En statisk selvstyret metode til generering af hjerneorganoider fra menneskelige embryonale stamceller

Summary

Denne protokol blev genereret som et middel til at producere hjernen organoids i en forenklet, lav pris måde uden udefrakommende vækstfaktorer eller kælder membran matrix og samtidig opretholde mangfoldigheden af hjernecelletyper og mange funktioner i cellulære organisation.

Abstract

Menneskelige hjerne organoider differentieret fra embryonale stamceller giver en enestående mulighed for at studere komplicerede interaktioner af flere celletyper i et tredimensionelt system. Her præsenterer vi en relativt ligetil og billig metode, der giver hjernen organoids. I denne protokol nedbrydes humane pluripotente stamceller i små klynger i stedet for enkelte celler og dyrkes i grundlæggende medier uden en heterolog kældermembranmatrix eller udefrakommende vækstfaktorer, hvilket gør det muligt for de iboende udviklingssignaler at forme organoid vækst. Dette enkle system producerer en mangfoldighed af hjernecelletyper, herunder glia- og mikroglielle celler, stamceller og neuroner i forhjernen, midthjernen og baghjernen. Organoider genereret fra denne protokol viser også kendetegnende for passende tidsmæssige og rumlige organisation demonstreret af brightfield billeder, histologi, immunfluorescens og real-time kvantitative omvendt transskription polymerase kædereaktion ( qRT-PCR). Fordi disse organoids indeholder celletyper fra forskellige dele af hjernen, kan de udnyttes til at studere et væld af sygdomme. For eksempel, i et nyligt papir, vi viste brugen af organoider genereret fra denne protokol til at studere virkningerne af hypoxi på den menneskelige hjerne. Denne tilgang kan bruges til at undersøge en række ellers vanskelige at studere tilstande som neurodevelopmental handicap, genetiske sygdomme, og neurologiske sygdomme.

Introduction

På grund af utallige praktiske og etiske begrænsninger har der været store problemer med at studere den menneskelige hjerne. Mens undersøgelser udnytte gnavere har været afgørende for vores forståelse af den menneskelige hjerne, musen hjernen har mange forskelle^1,2. Interessant, mus har en neuronal tæthed, der er mindst 7 gange mindre end primat hjernen^3,4. Selv om primater er tættere på mennesker end gnavere fra et evolutionært synspunkt, er det ikke praktisk for de fleste forskere at arbejde med dem. Formålet med denne protokol var at opsummere mange vigtige træk ved den menneskelige hjerne ved hjælp af en forenklet og billigere metode uden behov for en heterolog kælder membran matrix eller udefrakommende vækstfaktorer og samtidig opretholde hjernecelle mangfoldighed og cellulære organisation.

Formative arbejde fra Sasai lab brugt serum fri kultur embryoid organer (SFEBq) metode til at generere to- og tre-dimensionelle neuronal celletyper fra signalerede embryonale stamceller (EFC)^5,6. Mange menneskelige hjerne organoid metoder har fulgt en forholdsvis lignende vej fra signalerede ECs^7,8. I modsætning hertil starter denne protokol med klynger af fritliggende menneskelige EPC’er (HC’er), svarende til de første trin i skelsættende arbejde i Thomson og Zhang laboratorier forud for plating trin^9,10 samt det første skridt i hjernen organoid protokol pasca laboratorium før tilsætning af udefrakommende vækstfaktorer¹¹. Kælder membran matricer (f.eks matrigel) er blevet udnyttet i mange hjernen organoid protokoller, og det har vist sig at være en effektiv stillads⁸. Men, mest almindeligt anvendte kælder membran matricer ikke kommer uden komplikationer, da de co-rense med ukendte mængder af vækstfaktorer med parti til batch variation under produktionen¹². Desuden kan disse matricer komplicere billeddannelse, og øge risikoen for forurening og omkostninger.

Mens menneskelige hjerne organoids kan bruges til at besvare mange spørgsmål, der er visse begrænsninger at huske på. For det første, startende fra embryonale stamceller, organoider mere ligner umodne hjerner end alderen hjerner og som sådan kan ikke være ideelle modeller for sygdomme, der opstår i alderdommen, ligesom Alzheimers sygdom. For det andet, mens vores protokol fundet markører for forhjernen, midthjernen og hindbrain udvikling, som er nyttige til at studere effekten af en behandling eller sygdom på celler fra flere hjerne regioner i koncert, andre protokoller kan følges for at koncentrere sig om specifikke hjerne regioner^13,14. Endelig, en anden begrænsning af organoid modeller er, at størrelse, mens den gennemsnitlige længde af en menneskelig hjerne ca 167 mm, hjernen organoids lavet ved brug af agitation vokse op til 4 mm⁸ og organoider dannet af denne protokol vokse til 1-2 mm ved 10 uger. Ikke desto mindre, denne protokol giver et vigtigt værktøj til at studere menneskelige hjernevæv og samspillet mellem flere celletyper.

