilen organoidlerin kullanımını gösterdik. Bu yaklaşım, nörogelişimsel handikaplar, genetik bozukluklar ve nörolojik hastalıklar gibi başka türlü zor koşulları araştırmak için kullanılabilir.

Introduction

Sayısız pratik ve etik sınırlamalar nedeniyle, insan beynini incelemekte büyük bir zorluk olmuştur. Kemirgenler kullanan çalışmalar insan beyninin anlayışı için kritik olmuştur iken, fare beyin birçok farklılıklar vardır1,2. İlginçtir, fareler primatbeyin3,4en az 7 kat daha az bir nöronal yoğunluğu var. Primatlar insanlara evrimsel açıdan kemirgenlerden daha yakın olsalar da, çoğu araştırmacının onlarla çalışması pratik değildir. Bu protokolün amacı, beyin hücresi çeşitliliği ve hücresel örgütlenmeyi korurken heterolog bir bazal membran matrisine veya eksojen büyüme faktörlerine gerek kalmadan basitleştirilmiş ve daha ucuz bir yöntem kullanarak insan beyninin birçok önemli özelliğini özetlemekti.

Sasai laboratuarından biçimlendirici çalışma sinyalize embriyonik kök hücrelerden iki ve üç boyutlu nöronal hücre tipleri oluşturmak için embriyoid organların serum ücretsiz kültür (SFEBq) yöntemi kullanılır (ESCs)5,6. Birçok insan beyin organoid yöntemleri sinyalize ESCs nispeten benzer bir yol izlemiştir7,8. Buna karşılık, bu protokol müstakil insan ESCs kümeleri ile başlar (hESCs), kaplama adımları önce Thomson ve Zhang laboratuvarlarının seminal çalışmanın ilk adımları benzer9,10 yanı sıra eksojen büyüme faktörlerinin eklenmesinden önce Pasca laboratuvarının beyin organoid protokolünün ilk adım11. Bazal membran matrisler (örneğin, matrigel) birçok beyin organoid protokolleri kullanılmıştır ve etkili bir iskele olduğu gösterilmiştir8. Ancak, en sık kullanılan bazal membran matrisler onlar üretim sırasında toplu değişkenlik için toplu büyüme faktörlerinin bilinmeyen miktarlarda co-arındırmak gibi komplikasyonlar olmadan gelmez12. Buna ek olarak, bu matrisler görüntülemekarmaşık ve kontaminasyon ve maliyet riskini artırabilir.

İnsan beyin organoidler birçok soruya cevap için kullanılabilir iken, akılda tutulması gereken bazı sınırlamalar vardır. İlk olarak, embriyonik kök hücrelerden başlayarak, organoidler daha yakından yaşlı beyinlere göre olgunlaşmamış beyinler benzer ve bu nedenle yaşlılıkta meydana gelen hastalıklar için ideal modeller olmayabilir, Alzheimer hastalığı gibi. İkinci olarak, protokolümüz de konserde birden fazla beyin bölgesinden hücreler üzerinde bir tedavi veya hastalığın etkisini incelemek için yararlı olan ön beyin, orta beyin ve arka beyin gelişimi belirteçleri bulundu, diğer protokoller belirli beyin bölgeleri üzerinde konsantre takip edilebilir13,14. Son olarak, organoid modellerin bir diğer sınırlama boyutu, bir insan beyninin ortalama uzunluğu ise yaklaşık 167 mm, ajitasyon kullanımı ile yapılan beyin organoidler kadar büyümek 4 mm8 ve bu protokol tarafından oluşturulan organoidler 10 hafta 1-2 mm büyür. Yine de, bu protokol insan beyin dokusu ve birden fazla hücre tiplerinin etkileşimi incelemek için önemli bir araç sağlar.

