Summary
Detta protokoll genererades som ett sätt att producera hjärnan organoider på ett förenklat, lågt kostnadssätt utan exogena tillväxtfaktorer eller källaren membran matris samtidigt som mångfalden av hjärnan celltyper och många funktioner i cellulära organisation.
Abstract
Mänskliga hjärnorganoider differentierade från embryonala stamceller erbjuder en unik möjlighet att studera komplicerade interaktioner mellan flera celltyper i ett tredimensionellt system. Här presenterar vi en relativt enkel och billig metod som ger hjärnan organoider. I detta protokoll mänskliga pluripotenta stamceller är uppdelade i små kluster i stället för enstaka celler och odlas i grundläggande medier utan en heterolog källare membran matris eller exogena tillväxtfaktorer, så att den inneboende utvecklingssignaler att forma den organoidens tillväxt. Detta enkla system producerar en mångfald av hjärncelltyper inklusive glia- och mikrogliala celler, stamceller och nervceller i framhjärnan, mellanhjärnan och hindbrain. Organoider som genereras från detta protokoll visar också kännetecken för lämplig tids- och rumslig organisation som demonstreras av brightfield bilder, histologi, immunfluorescens och kvantitativa omvänd transkriptionspolymerasreaktion i realtid ( qRT-PCR). Eftersom dessa organoider innehåller celltyper från olika delar av hjärnan, de kan användas för att studera en mängd sjukdomar. Till exempel, i en nyligen papper visade vi användningen av organoider som genereras från detta protokoll för att studera effekterna av hypoxi på den mänskliga hjärnan. Detta tillvägagångssätt kan användas för att undersöka en rad annars svåra att studera tillstånd såsom neurodevelopmental handikapp, genetiska sjukdomar, och neurologiska sjukdomar.
Introduction
På grund av otaliga praktiska och etiska begränsningar har det varit stora svårigheter att studera den mänskliga hjärnan. Medan studier som använder gnagare har varit avgörande för vår förståelse av den mänskliga hjärnan, har mushjärnan många skillnader1,2. Intressant, möss har en neuronal densitet som är minst 7 gånger mindre än primathjärnan3,4. Även primater är närmare människor än gnagare ur evolutionär synvinkel, är det inte praktiskt för de flesta forskare att arbeta med dem. Syftet med detta protokoll var att sammanfatta många viktiga funktioner i den mänskliga hjärnan med hjälp av en förenklad och billigare metod utan behov av en heterolog källare membran matris eller exogena tillväxtfaktorer samtidigt som hjärnans cell mångfald och cellulära organisation.
Formativt arbete från Sasai labbet använde serumfri kultur av embryoid organ (SFEBq) metod för att generera två- och tredimensionella neuronala celltyper från signaliserade embryonala stamceller (ESCs)5,6. Många mänskliga hjärnan organoid metoder har följt en relativt liknande väg från signaliserade ESCs7,8. Däremot börjar detta protokoll med kluster av fristående mänskliga ESCs (hESCs), liknande de första stegen i nyskapande arbete thomson och Zhang laboratorier före plätering steg9,10 samt det ursprungliga steget i hjärnan organoid protokoll pasca laboratoriet innan tillsats av exogena tillväxtfaktorer11. Källare membran matriser (t.ex. matrigel) har använts i många hjärnan organoid protokoll och det har visat sig vara en effektiv byggnadsställning8. Emellertid, oftast används källare membran matriser kommer inte utan komplikationer eftersom de samrena med okända mängder tillväxtfaktorer med parti till batch variabilitet under produktion12. Dessutom kan dessa matriser komplicera bildbehandling, och öka risken för kontaminering och kostnad.
