Summary

En statisk självstyrd metod för att generera hjärnorganoider från mänskliga embryonala stamceller

Published: March 04, 2020
doi:

Summary

Detta protokoll genererades som ett sätt att producera hjärnan organoider på ett förenklat, lågt kostnadssätt utan exogena tillväxtfaktorer eller källaren membran matris samtidigt som mångfalden av hjärnan celltyper och många funktioner i cellulära organisation.

Abstract

Mänskliga hjärnorganoider differentierade från embryonala stamceller erbjuder en unik möjlighet att studera komplicerade interaktioner mellan flera celltyper i ett tredimensionellt system. Här presenterar vi en relativt enkel och billig metod som ger hjärnan organoider. I detta protokoll mänskliga pluripotenta stamceller är uppdelade i små kluster i stället för enstaka celler och odlas i grundläggande medier utan en heterolog källare membran matris eller exogena tillväxtfaktorer, så att den inneboende utvecklingssignaler att forma den organoidens tillväxt. Detta enkla system producerar en mångfald av hjärncelltyper inklusive glia- och mikrogliala celler, stamceller och nervceller i framhjärnan, mellanhjärnan och hindbrain. Organoider som genereras från detta protokoll visar också kännetecken för lämplig tids- och rumslig organisation som demonstreras av brightfield bilder, histologi, immunfluorescens och kvantitativa omvänd transkriptionspolymerasreaktion i realtid ( qRT-PCR). Eftersom dessa organoider innehåller celltyper från olika delar av hjärnan, de kan användas för att studera en mängd sjukdomar. Till exempel, i en nyligen papper visade vi användningen av organoider som genereras från detta protokoll för att studera effekterna av hypoxi på den mänskliga hjärnan. Detta tillvägagångssätt kan användas för att undersöka en rad annars svåra att studera tillstånd såsom neurodevelopmental handikapp, genetiska sjukdomar, och neurologiska sjukdomar.

Introduction

På grund av otaliga praktiska och etiska begränsningar har det varit stora svårigheter att studera den mänskliga hjärnan. Medan studier som använder gnagare har varit avgörande för vår förståelse av den mänskliga hjärnan, har mushjärnan många skillnader1,2. Intressant, möss har en neuronal densitet som är minst 7 gånger mindre än primathjärnan3,4. Även primater är närmare människor än gnagare ur evolutionär synvinkel, är det inte praktiskt för de flesta forskare att arbeta med dem. Syftet med detta protokoll var att sammanfatta många viktiga funktioner i den mänskliga hjärnan med hjälp av en förenklad och billigare metod utan behov av en heterolog källare membran matris eller exogena tillväxtfaktorer samtidigt som hjärnans cell mångfald och cellulära organisation.

Formativt arbete från Sasai labbet använde serumfri kultur av embryoid organ (SFEBq) metod för att generera två- och tredimensionella neuronala celltyper från signaliserade embryonala stamceller (ESCs)5,6. Många mänskliga hjärnan organoid metoder har följt en relativt liknande väg från signaliserade ESCs7,8. Däremot börjar detta protokoll med kluster av fristående mänskliga ESCs (hESCs), liknande de första stegen i nyskapande arbete thomson och Zhang laboratorier före plätering steg9,10 samt det ursprungliga steget i hjärnan organoid protokoll pasca laboratoriet innan tillsats av exogena tillväxtfaktorer11. Källare membran matriser (t.ex. matrigel) har använts i många hjärnan organoid protokoll och det har visat sig vara en effektiv byggnadsställning8. Emellertid, oftast används källare membran matriser kommer inte utan komplikationer eftersom de samrena med okända mängder tillväxtfaktorer med parti till batch variabilitet under produktion12. Dessutom kan dessa matriser komplicera bildbehandling, och öka risken för kontaminering och kostnad.

Medan mänskliga hjärnan organoider kan användas för att svara på många frågor, Det finns vissa begränsningar att tänka på. För en, från embryonala stamceller, organoider mer liknar omogna hjärnor än åldern hjärnor och som sådan kanske inte är idealiska modeller för sjukdomar som uppstår i ålderdomen, som Alzheimers sjukdom. För det andra, medan vårt protokoll hittade markörer för framhjärnan, midbrain och hindbrain utveckling som är användbara för att studera effekten av en behandling eller sjukdom på celler från flera hjärnregioner i samförstånd, andra protokoll kan följas för att koncentrera sig på specifika hjärnregioner13,14. Slutligen, en annan begränsning av organoid modeller är att av storlek, medan den genomsnittliga längden på en mänsklig hjärna ca 167 mm, hjärnan organoider som gjorts med hjälp av agitation växa upp till 4 mm8 och organoider som bildas av detta protokoll växa till 1-2 mm med 10 veckor. Icke desto mindre, detta protokoll ger ett viktigt verktyg för att studera mänskliga hjärnvävnad och samspelet mellan flera celltyper.