Protocol

1. Kök Hücre Bakımı Büyüme faktörü azaltılmış bodrum membran matris bir tabaka üzerinde H9 hESCs korumak (Malzemeler Tablosubakınız , bundan böyle sadece matris olarak anılacaktır) üreticinin talimatlarına göre. Bir 6-iyi plaka veya bir 10 cm çanak kaplamak için, buz gibi Dulbecco’nun modifiye Eagle orta (DMEM)/F12 medya 5,9 mL ile matris 100 μL birleştirir. Plakaları parafin filmine sarın ve gece boyunca 4 °C’de saklayın. Aşırı matris/ortam aspire edildik…

Representative Results

Şekil 1, protokolün farklı aşamalarında hücrelerin/organoidlerin nasıl göründüğünü göstermek için birkaç zaman noktasının temsili parlak alan görüntülerini gösterir. HESC’ler doku kültür plakasından çıkarıldı, küçük parçalara ayrıldı ve küreler oluşturdukları T75 ultra-düşük ek şişesine yerleştirildi. Bu hücrelerin parlak ve benzer boyutlarda, karanlık olmadan, bu kümelerin merkezlerinde ölmekte olan hücreler bakmak dikkat etmek önemlidir. H?…

Discussion

Diğer organoid modellere benzer şekilde, bu çeşitli uyarılar ile birlikte gelen yapay bir sistemdir. Genel ifade düzeyleri açısından toplu olarak çok az parti olmasına rağmen, bireysel organoidler farklılıklar sergiledi. Örneğin, Sox-2 pozitif alanların yeri her organoidde aynı değildi (Şekil 3). QPCR hücre toplu genel değişiklikleri aramak için uygun olsa da, tek hücreli RNAseq gibi ek teknikler hücre bazında daha fazla bilgi toplamak için gelecekteki çalışmalarda kullanı…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Biz Yardım için Yale Kök Hücre Çekirdeği (YSCC) ve Yale Kanser Merkezi (YCC) teşekkür ederiz. Dr. Jung Kim’e nöropatoloji incelemesi için teşekkür ederiz. Bu çalışma Connecticut Rejeneratif Tıp Araştırma Fonu, Dimes Mart ve NHLBI R01HL131793 (S.G.K.), Yale Kanser Merkezi ve Yale Kanser Biyolojisi Eğitim Programı NCI CA193200 (E.B.) ve Joseph cömert bir sınırsız hediye ve tarafından desteklendi ve Lucille Madri.

Materials

Alexa Fluor 488 goat anti-mouse Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, USA A11029
Alexa Fluor 546 goat anti-rabbit Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, USA A11035
B27 Supplement Gibco, Waltham, MA, USA 17504-044
bFGF Life Technologies, Carlsbad, CA, USA PHG0263
BSA Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA A9647
BX43 microscope Olympus, Shinjuku, Tokyo, Japan
DAPI stain Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, USA D1306
Dispase STEMCELL Technologies, Vancouver, Canada 07913
DMEM/F12 Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, USA 11330-032
DPBS Gibco, Waltham, MA, USA 10010023
FluroSave MilliporeSigma, Burlington, MA 345789
GFAP antibody NeuroMab, Davis, CA N206A/8
Growth Factor Reduced Matrigel (Matrix) Corning, Corning, NY, USA 356231
H9 hESCs WiCell, Madison, WI, USA WA09
Heparin Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA 9041-08-1
iQ SYBR Green Supermix Bio-Rad, Hercules, CA, USA 1708880
iScript cDNA Synthesis Kit Bio-Rad, Hercules, CA, USA 1708891
L-glutamine Gibco, Waltham, MA, USA 25030-081
Monothioglycerol Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA M6145
mTESR media STEMCELL Technologies, Vancouver, Canada 85850
N2 NeuroPlex Gemini Bio Products, West Sacramento, CA, USA 400-163
Nanodrop Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, USA ND-2000
NEAA Gibco, Waltham, MA, USA 11140-050
Normal Donkey Serum (NDS) ImmunoResearch Laboratories Inc., West Grove, PA, USA 017-000-121
OCT Sakura Finetek, Torrance, CA, USA 25608-930
PFA Electron Microscopy Sciences, Hatfield, PA RT15710
qPCR machine Bio-Rad, CFX96, Hercules, CA, USA 1855196
RNeasy kit Qiagen, Hilden, Germany 74104
Sox2 MilliporeSigma, Burlington, MA AB5603
TMS-F microscope Nikon, Melville, NY, USA
Triton X-100 Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA T8787-100ML
Ultra-low attachment T75 flasks Corning, Corning, NY, USA 3814