Medan mänskliga hjärnan organoider kan användas för att svara på många frågor, Det finns vissa begränsningar att tänka på. För en, från embryonala stamceller, organoider mer liknar omogna hjärnor än åldern hjärnor och som sådan kanske inte är idealiska modeller för sjukdomar som uppstår i ålderdomen, som Alzheimers sjukdom. För det andra, medan vårt protokoll hittade markörer för framhjärnan, midbrain och hindbrain utveckling som är användbara för att studera effekten av en behandling eller sjukdom på celler från flera hjärnregioner i samförstånd, andra protokoll kan följas för att koncentrera sig på specifika hjärnregioner13,14. Slutligen, en annan begränsning av organoid modeller är att av storlek, medan den genomsnittliga längden på en mänsklig hjärna ca 167 mm, hjärnan organoider som gjorts med hjälp av agitation växa upp till 4 mm8 och organoider som bildas av detta protokoll växa till 1-2 mm med 10 veckor. Icke desto mindre, detta protokoll ger ett viktigt verktyg för att studera mänskliga hjärnvävnad och samspelet mellan flera celltyper.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Stamcellsunderhåll
- Underhåll H9 hESCs på ett lager av tillväxtfaktor minskad källare membran matris (se tabellen över material,hädanefter helt enkelt kallad matris) enligt tillverkarens instruktioner.
- För att belägga en 6-brunn tallrik eller en 10 cm maträtt, kombinera 100 μL matris med 5,9 ml iskall Dulbecco modifierade Eagle medium (DMEM) / F12 media. Wrap plattor i paraffin film och lagra över natten vid 4 ° C. Använd dem nästa dag för passaging celler efter överskott matris / media är aspirerade.
- Kultur cellerna vecka till vecka på cirka en 1:12 delat förhållande var 7 dagar. Underhåll cellerna med mTESR-1 media i en 37 °C, låg syreinkubator (5% O2, 5% CO2). Uppdatera media dagligen. Sårad ut skilja celler från kulturen mellan passager med hjälp av glasverktyg.
- H9 celler bör passages fyra till sex dagar innan du använder dem för att producera organoider. Cellerna ska skickas vid ungefär ett 1:8-förhållande mellan cellkluster. För att göra detta, börja med sköljning av cellerna med DMEM F12 media och separera cellerna med en neutral proteas (t.ex. dispase, hädanefter kallad helt enkelt som proteas), skölj med DMEM/F-12, och platta som 30-60 cellkluster över 4 plattor (6-brunn eller 10 cm) vid ~20% confluency. Två dagar före skörden, överför dem till en vanlig inkubator (21% O2, 5% CO2). Plattorbör nå ~ 80% sammanflödet när du börjar organoid bildning.
2. Dissociation av hESCs för organoid kultur
- Aliquot proteasbeståndet lösning (5 U/mL).
OBS: Vi fryser vanligtvis ner 1 ml alikvoter vid -20 °C för användning under flera månader. - Späd proteasbeståndets lösning på arbetskoncentrationen genom att lägga till 1 ml i lagerlösningen plus 5 ml DMEM/F12 för varje 6-brunn eller 10 cm platta av hESCs.
- Aspirera och ta bort cellkultur media, sedan täcka hESCs med proteas lösningen. Placera plattorna i inkubatorn i 10-15 min eller tills koloniernas kanter rundar upp och börjar separera från matrisen.
- Luta plattan, sug upp proteaslösningen och tvätta försiktigt cellerna med DMEM/F12 tre gånger. Använd 2 ml/brunn för varje tvätt när du använder en 6-brunnsplatta och 6 ml när du använder en 10 cm tallrik. Se till att kolonierna förblir fästa vid matrisen när de utför det här steget.
- Lägg tillbaka ca 1,5 ml färskt mTESR-medium till varje brunn (eller 5 ml för en 10 cm platta) och spola cellerna från plattan med hjälp av mjuka rör.
- Med hjälp av en 10 ml pipett, försiktigt aspirera och fördela hESC inom plattan tills de når ca 1/30av sin ursprungliga storlek. Kolonikluster bör likna ~250-350 μm stora rutor vid slutförandet av dessa steg.
3. Generering av organoider
- Överför celler till en enda extremt låg fastsättning T75-kolv som innehåller 30 ml mTESR-medier utan grundläggande fibroblasttillväxtfaktor (bFGF).
- Nästa dag, luta kolven (s) så att levande celler poolen i hörnet (detta kan ta 5-10 min på den första dagen, men kommer att bli snabbare som kluster blir större).
