Summary

En statisk selvstyret metode til generering af hjerneorganoider fra menneskelige embryonale stamceller

Published: March 04, 2020
doi:

Summary

Denne protokol blev genereret som et middel til at producere hjernen organoids i en forenklet, lav pris måde uden udefrakommende vækstfaktorer eller kælder membran matrix og samtidig opretholde mangfoldigheden af hjernecelletyper og mange funktioner i cellulære organisation.

Abstract

Menneskelige hjerne organoider differentieret fra embryonale stamceller giver en enestående mulighed for at studere komplicerede interaktioner af flere celletyper i et tredimensionelt system. Her præsenterer vi en relativt ligetil og billig metode, der giver hjernen organoids. I denne protokol nedbrydes humane pluripotente stamceller i små klynger i stedet for enkelte celler og dyrkes i grundlæggende medier uden en heterolog kældermembranmatrix eller udefrakommende vækstfaktorer, hvilket gør det muligt for de iboende udviklingssignaler at forme organoid vækst. Dette enkle system producerer en mangfoldighed af hjernecelletyper, herunder glia- og mikroglielle celler, stamceller og neuroner i forhjernen, midthjernen og baghjernen. Organoider genereret fra denne protokol viser også kendetegnende for passende tidsmæssige og rumlige organisation demonstreret af brightfield billeder, histologi, immunfluorescens og real-time kvantitative omvendt transskription polymerase kædereaktion ( qRT-PCR). Fordi disse organoids indeholder celletyper fra forskellige dele af hjernen, kan de udnyttes til at studere et væld af sygdomme. For eksempel, i et nyligt papir, vi viste brugen af organoider genereret fra denne protokol til at studere virkningerne af hypoxi på den menneskelige hjerne. Denne tilgang kan bruges til at undersøge en række ellers vanskelige at studere tilstande som neurodevelopmental handicap, genetiske sygdomme, og neurologiske sygdomme.

Introduction

På grund af utallige praktiske og etiske begrænsninger har der været store problemer med at studere den menneskelige hjerne. Mens undersøgelser udnytte gnavere har været afgørende for vores forståelse af den menneskelige hjerne, musen hjernen har mange forskelle1,2. Interessant, mus har en neuronal tæthed, der er mindst 7 gange mindre end primat hjernen3,4. Selv om primater er tættere på mennesker end gnavere fra et evolutionært synspunkt, er det ikke praktisk for de fleste forskere at arbejde med dem. Formålet med denne protokol var at opsummere mange vigtige træk ved den menneskelige hjerne ved hjælp af en forenklet og billigere metode uden behov for en heterolog kælder membran matrix eller udefrakommende vækstfaktorer og samtidig opretholde hjernecelle mangfoldighed og cellulære organisation.

Formative arbejde fra Sasai lab brugt serum fri kultur embryoid organer (SFEBq) metode til at generere to- og tre-dimensionelle neuronal celletyper fra signalerede embryonale stamceller (EFC)5,6. Mange menneskelige hjerne organoid metoder har fulgt en forholdsvis lignende vej fra signalerede ECs7,8. I modsætning hertil starter denne protokol med klynger af fritliggende menneskelige EPC’er (HC’er), svarende til de første trin i skelsættende arbejde i Thomson og Zhang laboratorier forud for plating trin9,10 samt det første skridt i hjernen organoid protokol pasca laboratorium før tilsætning af udefrakommende vækstfaktorer11. Kælder membran matricer (f.eks matrigel) er blevet udnyttet i mange hjernen organoid protokoller, og det har vist sig at være en effektiv stillads8. Men, mest almindeligt anvendte kælder membran matricer ikke kommer uden komplikationer, da de co-rense med ukendte mængder af vækstfaktorer med parti til batch variation under produktionen12. Desuden kan disse matricer komplicere billeddannelse, og øge risikoen for forurening og omkostninger.

