Um método estática auto-direcionado para gerar organoides cerebrais a partir de células-tronco embrionárias humanas

Summary

Esse protocolo foi gerado como um meio de produzir organoides cerebrais de forma simplificada e de baixo custo sem fatores de crescimento exógenos ou matriz de membrana do porão, mantendo a diversidade de tipos de células cerebrais e muitas características da organização celular.

Abstract

Organoides cerebrais humanos diferenciados de células-tronco embrionárias oferecem a oportunidade única de estudar interações complicadas de múltiplos tipos de células em um sistema tridimensional. Aqui apresentamos um método relativamente simples e barato que produz organoides cerebrais. Neste protocolo, as células-tronco pluripotentes humanas são divididas em pequenos aglomerados em vez de células únicas e cultivadas na mídia básica sem uma matriz de membrana de porão heterologous ou fatores de crescimento exógenos, permitindo que as pistas de desenvolvimento intrínsecas modelem o crescimento organoide. Este sistema simples produz uma diversidade de tipos de células cerebrais, incluindo células gliais e microgliais, células-tronco e neurônios do cérebro, cérebro médio e cérebro traseiro. Organoides gerados a partir deste protocolo também exibem marcas de organização temporal e espacial apropriada demonstrada por imagens de campo brilhante, histologia, imunofluorescência e reação quantitativa quantitativa da cadeia de polimerase em tempo real ( qRT-PCR). Como esses organoides contêm tipos de células de várias partes do cérebro, eles podem ser utilizados para estudar uma infinidade de doenças. Por exemplo, em um artigo recente demonstramos o uso de organoides gerados a partir deste protocolo para estudar os efeitos da hipóxia no cérebro humano. Essa abordagem pode ser usada para investigar uma série de condições de estudo difíceis de estudar, como deficiências neurodesenvolvimentista, distúrbios genéticos e doenças neurológicas.

Introduction

Devido a uma miríade de limitações práticas e éticas, houve muita dificuldade em estudar o cérebro humano. Embora estudos que utilizam roedores tenham sido críticos para nossa compreensão do cérebro humano, o cérebro do rato tem muitas diferenças^1,2. Curiosamente, os camundongos têm uma densidade neuronal que é pelo menos 7 vezes menor que o cérebro primata^3,4. Embora os primatas estejam mais próximos dos humanos do que os roedores do ponto de vista evolutivo, não é prático para a maioria dos pesquisadores trabalhar com eles. O objetivo deste protocolo era recapitular muitas características importantes do cérebro humano usando um método simplificado e menos caro sem a necessidade de uma matriz de membrana de porão heterologous ou fatores de crescimento exógenos, mantendo a diversidade celular cerebral e a organização celular.

O trabalho formativo do laboratório Sasai utilizou a cultura livre de soro do método de corpos embrionários (SFEBq) para gerar tipos de células neuronais bidimensionais bidimensionais de células-tronco sinalizadas (ESCs)^5,6. Muitos métodos organoides cerebrais humanos seguiram um caminho relativamente semelhante das ESCs sinalizadas^7,8. Em contraste, este protocolo começa com clusters de ESCs humanos destacados (HESCs), semelhantes aos passos iniciais do trabalho seminal dos laboratórios Thomson e Zhang antes das etapas de revestimento^9,10, bem como o passo inicial do protocolo organoide cerebral do laboratório Pasca antes da adição de fatores de crescimento exógenos¹¹. Matrizes de membrana do porão (por exemplo, matrigel) têm sido utilizadas em muitos protocolos organoides cerebrais e tem se mostrado um andaime eficaz⁸. No entanto, as matrizes de membrana do porão mais comumente utilizadas não vêm sem complicações, pois copurificam com quantidades desconhecidas de fatores de crescimento com variabilidade em lote a lote durante a produção¹². Além disso, essas matrizes podem complicar a imagem e aumentar o risco de contaminação e custo.