OBS: Om det finns ett stort antal celler som har anslutit sig till kolvens botten i detta steg eller eventuella efterföljande steg, överför cellerna till en ny kolv. Det är normalt att ha en hög population av döda celler under de första två dagarna. När du utför medieändringar, se till att ta bort så mycket av cellskräpsom möjligt. - När cellerna lägger sig, aspirera av media och döda celler lämnar cirka 10 ml media som innehåller levande celler.
- Lägg ~ 20 ml låg bFGF media (DMEM/F12 kompletteras med 1x N2, 1x B27, 1x L-glutamin, 1x NEAA, 0,05% bovinserum albumin (BSA), och 0,1 mM monothioglycerol (MTG) kompletteras med 30 ng/mL bFGF).
- Kontrollera cellerna dag 2. Om de flesta av cellerna ser friska och ljusa, det finns ingen anledning att göra någonting. Men om mer än en tredjedel av cellerna verkar mörka, ersätta media (med samma lutningteknik som i steg 3.2) med ~20 ml låg bFGF-media kompletterat med 20 ng/ml bFGF.
- På dag 3, ersätta hälften av media (med hjälp av tiltteknik i steg 3,2) med 20 ml låg bFGF-medium kompletterat med 10 ng/ml bFGF.
- På dag 5, byt ut hälften av mediet (med hjälp av tilttekniken i steg 3.2) med 20 ml neurala induktionsmedier (NIM: DMEM/F12, 1x N2-tillägg, 0,1 mM MEM NEAA, 2 μg/mL heparin).
OBS: Om det finns några stora kluster av celler eller organoider som är mycket större än de andra, bör de tas bort från kulturen. Storleken uppskattas av utseende under mikroskopet; till exempel med hjälp av ett okular med riktmedel. Majoriteten av organoiderna är lika stora (ungefär 100 ± 20 μm). Vi tog bort organoider som var cirka 2x mindre eller större än de andra. - Byt ut hälften av mediet (~15 ml) (med hjälp av tilttekniken) med NIM varannan dag.
- Efter 3 veckor i kultur, tillsätt 100x penicillin/streptomycin till media (NIM: DMEM/F12, 1x N2 tillägg, 0,1 mM MEM NEAA, 2 μg/mL heparin) vid en slutlig koncentration av 1x om så önskas. Uppdatera media varannan dag.
NOTERA: På detta sätt behöll vi organoider i upp till 6 månader i kultur.
4. RNA Utvinning och beredning
- Extrahera försiktigt cirka 15 organoider (beroende på storlek) från kolven med en 10 ml pipett och placera i ett 1,5 ml-rör.
- Vänd försiktigt organoiderna i centrifugen (200 x g i 1 min) och skölj med 1x Dulbeccos PBS (DPBS) tre gånger.
- Extrahera RNA med validerat system eller protokoll (t.ex. RNeasy kit).
- Mät värdet för optisk densitet för varje prov vid 260 och 280 nm.
- Förbered cDNA med hjälp av ett validerat system eller protokoll (t.ex. iScript cDNA-synteskit).
- Utför qRT-PCR med förvaliderade primers(tabell 1) inklusive minst en hushållninggen.
5. Immunohistokemi
- Fixering
- Förbered en 4% paraformaldehyd (PFA) lösning och placera den vid 4 °C.
- Skär av spetsen av en steril överföringspipett.
- Blanda försiktigt organoider med hjälp av den skurna överföringen pipett, eftersom de lätt kan brytas isär, särskilt när de blir stora, och placera dem i en 6-brunn tallrik med ytterligare media eller DPBS.
- Luta plattan, sug upp mediet och byt ut med 1x DPBS. Skölj cellerna med 1x DPBS ytterligare två gånger.
- Byt ut DPBS med 4% PFA-lösning och placera på en shaker vid 4 °C.
OBS: Medan vi fast i 2 dagar (för små organoider) till 7 dagar (för organoider > 3 månader), kortare tider (t.ex. 16-24 h) kan också vara möjligt. - Förbered 30%, 20% och 10% sackaros lösningar i DPBS.
