Denne protokol blev genereret som et middel til at producere hjernen organoids i en forenklet, lav pris måde uden udefrakommende vækstfaktorer eller kælder membran matrix og samtidig opretholde mangfoldigheden af hjernecelletyper og mange funktioner i cellulære organisation.
Menneskelige hjerne organoider differentieret fra embryonale stamceller giver en enestående mulighed for at studere komplicerede interaktioner af flere celletyper i et tredimensionelt system. Her præsenterer vi en relativt ligetil og billig metode, der giver hjernen organoids. I denne protokol nedbrydes humane pluripotente stamceller i små klynger i stedet for enkelte celler og dyrkes i grundlæggende medier uden en heterolog kældermembranmatrix eller udefrakommende vækstfaktorer, hvilket gør det muligt for de iboende udviklingssignaler at forme organoid vækst. Dette enkle system producerer en mangfoldighed af hjernecelletyper, herunder glia- og mikroglielle celler, stamceller og neuroner i forhjernen, midthjernen og baghjernen. Organoider genereret fra denne protokol viser også kendetegnende for passende tidsmæssige og rumlige organisation demonstreret af brightfield billeder, histologi, immunfluorescens og real-time kvantitative omvendt transskription polymerase kædereaktion ( qRT-PCR). Fordi disse organoids indeholder celletyper fra forskellige dele af hjernen, kan de udnyttes til at studere et væld af sygdomme. For eksempel, i et nyligt papir, vi viste brugen af organoider genereret fra denne protokol til at studere virkningerne af hypoxi på den menneskelige hjerne. Denne tilgang kan bruges til at undersøge en række ellers vanskelige at studere tilstande som neurodevelopmental handicap, genetiske sygdomme, og neurologiske sygdomme.
På grund af utallige praktiske og etiske begrænsninger har der været store problemer med at studere den menneskelige hjerne. Mens undersøgelser udnytte gnavere har været afgørende for vores forståelse af den menneskelige hjerne, musen hjernen har mange forskelle1,2. Interessant, mus har en neuronal tæthed, der er mindst 7 gange mindre end primat hjernen3,4. Selv om primater er tættere på mennesker end gnavere fra et evolutionært synspunkt, er det ikke praktisk for de fleste forskere at arbejde med dem. Formålet med denne protokol var at opsummere mange vigtige træk ved den menneskelige hjerne ved hjælp af en forenklet og billigere metode uden behov for en heterolog kælder membran matrix eller udefrakommende vækstfaktorer og samtidig opretholde hjernecelle mangfoldighed og cellulære organisation.
Formative arbejde fra Sasai lab brugt serum fri kultur embryoid organer (SFEBq) metode til at generere to- og tre-dimensionelle neuronal celletyper fra signalerede embryonale stamceller (EFC)5,6. Mange menneskelige hjerne organoid metoder har fulgt en forholdsvis lignende vej fra signalerede ECs7,8. I modsætning hertil starter denne protokol med klynger af fritliggende menneskelige EPC’er (HC’er), svarende til de første trin i skelsættende arbejde i Thomson og Zhang laboratorier forud for plating trin9,10 samt det første skridt i hjernen organoid protokol pasca laboratorium før tilsætning af udefrakommende vækstfaktorer11. Kælder membran matricer (f.eks matrigel) er blevet udnyttet i mange hjernen organoid protokoller, og det har vist sig at være en effektiv stillads8. Men, mest almindeligt anvendte kælder membran matricer ikke kommer uden komplikationer, da de co-rense med ukendte mængder af vækstfaktorer med parti til batch variation under produktionen12. Desuden kan disse matricer komplicere billeddannelse, og øge risikoen for forurening og omkostninger.