Embora os organoides cerebrais humanos possam ser usados para responder a muitas perguntas, há certas limitações a ter em mente. Por um ano, a partir de células-tronco embrionárias, os organoides se assemelham mais a cérebros imaturos do que cérebros idosos e, como tal, podem não ser modelos ideais para doenças que ocorrem na velhice, como a doença de Alzheimer. Segundo, enquanto nosso protocolo encontrou marcadores de desenvolvimento cerebral, cérebro médio e hindbrain que são úteis para estudar o efeito de um tratamento ou doença em células de múltiplas regiões cerebrais em concerto, outros protocolos podem ser seguidos para se concentrar em regiões cerebrais específicas^13,14. Finalmente, outra limitação dos modelos organoides é a de tamanho, enquanto o comprimento médio de um cérebro humano aproximadamente 167 mm, organoides cerebrais feitos com o uso de agitação crescem até 4 mm⁸ e os organoides formados por este protocolo crescem para 1-2 mm por 10 semanas. No entanto, este protocolo fornece uma ferramenta importante para estudar o tecido cerebral humano e a interação de múltiplos tipos de células.

Protocol

1. Manutenção de células-tronco Mantenha hESCs em uma camada de fator de crescimento reduzido matriz de membrana do porão (ver a Tabela de Materiais, a partir de agora simplesmente referida como matriz) de acordo com as instruções do fabricante. Para revestir uma placa de 6 poços ou um prato de 10 cm, misture 100 μL de matriz com 5,9 mL de meio Águia modificado de Dulbecco (DMEM)/F12. Enrole as placas em filme de parafina e armazene durante a noite a 4°C. Use-as no dia seguint…

Representative Results

A Figura 1 mostra imagens representativas de campo brilhante de vários pontos de tempo para demonstrar como são as células/organoides ao longo dos diferentes estágios do protocolo. Os hESCs foram removidos da placa de cultura do tecido, quebrados em pequenos pedaços, e colocados em um frasco de fixação ultra-baixo T75 onde formavam esferas. É importante notar que as células parecem brilhantes e semelhantes em tamanho, sem células escuras e moribundas nos centros desses aglomerados….

Discussion

Semelhante a outros modelos organoides, este é um sistema artificial que vem com várias ressalvas. Embora houvesse pouca variação de lote a lote em termos de níveis gerais de expressão, organoides individuais apresentaram diferenças. Por exemplo, a localização das áreas positivas Sox-2 não era idêntica em cada organoide(Figura 3). Embora o qPCR seja adequado para procurar mudanças globais em lotes de células, técnicas adicionais como a RNAseq de célula única serão utilizadas em estudos …

Materials

Alexa Fluor 488 goat anti-mouse	Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, USA	A11029
Alexa Fluor 546 goat anti-rabbit	Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, USA	A11035
B27 Supplement	Gibco, Waltham, MA, USA	17504-044
bFGF	Life Technologies, Carlsbad, CA, USA	PHG0263
BSA	Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA	A9647
BX43 microscope	Olympus, Shinjuku, Tokyo, Japan
DAPI stain	Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, USA	D1306
Dispase	STEMCELL Technologies, Vancouver, Canada	07913
DMEM/F12	Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, USA	11330-032
DPBS	Gibco, Waltham, MA, USA	10010023
FluroSave	MilliporeSigma, Burlington, MA	345789
GFAP antibody	NeuroMab, Davis, CA	N206A/8
Growth Factor Reduced Matrigel (Matrix)	Corning, Corning, NY, USA	356231
H9 hESCs	WiCell, Madison, WI, USA	WA09
Heparin	Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA	9041-08-1
iQ SYBR Green Supermix	Bio-Rad, Hercules, CA, USA	1708880
iScript cDNA Synthesis Kit	Bio-Rad, Hercules, CA, USA	1708891
L-glutamine	Gibco, Waltham, MA, USA	25030-081
Monothioglycerol	Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA	M6145
mTESR media	STEMCELL Technologies, Vancouver, Canada	85850
N2 NeuroPlex	Gemini Bio Products, West Sacramento, CA, USA	400-163
Nanodrop	Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, USA	ND-2000
NEAA	Gibco, Waltham, MA, USA	11140-050
Normal Donkey Serum (NDS)	ImmunoResearch Laboratories Inc., West Grove, PA, USA	017-000-121
OCT	Sakura Finetek, Torrance, CA, USA	25608-930
PFA	Electron Microscopy Sciences, Hatfield, PA	RT15710
qPCR machine	Bio-Rad, CFX96, Hercules, CA, USA	1855196
RNeasy kit	Qiagen, Hilden, Germany	74104
Sox2	MilliporeSigma, Burlington, MA	AB5603
TMS-F microscope	Nikon, Melville, NY, USA
Triton X-100	Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA	T8787-100ML
Ultra-low attachment T75 flasks	Corning, Corning, NY, USA	3814