- Efter fixering i PFA, byt ut med 10% sackaroslösning och placera på en shaker vid 4 °C för 24 h.
- Byt ut 10% sackaros med 20% sackaros och placera på en shaker vid 4 °C för 24 h.
- Byt ut 20% sackaros med 30% sackaros och placera på en shaker vid 4 °C för 24 h.
- Frysta sektioner
- Förbered ett platt lager torris och placera en märkt plastmögel ovanpå den.
- Häll ett tunt lager av optimalt skärtemperaturmedium (OCT) i formen och låt den börja härda (inom några sekunder).
- Placera några organoider på toppen av OCT i formen med hjälp av en överföring pipett med spetsen avskuren och ägna stor uppmärksamhet åt platsen för organoider.
- Lägg långsamt i OCT tills formen är full och organoiderna är täckta. Låt den härda helt i ytterligare 10 min.
OBS: Medan frysning över 10 min hjälper till att säkerställa idealisk relativ placering av flera organoider för snittning, är det möjligt att använda en etanoltorr is blandning eller flytande kväve för att frysa snabbare. - Markera den relativa platsen för organoiderna med en markör för att göra det lättare att hitta dem vid skärning.
- Placera formar i en väska eller låda och förvara på -80 °C tills de är redo att skära sektionerna.
- Med hjälp av en kryostat, skiva 10 μm sektioner och placera vävnaden på märkta, positivt laddade diabilder.
- Färgning
- Förbered blockeringslösning (0,3% Triton X-100, 4% normalt åsna serum i PBS).
- Använd en hydrofoba pap penna för att rita runt omkretsen av vävnaden.
- Skölj bilderna med PBS 3 gånger i 5 min vardera.
- Byt ut PBS med blockeringslösning för 1 h i rumstemperatur.
- Byt ut blockeringslösningen med antikroppslösning (antikropp vid lämplig koncentration, 0,1% Triton X-100, 4% normalt åsna serum i PBS) vid 4 °C över natten.
- På följande dag, tvätta bilden 3 gånger med PBS i 10 min vardera.
- Byt pbs mot lämplig sekundär antikropp (vid lämplig koncentration) utspädd i antikroppslösning för 1 h i rumstemperatur.
- Skölj 3 gånger i 10 min varje gång med 1x PBS.
- Applicera färgfläcken 4',6-diamidino-2-fenylindol (DAPI) och skölj tre gånger i 10 min vardera med 1x PBS.
- Fäst täcksskydd på framsidan av diabilderna med monteringslösning, låt torka i rumstemperatur i mörker och förvaras i mörker vid 4 °C.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Bild 1 visar representativa brightfield bilder av flera tidpunkter för att visa hur cellerna / organoider ser ut i hela de olika stadierna av protokollet. HESCs avlägsnades från vävnadsodlingsplattan, bröts i små bitar och placerades i en T75 ultralåg fastsättningskolv där de bildade sfärer. Det är viktigt att notera att cellerna ser ljusa och liknande i storlek, utan mörka, döende celler i mitten av dessa kluster. Cellerna avvejkades gradvis av bFGF. På dag 5 placerades de i neurala induktionsmedier och de blev kvar i dessa medier under hela kulturperioden. Även om organoiderna blir större och därmed mörkare med tiden, är det viktigt att notera de neurala rosettliknande strukturer (svarta pilar) som finns i hela hjärnan organoid utveckling och expandera. Rosetter na indikerar inledandet av neural differentiering och innehåller funktioner i det embryonala neurala röret, visar epitelegenskaper och omger en apical lumen15.
Färgning av organoider med hematoxylin och eosin vid 5 månader i kultur visade att det inte fanns stora mängder nekros även i centra, som var av första oro med tanke på stillastående kultursystem(figur 2A). Dessa organoider visade en histologic morfologi som liknar den mänskliga cortex baserad på ljus mikroskopisk utvärdering av en erfaren neuropatolog (Figur 2B). Genom histologi observerades många unika cellmorfosologier som liknade glia (blå pilhuvud), nervceller (röd pilspets), celler med Cajal-Retzius morfologi (svarta pilar) och neuropil (orange pilhuvud) (figur 2B,C).