Protocol

1. Stamcellsunderhåll Underhåll H9 hESCs på ett lager av tillväxtfaktor minskad källare membran matris (se tabellen över material,hädanefter helt enkelt kallad matris) enligt tillverkarens instruktioner. För att belägga en 6-brunn tallrik eller en 10 cm maträtt, kombinera 100 μL matris med 5,9 ml iskall Dulbecco modifierade Eagle medium (DMEM) / F12 media. Wrap plattor i paraffin film och lagra över natten vid 4 ° C. Använd dem nästa dag för passaging celler efter övers…

Representative Results

Bild 1 visar representativa brightfield bilder av flera tidpunkter för att visa hur cellerna / organoider ser ut i hela de olika stadierna av protokollet. HESCs avlägsnades från vävnadsodlingsplattan, bröts i små bitar och placerades i en T75 ultralåg fastsättningskolv där de bildade sfärer. Det är viktigt att notera att cellerna ser ljusa och liknande i storlek, utan mörka, döende celler i mitten av dessa kluster. Cellerna avvejkades gradvis av bFGF. På dag 5 placerades de i n…

Discussion

Liknar andra organoid modeller, Detta är ett artificiellt system som kommer med flera varningar. Även om det fanns lite parti till batch variation när det gäller övergripande uttrycknivåer, enskilda organoider uppvisade skillnader. Till exempel var placeringen av Sox-2 positiva områden inte identiska i varje organoid(figur 3). Medan qPCR är lämplig att leta efter övergripande förändringar i partier av celler, ytterligare tekniker såsom single cell RNAseq kommer att användas i framtida studi…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Vi tackar Yale Stem Cell Core (YSCC), och Yale Cancer Center (YCC) för hjälp. Vi tackar dr Jung Kim för hans neuropatologi recension. Detta arbete stöddes av Connecticut Regenerativ Medicine Research Fund, March of Dimes, och NHLBI R01HL131793 (S.G.K.), Yale Cancer Center och Yale Cancer Biology Training Program NCI CA193200 (E.B.) och en generös obegränsad gåva från Joseph och Joseph och en generös obegränsad gåva från Joseph och Joseph och en generös obegränsad gåva från Joseph och Joseph och en generös obegränsad gåva från Joseph och Joseph och en generös obegränsad gåva från Joseph och Joseph och Lucille Madri.

Materials

Alexa Fluor 488 goat anti-mouse Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, USA A11029
Alexa Fluor 546 goat anti-rabbit Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, USA A11035
B27 Supplement Gibco, Waltham, MA, USA 17504-044
bFGF Life Technologies, Carlsbad, CA, USA PHG0263
BSA Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA A9647
BX43 microscope Olympus, Shinjuku, Tokyo, Japan
DAPI stain Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, USA D1306
Dispase STEMCELL Technologies, Vancouver, Canada 07913
DMEM/F12 Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, USA 11330-032
DPBS Gibco, Waltham, MA, USA 10010023
FluroSave MilliporeSigma, Burlington, MA 345789
GFAP antibody NeuroMab, Davis, CA N206A/8
Growth Factor Reduced Matrigel (Matrix) Corning, Corning, NY, USA 356231
H9 hESCs WiCell, Madison, WI, USA WA09
Heparin Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA 9041-08-1
iQ SYBR Green Supermix Bio-Rad, Hercules, CA, USA 1708880
iScript cDNA Synthesis Kit Bio-Rad, Hercules, CA, USA 1708891
L-glutamine Gibco, Waltham, MA, USA 25030-081
Monothioglycerol Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA M6145
mTESR media STEMCELL Technologies, Vancouver, Canada 85850
N2 NeuroPlex Gemini Bio Products, West Sacramento, CA, USA 400-163
Nanodrop Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, USA ND-2000
NEAA Gibco, Waltham, MA, USA 11140-050
Normal Donkey Serum (NDS) ImmunoResearch Laboratories Inc., West Grove, PA, USA 017-000-121
OCT Sakura Finetek, Torrance, CA, USA 25608-930
PFA Electron Microscopy Sciences, Hatfield, PA RT15710
qPCR machine Bio-Rad, CFX96, Hercules, CA, USA 1855196
RNeasy kit Qiagen, Hilden, Germany 74104
Sox2 MilliporeSigma, Burlington, MA AB5603
TMS-F microscope Nikon, Melville, NY, USA
Triton X-100 Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA T8787-100ML
Ultra-low attachment T75 flasks Corning, Corning, NY, USA 3814

