Detta protokoll genererades som ett sätt att producera hjärnan organoider på ett förenklat, lågt kostnadssätt utan exogena tillväxtfaktorer eller källaren membran matris samtidigt som mångfalden av hjärnan celltyper och många funktioner i cellulära organisation.
Mänskliga hjärnorganoider differentierade från embryonala stamceller erbjuder en unik möjlighet att studera komplicerade interaktioner mellan flera celltyper i ett tredimensionellt system. Här presenterar vi en relativt enkel och billig metod som ger hjärnan organoider. I detta protokoll mänskliga pluripotenta stamceller är uppdelade i små kluster i stället för enstaka celler och odlas i grundläggande medier utan en heterolog källare membran matris eller exogena tillväxtfaktorer, så att den inneboende utvecklingssignaler att forma den organoidens tillväxt. Detta enkla system producerar en mångfald av hjärncelltyper inklusive glia- och mikrogliala celler, stamceller och nervceller i framhjärnan, mellanhjärnan och hindbrain. Organoider som genereras från detta protokoll visar också kännetecken för lämplig tids- och rumslig organisation som demonstreras av brightfield bilder, histologi, immunfluorescens och kvantitativa omvänd transkriptionspolymerasreaktion i realtid ( qRT-PCR). Eftersom dessa organoider innehåller celltyper från olika delar av hjärnan, de kan användas för att studera en mängd sjukdomar. Till exempel, i en nyligen papper visade vi användningen av organoider som genereras från detta protokoll för att studera effekterna av hypoxi på den mänskliga hjärnan. Detta tillvägagångssätt kan användas för att undersöka en rad annars svåra att studera tillstånd såsom neurodevelopmental handikapp, genetiska sjukdomar, och neurologiska sjukdomar.
På grund av otaliga praktiska och etiska begränsningar har det varit stora svårigheter att studera den mänskliga hjärnan. Medan studier som använder gnagare har varit avgörande för vår förståelse av den mänskliga hjärnan, har mushjärnan många skillnader1,2. Intressant, möss har en neuronal densitet som är minst 7 gånger mindre än primathjärnan3,4. Även primater är närmare människor än gnagare ur evolutionär synvinkel, är det inte praktiskt för de flesta forskare att arbeta med dem. Syftet med detta protokoll var att sammanfatta många viktiga funktioner i den mänskliga hjärnan med hjälp av en förenklad och billigare metod utan behov av en heterolog källare membran matris eller exogena tillväxtfaktorer samtidigt som hjärnans cell mångfald och cellulära organisation.
Formativt arbete från Sasai labbet använde serumfri kultur av embryoid organ (SFEBq) metod för att generera två- och tredimensionella neuronala celltyper från signaliserade embryonala stamceller (ESCs)5,6. Många mänskliga hjärnan organoid metoder har följt en relativt liknande väg från signaliserade ESCs7,8. Däremot börjar detta protokoll med kluster av fristående mänskliga ESCs (hESCs), liknande de första stegen i nyskapande arbete thomson och Zhang laboratorier före plätering steg9,10 samt det ursprungliga steget i hjärnan organoid protokoll pasca laboratoriet innan tillsats av exogena tillväxtfaktorer11. Källare membran matriser (t.ex. matrigel) har använts i många hjärnan organoid protokoll och det har visat sig vara en effektiv byggnadsställning8. Emellertid, oftast används källare membran matriser kommer inte utan komplikationer eftersom de samrena med okända mängder tillväxtfaktorer med parti till batch variabilitet under produktion12. Dessutom kan dessa matriser komplicera bildbehandling, och öka risken för kontaminering och kostnad.
Medan mänskliga hjärnan organoider kan användas för att svara på många frågor, Det finns vissa begränsningar att tänka på. För en, från embryonala stamceller, organoider mer liknar omogna hjärnor än åldern hjärnor och som sådan kanske inte är idealiska modeller för sjukdomar som uppstår i ålderdomen, som Alzheimers sjukdom. För det andra, medan vårt protokoll hittade markörer för framhjärnan, midbrain och hindbrain utveckling som är användbara för att studera effekten av en behandling eller sjukdom på celler från flera hjärnregioner i samförstånd, andra protokoll kan följas för att koncentrera sig på specifika hjärnregioner13,14. Slutligen, en annan begränsning av organoid modeller är att av storlek, medan den genomsnittliga längden på en mänsklig hjärna ca 167 mm, hjärnan organoider som gjorts med hjälp av agitation växa upp till 4 mm8 och organoider som bildas av detta protokoll växa till 1-2 mm med 10 veckor. Icke desto mindre, detta protokoll ger ett viktigt verktyg för att studera mänskliga hjärnvävnad och samspelet mellan flera celltyper.