Protocol

1. Vedligeholdelse af stamceller Vedligehold H9 HCESCs på et lag af vækstfaktor reduceret kælder membran matrix (se Tabellen over materialer, fremover blot benævnt matrix) i henhold til producentens anvisninger. For at belægge en 6-brønds plade eller en 10 cm fad, kombinere 100 μL matrix med 5,9 ml iskold Dulbecco’s modificerede Eagle medium (DMEM) /F12 medier. Wrap plader i paraffin film og opbevares natten over ved 4 °C. Brug dem næste dag til passaging celler efter den overs…

Representative Results

Figur 1 viser repræsentative brightfield billeder af flere tidspunkter for at demonstrere, hvordan cellerne / organoider ser ud i de forskellige faser af protokollen. Hcipc’erne blev fjernet fra vævskulturpladen, opdelt i små stykker og placeret i en T75 ultralav fastgørelseskolbe, hvor de dannede kugler. Det er vigtigt at bemærke, at cellerne ser lyse og lignende i størrelse, uden mørke, døende celler i midten af disse klynger. Cellerne blev gradvist vænnet fra bFGF. På dag 5 blev…

Discussion

Svarende til andre organoid modeller, dette er et kunstigt system, der kommer med flere forbehold. Selv om der var lidt batch til batch variation i form af generelle udtrykniveauer, individuelle organoider viste forskelle. F.eks. var placeringen af Sox-2-positive områder ikke identisk i alle organoider (figur 3). Mens qPCR er egnet til at lede efter generelle ændringer i partier af celler, yderligere teknikker såsom enkelt celle RNAseq vil blive udnyttet i fremtidige undersøgelser til at indsamle fle…

Materials

Alexa Fluor 488 goat anti-mouse	Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, USA	A11029
Alexa Fluor 546 goat anti-rabbit	Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, USA	A11035
B27 Supplement	Gibco, Waltham, MA, USA	17504-044
bFGF	Life Technologies, Carlsbad, CA, USA	PHG0263
BSA	Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA	A9647
BX43 microscope	Olympus, Shinjuku, Tokyo, Japan
DAPI stain	Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, USA	D1306
Dispase	STEMCELL Technologies, Vancouver, Canada	07913
DMEM/F12	Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, USA	11330-032
DPBS	Gibco, Waltham, MA, USA	10010023
FluroSave	MilliporeSigma, Burlington, MA	345789
GFAP antibody	NeuroMab, Davis, CA	N206A/8
Growth Factor Reduced Matrigel (Matrix)	Corning, Corning, NY, USA	356231
H9 hESCs	WiCell, Madison, WI, USA	WA09
Heparin	Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA	9041-08-1
iQ SYBR Green Supermix	Bio-Rad, Hercules, CA, USA	1708880
iScript cDNA Synthesis Kit	Bio-Rad, Hercules, CA, USA	1708891
L-glutamine	Gibco, Waltham, MA, USA	25030-081
Monothioglycerol	Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA	M6145
mTESR media	STEMCELL Technologies, Vancouver, Canada	85850
N2 NeuroPlex	Gemini Bio Products, West Sacramento, CA, USA	400-163
Nanodrop	Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, USA	ND-2000
NEAA	Gibco, Waltham, MA, USA	11140-050
Normal Donkey Serum (NDS)	ImmunoResearch Laboratories Inc., West Grove, PA, USA	017-000-121
OCT	Sakura Finetek, Torrance, CA, USA	25608-930
PFA	Electron Microscopy Sciences, Hatfield, PA	RT15710
qPCR machine	Bio-Rad, CFX96, Hercules, CA, USA	1855196
RNeasy kit	Qiagen, Hilden, Germany	74104
Sox2	MilliporeSigma, Burlington, MA	AB5603
TMS-F microscope	Nikon, Melville, NY, USA
Triton X-100	Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA	T8787-100ML
Ultra-low attachment T75 flasks	Corning, Corning, NY, USA	3814