Mens menneskelige hjerne organoids kan bruges til at besvare mange spørgsmål, der er visse begrænsninger at huske på. For det første, startende fra embryonale stamceller, organoider mere ligner umodne hjerner end alderen hjerner og som sådan kan ikke være ideelle modeller for sygdomme, der opstår i alderdommen, ligesom Alzheimers sygdom. For det andet, mens vores protokol fundet markører for forhjernen, midthjernen og hindbrain udvikling, som er nyttige til at studere effekten af en behandling eller sygdom på celler fra flere hjerne regioner i koncert, andre protokoller kan følges for at koncentrere sig om specifikke hjerne regioner13,14. Endelig, en anden begrænsning af organoid modeller er, at størrelse, mens den gennemsnitlige længde af en menneskelig hjerne ca 167 mm, hjernen organoids lavet ved brug af agitation vokse op til 4 mm8 og organoider dannet af denne protokol vokse til 1-2 mm ved 10 uger. Ikke desto mindre, denne protokol giver et vigtigt værktøj til at studere menneskelige hjernevæv og samspillet mellem flere celletyper.

Protocol

1. Vedligeholdelse af stamceller Vedligehold H9 HCESCs på et lag af vækstfaktor reduceret kælder membran matrix (se Tabellen over materialer, fremover blot benævnt matrix) i henhold til producentens anvisninger. For at belægge en 6-brønds plade eller en 10 cm fad, kombinere 100 μL matrix med 5,9 ml iskold Dulbecco’s modificerede Eagle medium (DMEM) /F12 medier. Wrap plader i paraffin film og opbevares natten over ved 4 °C. Brug dem næste dag til passaging celler efter den overs…

Representative Results

Figur 1 viser repræsentative brightfield billeder af flere tidspunkter for at demonstrere, hvordan cellerne / organoider ser ud i de forskellige faser af protokollen. Hcipc’erne blev fjernet fra vævskulturpladen, opdelt i små stykker og placeret i en T75 ultralav fastgørelseskolbe, hvor de dannede kugler. Det er vigtigt at bemærke, at cellerne ser lyse og lignende i størrelse, uden mørke, døende celler i midten af disse klynger. Cellerne blev gradvist vænnet fra bFGF. På dag 5 blev…

Discussion

Svarende til andre organoid modeller, dette er et kunstigt system, der kommer med flere forbehold. Selv om der var lidt batch til batch variation i form af generelle udtrykniveauer, individuelle organoider viste forskelle. F.eks. var placeringen af Sox-2-positive områder ikke identisk i alle organoider (figur 3). Mens qPCR er egnet til at lede efter generelle ændringer i partier af celler, yderligere teknikker såsom enkelt celle RNAseq vil blive udnyttet i fremtidige undersøgelser til at indsamle fle…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Vi takker Yale Stem Cell Core (YSCC), og Yale Cancer Center (YCC) for hjælp. Vi takker Dr. Jung Kim for hans neuropatologi anmeldelse. Dette arbejde blev støttet af Connecticut Regenerative Medicine Research Fund, marts Dimes, og NHLBI R01HL131793 (S.G.K.), Yale Cancer Center og Yale Cancer Biology Training Program NCI CA193200 (E.B.) og en generøs ubegrænset gave fra Joseph og Lucille Madri.

Materials

Alexa Fluor 488 goat anti-mouse Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, USA A11029
Alexa Fluor 546 goat anti-rabbit Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, USA A11035
B27 Supplement Gibco, Waltham, MA, USA 17504-044
bFGF Life Technologies, Carlsbad, CA, USA PHG0263
BSA Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA A9647
BX43 microscope Olympus, Shinjuku, Tokyo, Japan
DAPI stain Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, USA D1306
Dispase STEMCELL Technologies, Vancouver, Canada 07913
DMEM/F12 Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, USA 11330-032
DPBS Gibco, Waltham, MA, USA 10010023
FluroSave MilliporeSigma, Burlington, MA 345789
GFAP antibody NeuroMab, Davis, CA N206A/8
Growth Factor Reduced Matrigel (Matrix) Corning, Corning, NY, USA 356231
H9 hESCs WiCell, Madison, WI, USA WA09
Heparin Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA 9041-08-1
iQ SYBR Green Supermix Bio-Rad, Hercules, CA, USA 1708880
iScript cDNA Synthesis Kit Bio-Rad, Hercules, CA, USA 1708891
L-glutamine Gibco, Waltham, MA, USA 25030-081
Monothioglycerol Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA M6145
mTESR media STEMCELL Technologies, Vancouver, Canada 85850
N2 NeuroPlex Gemini Bio Products, West Sacramento, CA, USA 400-163
Nanodrop Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, USA ND-2000
NEAA Gibco, Waltham, MA, USA 11140-050
Normal Donkey Serum (NDS) ImmunoResearch Laboratories Inc., West Grove, PA, USA 017-000-121
OCT Sakura Finetek, Torrance, CA, USA 25608-930
PFA Electron Microscopy Sciences, Hatfield, PA RT15710
qPCR machine Bio-Rad, CFX96, Hercules, CA, USA 1855196
RNeasy kit Qiagen, Hilden, Germany 74104
Sox2 MilliporeSigma, Burlington, MA AB5603
TMS-F microscope Nikon, Melville, NY, USA
Triton X-100 Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA T8787-100ML
Ultra-low attachment T75 flasks Corning, Corning, NY, USA 3814