References

  1. Northcutt, R. G. Understanding vertebrate brain evolution. Integrative and Comparative Biology. 42 (4), 743-756 (2002).
  2. Roth, G. . The Long Evolution of Brains and Minds. , (2013).
  3. Herculano-Houzel, S. The human brain in numbers: a linearly scaled-up primate brain. Frontiers in Human Neuroscience. 3, 31 (2009).
  4. Roth, G., Dicke, U. Evolution of the brain and intelligence. Trends in Cognitive Sciences. 9 (5), 250-257 (2005).
  5. Eiraku, M., et al. Self-organized formation of polarized cortical tissues from ESCs and its active manipulation by extrinsic signals. Cell Stem Cell. 3 (5), 519-532 (2008).
  6. Watanabe, K., et al. Directed differentiation of telencephalic precursors from embryonic stem cells. Nature Neuroscience. 8 (3), 288-296 (2005).
  7. Kadoshima, T., et al. Self-organization of axial polarity, inside-out layer pattern, and species-specific progenitor dynamics in human ES cell-derived neocortex. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 110 (50), 20284-20289 (2013).
  8. Lancaster, M. A., et al. Cerebral organoids model human brain development and microcephaly. Nature. 501 (7467), 373-379 (2013).
  9. Li, X. J., et al. Specification of motoneurons from human embryonic stem cells. Nature Biotechnology. 23 (2), 215-221 (2005).
  10. Zhang, S. C., Wernig, M., Duncan, I. D., Brustle, O., Thomson, J. A. In vitro differentiation of transplantable neural precursors from human embryonic stem cells. Nature Biotechnology. 19 (12), 1129-1133 (2001).
  11. Pasca, A. M., et al. Functional cortical neurons and astrocytes from human pluripotent stem cells in 3D culture. Nat Methods. 12 (7), 671-678 (2015).
  12. Hughes, C. S., Postovit, L. M., Lajoie, G. A. Matrigel: a complex protein mixture required for optimal growth of cell culture. Proteomics. 10 (9), 1886-1890 (2010).
  13. Qian, X., et al. Brain-Region-Specific Organoids Using Mini-bioreactors for Modeling ZIKV Exposure. Cell. 165 (5), 1238-1254 (2016).
  14. Sloan, S. A., Andersen, J., Pasca, A. M., Birey, F., Pasca, S. P. Generation and assembly of human brain region-specific three-dimensional cultures. Nature Protocols. 13 (9), 2062-2085 (2018).
  15. Kelava, I., Lancaster, M. A. Stem Cell Models of Human Brain Development. Cell Stem Cell. 18 (6), 736-748 (2016).
  16. Boisvert, E. M., Means, R. E., Michaud, M., Madri, J. A., Katz, S. G. Minocycline mitigates the effect of neonatal hypoxic insult on human brain organoids. Cell Death and Disease. 10 (4), 325 (2019).
  17. Bergmann, S., et al. Blood-brain-barrier organoids for investigating the permeability of CNS therapeutics. Nature Protocols. 13 (12), 2827-2843 (2018).
  18. Mansour, A. A., et al. An in vivo model of functional and vascularized human brain organoids. Nature Biotechnology. 36 (5), 432-441 (2018).
  19. Pham, M. T., et al. Generation of human vascularized brain organoids. Neuroreport. 29 (7), 588-593 (2018).
  20. Boisvert, E. M., Denton, K., Lei, L., Li, X. J. The specification of telencephalic glutamatergic neurons from human pluripotent stem cells. Journal of Visualized Experiments. (74), (2013).

Play Video

Cite This Article
Boisvert, E. M., Means, R. E., Michaud, M., Thomson, J. J., Madri, J. A., Katz, S. G. A Static Self-Directed Method for Generating Brain Organoids from Human Embryonic Stem Cells. J. Vis. Exp. (157), e60379, doi:10.3791/60379 (2020).

View Video