För att ta en mer djupgående titt på genuttryck inom cellerna utfördes qRT-PCR. För resultaten som visas i figur 3representerar varje stapel 3 separata satser av celler som odlas självständigt och skördas vid den angivna tidpunkten. Dessa prover kördes sedan i tre exemplar med ett primer par till den angivna genen utöver hushållning genen, GAPDH. Glutamattransportören Vglut1 (figur 3A) uttrycktes på 2,5 veckor, ökade med 5 veckor och förblev konsekvent genom 5 månader i kultur. En framhjärnan markör, Foxg1 (Figur 3B),uttrycktes på låga nivåer fram till 5 veckor i kultur. Den djupa lagermarkören, Tbr1 (figur 3C), nådde cirka 5 veckor och minskade därefter, medan den övre lagermarkören Satb2 (figur 3D) ökade med tiden.
Uttrycker av ventralmarkören Engrailed1 (Eng1) (Figur 3E), hindbrainen/ryggmärgsmarkören Hoxb4 (Figur 3F), as well as den oligodendrocyte markören, Olig2 (Figurer3G), alla ökade över tid. Däremot minskade stamcellsmarkören Sox2 (figur 3Hmed tiden. Den glial markör, FAP (Figur 3I),nådde en topp på 5 veckor och förblev relativt konstant därefter. Dessutom var immunofluorescensdata förenliga med qRT-PCR-data. Vid 10 veckor fanns det ett robust uttryck för Foxg1 (figur 4A). Sox2 uttryck var mer begränsad till områden som liknar subventricular zonen (SVZ)(Figur 4B,C). Intressant nog fanns det också ett uttryck för den yttre radiella gliacellmarkören HopX (Figur 4D).
Figur 1: Översikt över organoida tillväxtförhållanden och morfologi. (A)Schematisk av medieförändringar. (B-M) Representativa bilder av organoider när de mognade. (B-M) H9 hESCs (B) användes för att bilda hjärnan organoider. Organoider på(C)dag 2 i 20 ng/mL bFGF media, och (D)dag 3 och (E)dag 4 i 10 ng/mL bFGF media. (F-M) Organoider i neurala induktionsmedier (NIM) på dag 5(F), 8 (G), 10 (H), 17 (I)35(J,K)och 70(L,M). Pilar pekar på neurala rosetter. Skala bar = 200 μm. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 2: Organoider delade histologic likheter med mänsklig hjärnvävnad. H & E färgning av organoider vid 5 månader (A) med några skiktning som liknar den mänskliga cortex (B). Vid högre förstoring observerades många cellmorfosologier inklusive glia (blå pilhuvud), nervceller (röd pilspets), neuropil (orange pilhuvud) och celler med Cajal-Retzius morfologi (svarta pilar) (B,C). Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 3: Uttryck för neuroutvecklingsgener inom hjärnanorganoider över tiden. Kvantitativa RT-PCR-data med SYBR green som utvärderar uttrycket vglut1 (A), Foxg1 (B), Tbr1 (C), Satb2 (D), En1 (E), Hoxb4 (F), Olig2 (G), Sox2 (H) och GFAP (I). Felstaplar = genomsnittlig ± standardavvikelse (n ≥ 3). Den här siffran har ändrats från16. Se tabell 1 för primerinformation. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 4: Uttryck för neuroutvecklingsproteiner inom hjärnanorganoider vid 10 veckor. Immunofluorescens visade ett robust uttryck för Foxg1 (A), lokaliserat uttryck för Sox2 (B,C) och förekomsten av HopX (D). Klicka här för att se en större version av denna siffra.