References

  1. Northcutt, R. G. Understanding vertebrate brain evolution. Integrative and Comparative Biology. 42 (4), 743-756 (2002).
  2. Roth, G. . The Long Evolution of Brains and Minds. , (2013).
  3. Herculano-Houzel, S. The human brain in numbers: a linearly scaled-up primate brain. Frontiers in Human Neuroscience. 3, 31 (2009).
  4. Roth, G., Dicke, U. Evolution of the brain and intelligence. Trends in Cognitive Sciences. 9 (5), 250-257 (2005).
  5. Eiraku, M., et al. Self-organized formation of polarized cortical tissues from ESCs and its active manipulation by extrinsic signals. Cell Stem Cell. 3 (5), 519-532 (2008).
  6. Watanabe, K., et al. Directed differentiation of telencephalic precursors from embryonic stem cells. Nature Neuroscience. 8 (3), 288-296 (2005).
  7. Kadoshima, T., et al. Self-organization of axial polarity, inside-out layer pattern, and species-specific progenitor dynamics in human ES cell-derived neocortex. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 110 (50), 20284-20289 (2013).
  8. Lancaster, M. A., et al. Cerebral organoids model human brain development and microcephaly. Nature. 501 (7467), 373-379 (2013).
  9. Li, X. J., et al. Specification of motoneurons from human embryonic stem cells. Nature Biotechnology. 23 (2), 215-221 (2005).
  10. Zhang, S. C., Wernig, M., Duncan, I. D., Brustle, O., Thomson, J. A. In vitro differentiation of transplantable neural precursors from human embryonic stem cells. Nature Biotechnology. 19 (12), 1129-1133 (2001).
  11. Pasca, A. M., et al. Functional cortical neurons and astrocytes from human pluripotent stem cells in 3D culture. Nat Methods. 12 (7), 671-678 (2015).
  12. Hughes, C. S., Postovit, L. M., Lajoie, G. A. Matrigel: a complex protein mixture required for optimal growth of cell culture. Proteomics. 10 (9), 1886-1890 (2010).
  13. Qian, X., et al. Brain-Region-Specific Organoids Using Mini-bioreactors for Modeling ZIKV Exposure. Cell. 165 (5), 1238-1254 (2016).
  14. Sloan, S. A., Andersen, J., Pasca, A. M., Birey, F., Pasca, S. P. Generation and assembly of human brain region-specific three-dimensional cultures. Nature Protocols. 13 (9), 2062-2085 (2018).
  15. Kelava, I., Lancaster, M. A. Stem Cell Models of Human Brain Development. Cell Stem Cell. 18 (6), 736-748 (2016).
  16. Boisvert, E. M., Means, R. E., Michaud, M., Madri, J. A., Katz, S. G. Minocycline mitigates the effect of neonatal hypoxic insult on human brain organoids. Cell Death and Disease. 10 (4), 325 (2019).
  17. Bergmann, S., et al. Blood-brain-barrier organoids for investigating the permeability of CNS therapeutics. Nature Protocols. 13 (12), 2827-2843 (2018).
  18. Mansour, A. A., et al. An in vivo model of functional and vascularized human brain organoids. Nature Biotechnology. 36 (5), 432-441 (2018).
  19. Pham, M. T., et al. Generation of human vascularized brain organoids. Neuroreport. 29 (7), 588-593 (2018).
  20. Boisvert, E. M., Denton, K., Lei, L., Li, X. J. The specification of telencephalic glutamatergic neurons from human pluripotent stem cells. Journal of Visualized Experiments. (74), (2013).

Play Video

Cite This Article
Boisvert, E. M., Means, R. E., Michaud, M., Thomson, J. J., Madri, J. A., Katz, S. G. A Static Self-Directed Method for Generating Brain Organoids from Human Embryonic Stem Cells. J. Vis. Exp. (157), e60379, doi:10.3791/60379 (2020).

View Video