Mens menneskelige hjerne organoids kan bruges til at besvare mange spørgsmål, der er visse begrænsninger at huske på. For det første, startende fra embryonale stamceller, organoider mere ligner umodne hjerner end alderen hjerner og som sådan kan ikke være ideelle modeller for sygdomme, der opstår i alderdommen, ligesom Alzheimers sygdom. For det andet, mens vores protokol fundet markører for forhjernen, midthjernen og hindbrain udvikling, som er nyttige til at studere effekten af en behandling eller sygdom på celler fra flere hjerne regioner i koncert, andre protokoller kan følges for at koncentrere sig om specifikke hjerne regioner13,14. Endelig, en anden begrænsning af organoid modeller er, at størrelse, mens den gennemsnitlige længde af en menneskelig hjerne ca 167 mm, hjernen organoids lavet ved brug af agitation vokse op til 4 mm8 og organoider dannet af denne protokol vokse til 1-2 mm ved 10 uger. Ikke desto mindre, denne protokol giver et vigtigt værktøj til at studere menneskelige hjernevæv og samspillet mellem flere celletyper.
Svarende til andre organoid modeller, dette er et kunstigt system, der kommer med flere forbehold. Selv om der var lidt batch til batch variation i form af generelle udtrykniveauer, individuelle organoider viste forskelle. F.eks. var placeringen af Sox-2-positive områder ikke identisk i alle organoider (figur 3). Mens qPCR er egnet til at lede efter generelle ændringer i partier af celler, yderligere teknikker såsom enkelt celle RNAseq vil blive udnyttet i fremtidige undersøgelser til at indsamle fle…
The authors have nothing to disclose.
Vi takker Yale Stem Cell Core (YSCC), og Yale Cancer Center (YCC) for hjælp. Vi takker Dr. Jung Kim for hans neuropatologi anmeldelse. Dette arbejde blev støttet af Connecticut Regenerative Medicine Research Fund, marts Dimes, og NHLBI R01HL131793 (S.G.K.), Yale Cancer Center og Yale Cancer Biology Training Program NCI CA193200 (E.B.) og en generøs ubegrænset gave fra Joseph og Lucille Madri.
Alexa Fluor 488 goat anti-mouse | Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, USA | A11029 | |
Alexa Fluor 546 goat anti-rabbit | Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, USA | A11035 | |
B27 Supplement | Gibco, Waltham, MA, USA | 17504-044 | |
bFGF | Life Technologies, Carlsbad, CA, USA | PHG0263 | |
BSA | Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA | A9647 | |
BX43 microscope | Olympus, Shinjuku, Tokyo, Japan | ||
DAPI stain | Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, USA | D1306 | |
Dispase | STEMCELL Technologies, Vancouver, Canada | 07913 | |
DMEM/F12 | Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, USA | 11330-032 | |
DPBS | Gibco, Waltham, MA, USA | 10010023 | |
FluroSave | MilliporeSigma, Burlington, MA | 345789 | |
GFAP antibody | NeuroMab, Davis, CA | N206A/8 | |
Growth Factor Reduced Matrigel (Matrix) | Corning, Corning, NY, USA | 356231 | |
H9 hESCs | WiCell, Madison, WI, USA | WA09 | |
Heparin | Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA | 9041-08-1 | |
iQ SYBR Green Supermix | Bio-Rad, Hercules, CA, USA | 1708880 | |
iScript cDNA Synthesis Kit | Bio-Rad, Hercules, CA, USA | 1708891 | |
L-glutamine | Gibco, Waltham, MA, USA | 25030-081 | |
Monothioglycerol | Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA | M6145 | |
mTESR media | STEMCELL Technologies, Vancouver, Canada | 85850 | |
N2 NeuroPlex | Gemini Bio Products, West Sacramento, CA, USA | 400-163 | |
Nanodrop | Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, USA | ND-2000 | |
NEAA | Gibco, Waltham, MA, USA | 11140-050 | |
Normal Donkey Serum (NDS) | ImmunoResearch Laboratories Inc., West Grove, PA, USA | 017-000-121 | |
OCT | Sakura Finetek, Torrance, CA, USA | 25608-930 | |
PFA | Electron Microscopy Sciences, Hatfield, PA | RT15710 | |
qPCR machine | Bio-Rad, CFX96, Hercules, CA, USA | 1855196 | |
RNeasy kit | Qiagen, Hilden, Germany | 74104 | |
Sox2 | MilliporeSigma, Burlington, MA | AB5603 | |
TMS-F microscope | Nikon, Melville, NY, USA | ||
Triton X-100 | Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA | T8787-100ML | |
Ultra-low attachment T75 flasks | Corning, Corning, NY, USA | 3814 |