| Gen | Sekvens (5 till 3') | Amplicon | Exon | |
| En1 (på) | F | GGACAATGACGTTGAAA CGCAGCA |
149 | 2 |
| R | AAGGTCGTAAGCGGTTT GGCTAGA (PÅ) |
2 | ||
| Foxg1 (på) | F | AGAAGAACGGCAAGTAC Gaga |
188 | 1 |
| R | TGTTGAGGGACAGATTG TGGC (tggc) |
1 | ||
| GAPDH | F | ACCACAGTCCATGCCAT Cac |
449 | 8 |
| R | CACCACCCTGTTGCTGT Agcc |
9 | ||
| GFAP (PÅ) | F | AGAGATCCGCACGCAGT Atg |
80 | 4 |
| R | TCTGCAAACTTGGAGCG Gta |
5-apr | ||
| Hoxb4 | F | AAAGCACCCTCTGACTG CCAGATA |
80 | 2 |
| R | ATGGGCACGAAAGATGA GGGAGA (på andra) |
2 | ||
| Olig2 (på) | F | CCCTGAGGCTTTTCGGA Gcg |
451 | 1 |
| R | GCGGCTGTTGATCTTGA GACGC |
2 | ||
| Satb2 (på) | F | TAGCCAAAGAATGCCCT Ctc |
94 | 6 |
| R | AAACTCCTGGCACTTGG Ttg |
7 | ||
| Sox2 (på) | F | CCCAGCAGACTTCACAT Gt |
150 | 1 |
| R | CCTCCCATTTCCCTCGT Ttt |
1 | ||
| Tbr1 (på) | F | GTCACCGCCTACCAGAA Cac |
101 | 4 |
| R | ACAGCCGGTGTAGATCG Tg |
6 | ||
| Vglut1 (vglut1) | F | CAGAGTTTCGGCTTTG CTATTG |
183 | 5-apr |
| R | GCGACTCCGTTCTAAGG Gtg |
6 |
Tabell 1: Primer-sekvenser som används för kvantitativa RT-PCR i figur 3.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Liknar andra organoid modeller, Detta är ett artificiellt system som kommer med flera varningar. Även om det fanns lite parti till batch variation när det gäller övergripande uttrycknivåer, enskilda organoider uppvisade skillnader. Till exempel var placeringen av Sox-2 positiva områden inte identiska i varje organoid(figur 3). Medan qPCR är lämplig att leta efter övergripande förändringar i partier av celler, ytterligare tekniker såsom single cell RNAseq kommer att användas i framtida studier för att samla in mer information från cell-för-cell basis. En annan begränsning av detta system, är att det inte integreravaskulära inom organoider som har gjorts i några av de nyare studierna17,18,19. Övergången från låg till hög syremiljö kan dock mer liknar den anaeroba till aeroba övergången i ett utvecklingsembryo.
De kritiska stegen inom detta protokoll är bildandet av neurosfärerna samt lämpligt underhåll inklusive medieförändringar med rätt kulturmedier för att säkerställa friska celler och lämpliga näringsämnen till de växande organoiderna utan överbeläggning . För att felsöka otillräcklig cellspridning eller differentiering rekommenderar vi att du börjar med ett nytt parti med låg passage av ESCs och nyberedda medier inklusive kosttillskott. Ibland kan det finnas batch variation av reagenser och material. Därför rekommenderar vi att köpa flera flaskor reagenser som N2 och ultra-låg fastsättning flaskor som är från samma parti så länge de kan användas i en rimlig tid.
Till skillnad från många andra hjärnan organoid protokoll, använder denna metod inte en bioreaktor; istället cellerna förblir relativt stillastående bortsett från media förändringar. Detta liknar tidigare arbete med neurosfärer, som så småningom brötiss för att göra 2D neuronal kulturer20. I denna modell cellerna hålls i ett 3D-format och får växa i upp till 6 månader i kultur. Det konstaterades att när du använder små kluster istället för att aggregera enstaka celler som organoiderna såg ljusare ut, vilket vi tolkade som mindre necrotic. Som tidigare rapporterats, när hjärnan organoid kluster utvärderades av histologi och immunfluorescens vid 5 månader, det fanns inga uppenbara områden av nekros16. Även om start från små kluster av celler introducerar lite variation i storleken på organoider bildas, var majoriteten av organoider av ungefär lika stor.