Liknar andra organoid modeller, Detta är ett artificiellt system som kommer med flera varningar. Även om det fanns lite parti till batch variation när det gäller övergripande uttrycknivåer, enskilda organoider uppvisade skillnader. Till exempel var placeringen av Sox-2 positiva områden inte identiska i varje organoid(figur 3). Medan qPCR är lämplig att leta efter övergripande förändringar i partier av celler, ytterligare tekniker såsom single cell RNAseq kommer att användas i framtida studi…
The authors have nothing to disclose.
Vi tackar Yale Stem Cell Core (YSCC), och Yale Cancer Center (YCC) för hjälp. Vi tackar dr Jung Kim för hans neuropatologi recension. Detta arbete stöddes av Connecticut Regenerativ Medicine Research Fund, March of Dimes, och NHLBI R01HL131793 (S.G.K.), Yale Cancer Center och Yale Cancer Biology Training Program NCI CA193200 (E.B.) och en generös obegränsad gåva från Joseph och Joseph och en generös obegränsad gåva från Joseph och Joseph och en generös obegränsad gåva från Joseph och Joseph och en generös obegränsad gåva från Joseph och Joseph och en generös obegränsad gåva från Joseph och Joseph och Lucille Madri.
Alexa Fluor 488 goat anti-mouse | Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, USA | A11029 | |
Alexa Fluor 546 goat anti-rabbit | Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, USA | A11035 | |
B27 Supplement | Gibco, Waltham, MA, USA | 17504-044 | |
bFGF | Life Technologies, Carlsbad, CA, USA | PHG0263 | |
BSA | Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA | A9647 | |
BX43 microscope | Olympus, Shinjuku, Tokyo, Japan | ||
DAPI stain | Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, USA | D1306 | |
Dispase | STEMCELL Technologies, Vancouver, Canada | 07913 | |
DMEM/F12 | Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, USA | 11330-032 | |
DPBS | Gibco, Waltham, MA, USA | 10010023 | |
FluroSave | MilliporeSigma, Burlington, MA | 345789 | |
GFAP antibody | NeuroMab, Davis, CA | N206A/8 | |
Growth Factor Reduced Matrigel (Matrix) | Corning, Corning, NY, USA | 356231 | |
H9 hESCs | WiCell, Madison, WI, USA | WA09 | |
Heparin | Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA | 9041-08-1 | |
iQ SYBR Green Supermix | Bio-Rad, Hercules, CA, USA | 1708880 | |
iScript cDNA Synthesis Kit | Bio-Rad, Hercules, CA, USA | 1708891 | |
L-glutamine | Gibco, Waltham, MA, USA | 25030-081 | |
Monothioglycerol | Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA | M6145 | |
mTESR media | STEMCELL Technologies, Vancouver, Canada | 85850 | |
N2 NeuroPlex | Gemini Bio Products, West Sacramento, CA, USA | 400-163 | |
Nanodrop | Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, USA | ND-2000 | |
NEAA | Gibco, Waltham, MA, USA | 11140-050 | |
Normal Donkey Serum (NDS) | ImmunoResearch Laboratories Inc., West Grove, PA, USA | 017-000-121 | |
OCT | Sakura Finetek, Torrance, CA, USA | 25608-930 | |
PFA | Electron Microscopy Sciences, Hatfield, PA | RT15710 | |
qPCR machine | Bio-Rad, CFX96, Hercules, CA, USA | 1855196 | |
RNeasy kit | Qiagen, Hilden, Germany | 74104 | |
Sox2 | MilliporeSigma, Burlington, MA | AB5603 | |
TMS-F microscope | Nikon, Melville, NY, USA | ||
Triton X-100 | Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA | T8787-100ML | |
Ultra-low attachment T75 flasks | Corning, Corning, NY, USA | 3814 |