References

  1. Northcutt, R. G. Understanding vertebrate brain evolution. Integrative and Comparative Biology. 42 (4), 743-756 (2002).
  2. Roth, G. . The Long Evolution of Brains and Minds. , (2013).
  3. Herculano-Houzel, S. The human brain in numbers: a linearly scaled-up primate brain. Frontiers in Human Neuroscience. 3, 31 (2009).
  4. Roth, G., Dicke, U. Evolution of the brain and intelligence. Trends in Cognitive Sciences. 9 (5), 250-257 (2005).
  5. Eiraku, M., et al. Self-organized formation of polarized cortical tissues from ESCs and its active manipulation by extrinsic signals. Cell Stem Cell. 3 (5), 519-532 (2008).
  6. Watanabe, K., et al. Directed differentiation of telencephalic precursors from embryonic stem cells. Nature Neuroscience. 8 (3), 288-296 (2005).
  7. Kadoshima, T., et al. Self-organization of axial polarity, inside-out layer pattern, and species-specific progenitor dynamics in human ES cell-derived neocortex. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 110 (50), 20284-20289 (2013).
  8. Lancaster, M. A., et al. Cerebral organoids model human brain development and microcephaly. Nature. 501 (7467), 373-379 (2013).
  9. Li, X. J., et al. Specification of motoneurons from human embryonic stem cells. Nature Biotechnology. 23 (2), 215-221 (2005).
  10. Zhang, S. C., Wernig, M., Duncan, I. D., Brustle, O., Thomson, J. A. In vitro differentiation of transplantable neural precursors from human embryonic stem cells. Nature Biotechnology. 19 (12), 1129-1133 (2001).
  11. Pasca, A. M., et al. Functional cortical neurons and astrocytes from human pluripotent stem cells in 3D culture. Nat Methods. 12 (7), 671-678 (2015).
  12. Hughes, C. S., Postovit, L. M., Lajoie, G. A. Matrigel: a complex protein mixture required for optimal growth of cell culture. Proteomics. 10 (9), 1886-1890 (2010).
  13. Qian, X., et al. Brain-Region-Specific Organoids Using Mini-bioreactors for Modeling ZIKV Exposure. Cell. 165 (5), 1238-1254 (2016).
  14. Sloan, S. A., Andersen, J., Pasca, A. M., Birey, F., Pasca, S. P. Generation and assembly of human brain region-specific three-dimensional cultures. Nature Protocols. 13 (9), 2062-2085 (2018).
  15. Kelava, I., Lancaster, M. A. Stem Cell Models of Human Brain Development. Cell Stem Cell. 18 (6), 736-748 (2016).
  16. Boisvert, E. M., Means, R. E., Michaud, M., Madri, J. A., Katz, S. G. Minocycline mitigates the effect of neonatal hypoxic insult on human brain organoids. Cell Death and Disease. 10 (4), 325 (2019).
  17. Bergmann, S., et al. Blood-brain-barrier organoids for investigating the permeability of CNS therapeutics. Nature Protocols. 13 (12), 2827-2843 (2018).
  18. Mansour, A. A., et al. An in vivo model of functional and vascularized human brain organoids. Nature Biotechnology. 36 (5), 432-441 (2018).
  19. Pham, M. T., et al. Generation of human vascularized brain organoids. Neuroreport. 29 (7), 588-593 (2018).
  20. Boisvert, E. M., Denton, K., Lei, L., Li, X. J. The specification of telencephalic glutamatergic neurons from human pluripotent stem cells. Journal of Visualized Experiments. (74), (2013).

Play Video

Cite This Article
Boisvert, E. M., Means, R. E., Michaud, M., Thomson, J. J., Madri, J. A., Katz, S. G. A Static Self-Directed Method for Generating Brain Organoids from Human Embryonic Stem Cells. J. Vis. Exp. (157), e60379, doi:10.3791/60379 (2020).

View Video