Användningen av en heterolog källarmembranmatris och en bioreaktor har både fördelar och nackdelar. Vissa celltyper, eller större hjärnorganoider kanske föredrar tillväxt under ett eller annat tillstånd. Källare membran matriser eller andra hydrogels kan vara fördelaktigt att selektivt lägga tillväxtfaktorer till vissa regioner eller skapa specifika formar. Även om källaren membran matriser har visat sig stödja tredimensionell organisation och differentiering15, är det värt att betona att vissa av dessa produkter har en dåligt definierad och varierande sammansättning som innehåller mängder av tillväxtfaktorer12. Förutom att förenkla arbetsflödet samtidigt som hjärnan organoider, avsaknaden av en källare membran matris kan också förbättra tredimensionella bildframställning tekniker.
Utvecklingen av detta hjärnan organoid modellsystem erbjuder en ny metod för många potentiella tillämpningar. Till exempel, giftiga förolämpningar som hypoxi, hyperglykemi, hyperkapni, och infektion bland andra, kan testas med detta system. Dessutom kan neuroutvecklingsstörningar studeras med detta system genom att börja med antingen genetiskt modifierade stamceller eller patientspecifika mänskliga inducerade pluripotenta stamceller (hPSCs). Förmågan att lägga till olika celltyper under organoid kultur erbjuder också möjligheten att studera tumör-hjärnan interaktioner. Med tanke på enkelheten i protokollet och bristen på dyra, specialmaterial hoppas vi att detta tillvägagångssätt kan övervägas av laboratorier både inom och utanför området som en potentiell metod med sina egna unika fördelar för att ytterligare främja detta snabbt framåt och spännande disciplin.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
S.G.K. är SAB-medlem för Dansar IT och Gene-in-Cell.
Acknowledgments
Vi tackar Yale Stem Cell Core (YSCC), och Yale Cancer Center (YCC) för hjälp. Vi tackar dr Jung Kim för hans neuropatologi recension. Detta arbete stöddes av Connecticut Regenerativ Medicine Research Fund, March of Dimes, och NHLBI R01HL131793 (S.G.K.), Yale Cancer Center och Yale Cancer Biology Training Program NCI CA193200 (E.B.) och en generös obegränsad gåva från Joseph och Joseph och en generös obegränsad gåva från Joseph och Joseph och en generös obegränsad gåva från Joseph och Joseph och en generös obegränsad gåva från Joseph och Joseph och en generös obegränsad gåva från Joseph och Joseph och Lucille Madri.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Alexa Fluor 488 goat anti-mouse | Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, USA | A11029 | |
| Alexa Fluor 546 goat anti-rabbit | Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, USA | A11035 | |
| B27 Supplement | Gibco, Waltham, MA, USA | 17504-044 | |
| bFGF | Life Technologies, Carlsbad, CA, USA | PHG0263 | |
| BSA | Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA | A9647 | |
| BX43 microscope | Olympus, Shinjuku, Tokyo, Japan | ||
| DAPI stain | Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, USA | D1306 | |
| Dispase | STEMCELL Technologies, Vancouver, Canada | 07913 | |
| DMEM/F12 | Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, USA | 11330-032 | |
| DPBS | Gibco, Waltham, MA, USA | 10010023 | |
| FluroSave | MilliporeSigma, Burlington, MA | 345789 | |
| GFAP antibody | NeuroMab, Davis, CA | N206A/8 | |
| Growth Factor Reduced Matrigel (Matrix) | Corning, Corning, NY, USA | 356231 | |
| H9 hESCs | WiCell, Madison, WI, USA | WA09 | |
| Heparin | Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA | 9041-08-1 | |
| iQ SYBR Green Supermix | Bio-Rad, Hercules, CA, USA | 1708880 | |
| iScript cDNA Synthesis Kit | Bio-Rad, Hercules, CA, USA | 1708891 | |
| L-glutamine | Gibco, Waltham, MA, USA | 25030-081 | |
| Monothioglycerol | Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA | M6145 | |
| mTESR media | STEMCELL Technologies, Vancouver, Canada | 85850 | |
| N2 NeuroPlex | Gemini Bio Products, West Sacramento, CA, USA | 400-163 | |
| Nanodrop | Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, USA | ND-2000 | |
| NEAA | Gibco, Waltham, MA, USA | 11140-050 | |
| Normal Donkey Serum (NDS) | ImmunoResearch Laboratories Inc., West Grove, PA, USA | 017-000-121 | |
| OCT | Sakura Finetek, Torrance, CA, USA | 25608-930 | |
| PFA | Electron Microscopy Sciences, Hatfield, PA | RT15710 | |
| qPCR machine | Bio-Rad, CFX96, Hercules, CA, USA | 1855196 | |
| RNeasy kit | Qiagen, Hilden, Germany | 74104 | |
| Sox2 | MilliporeSigma, Burlington, MA | AB5603 | |
| TMS-F microscope | Nikon, Melville, NY, USA | ||
| Triton X-100 | Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA | T8787-100ML | |
| Ultra-low attachment T75 flasks | Corning, Corning, NY, USA | 3814 |
References
- Northcutt, R. G.
- Roth, G. The Long Evolution of Brains and Minds. , Springer Netherlands. (2013).
- Herculano-Houzel, S. The human brain in numbers: a linearly scaled-up primate brain. Frontiers in Human Neuroscience. 3, 31 (2009).
- Roth, G., Dicke, U.
- Eiraku, M., et al. Self-organized formation of polarized cortical tissues from ESCs and its active manipulation by extrinsic signals. Cell Stem Cell. 3 (5), 519-532 (2008).
- Watanabe, K., et al. Directed differentiation of telencephalic precursors from embryonic stem cells. Nature Neuroscience. 8 (3), 288-296 (2005).
- Kadoshima, T., et al. Self-organization of axial polarity, inside-out layer pattern, and species-specific progenitor dynamics in human ES cell-derived neocortex. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 110 (50), 20284-20289 (2013).
- Lancaster, M. A., et al. Cerebral organoids model human brain development and microcephaly. Nature. 501 (7467), 373-379 (2013).
- Li, X. J., et al. Specification of motoneurons from human embryonic stem cells. Nature Biotechnology. 23 (2), 215-221 (2005).
- Zhang, S. C., Wernig, M., Duncan, I. D., Brustle, O., Thomson, J. A. In vitro differentiation of transplantable neural precursors from human embryonic stem cells. Nature Biotechnology. 19 (12), 1129-1133 (2001).
- Pasca, A. M., et al. Functional cortical neurons and astrocytes from human pluripotent stem cells in 3D culture. Nat Methods. 12 (7), 671-678 (2015).
- Hughes, C. S., Postovit, L. M., Lajoie, G. A. Matrigel: a complex protein mixture required for optimal growth of cell culture. Proteomics. 10 (9), 1886-1890 (2010).
- Qian, X., et al. Brain-Region-Specific Organoids Using Mini-bioreactors for Modeling ZIKV Exposure. Cell. 165 (5), 1238-1254 (2016).
- Sloan, S. A., Andersen, J., Pasca, A. M., Birey, F., Pasca, S. P. Generation and assembly of human brain region-specific three-dimensional cultures. Nature Protocols. 13 (9), 2062-2085 (2018).
- Kelava, I., Lancaster, M. A. Stem Cell Models of Human Brain Development. Cell Stem Cell. 18 (6), 736-748 (2016).
- Boisvert, E. M., Means, R. E., Michaud, M., Madri, J. A., Katz, S. G. Minocycline mitigates the effect of neonatal hypoxic insult on human brain organoids. Cell Death and Disease. 10 (4), 325 (2019).
- Bergmann, S., et al. Blood-brain-barrier organoids for investigating the permeability of CNS therapeutics. Nature Protocols. 13 (12), 2827-2843 (2018).
- Mansour, A. A., et al. An in vivo model of functional and vascularized human brain organoids. Nature Biotechnology. 36 (5), 432-441 (2018).
- Pham, M. T., et al.
- Boisvert, E. M., Denton, K., Lei, L., Li, X. J. The specification of telencephalic glutamatergic neurons from human pluripotent stem cells. Journal of Visualized Experiments. (74), (2013).
