Summary
Ce protocole fournit une méthode rapide et fiable pour mesurer quantitativement la phagocytose d'Aspergillus fumigatus conidia par les phagocytes primaires humains utilisant la cytométrie de flux et pour discriminer la phagocytose des conidies de la simple adhérence aux leucocytes.
Abstract
L'infection pulmonaire invasive par le moule Aspergillus fumigatus pose une grande menace pour les patients immunocompromis. Les concarnes fongiques inhalées (spores) sont éliminées des alvéoles pulmonaires humaines en étant phagocytosed par des monocytes innés et/ou des neutrophiles. Ce protocole offre une mesure rapide et fiable de la phagocytose par cytométrie de flux utilisant des conidies étiquetées par isothiocyanate de fluorescéine (FITC) pour la co-incubation avec les leucocytes humains et la contre-cellule subséquente avec un anticorps anti-FITC pour permettre la discrimination des conidies intériorisées et cellulaires. Les principaux avantages de ce protocole sont sa rapidité, la possibilité de combiner l'analyse avec l'analyse cytométrique d'autres marqueurs cellulaires d'intérêt, l'analyse simultanée des monocytes et des neutrophiles à partir d'un seul échantillon et son applicabilité à d'autres champignons ou bactéries muraux cellulaires. La détermination des pourcentages de phagocytosing leucocytes fournit un moyen aux microbiologistes pour évaluer la virulence d'un agent pathogène ou pour comparer les espèces pathogènes wildtypes et mutants ainsi qu'aux immunologistes pour étudier les capacités humaines de leucocyte pour combattre des agents pathogènes.
Introduction
L'aspergillose pulmonaire invasive est une grande menace pour les patients immunocompromis car les options de traitement sont limitées et seulement réussies sur le diagnostic tôt, qui mène aux taux élevés de mortalité1. Les agents infectieux sont des conidies (spores) de la moisissure Aspergillus fumigatus qui sont omniprésentes dans la plupart des habitats2. Les conidies sont inhalées, passent à travers les voies respiratoires et peuvent enfin entrer dans les alvéoles pulmonaires. Chez les humains immunocompétents, ces conidies sont éliminées par des cellules immunitaires innées telles que les monocytes ou les macrophages et les granulocytes neutrophiles, qui prennent (phagocytose) et digèrent les pathogènes3. La phagocytose est également importante pour les microbiologistes et les immunologistes lorsqu'elles s'intéressent aux interactions hôte-pathogène. Les essais de confrontation, tels que la co-incubation des leucocytes et des conidies, incluent souvent l'étiquetage des spores par fluorescein ou son isothiocyanate dérivé de fluorescein (FITC). À l'aide d'un microscope, il est simple d'identifier les conidies fluorescentes intériorisées et de déterminer les conidies attachées/adhérentes, bien que cette approche soit lourde et réalistement limitée à quelques centaines de cellules4. Cependant, dans la cytométrie de flux qui permet facilement l'analyse de centaines de milliers de cellules en quelques minutes, la coloration différentielle des conidies phagocytosed et adhérentes est essentielle. Par conséquent, de nombreux protocoles s'appuient sur Trypan Blue pour éteindre FITC-fluorescence de conidia adhérents5,6,7,8. Une autre approche consiste à exploiter le transfert d'énergie par résonance de fluorescence du bromure d'éhidium et du FITC pour émettre du rouge au lieu de la fluorescence verte des conidies adhérentes9,10,11. Si des anticorps spécifiques sont disponibles, comme c'est le cas pour certaines bactéries, les particules cellulaires peuvent être directement tachées12,13.
Ici, nous présentons un protocole pour évaluer rapidement et quantitativement la phagocytose des conidies A. fumigatus labeled DE FITC par les leucocytes humains avec l'attachement des spores aux cellules et le manque d'interaction en employant un anticorps anti-FITC allophycocyanin (APC) couplé. La méthode permet également l'analyse cytométrique simultanée d'autres marqueurs cellulaires qui peuvent être utilisés pour l'analyse séparée de la phagocytose par les monocytes et les neutrophiles du même échantillon.
Le protocole peut être appliqué pour la caractérisation des souches fongiques (par exemple, plusieurs espèces d'Aspergillus et d'autres moisissures du genre Mucorales présentés ici) et leurs mutants14 et la recherche immunologique sur les phagocytes, tels que les leucocytes des individus immunocompromis.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Ce protocole comprend l'utilisation de manteaux bouffi humains obtenus auprès de l'Institut de médecine transfusionnelle, l'hôpital universitaire d'Iéna et de sang veineux frais prélevé sur des patients, tous deux après le consentement éclairé écrit des donneurs conformément à l'approbation du comité d'éthique 4357-03/15.
1. Préparation d'Aspergillus fumigatus Conidia
- Cultivez A. fumigatus sur 1,5% malt agar Petri plats pendant 5 jours à 37 oC sans CO2.
CAUTION: A. fumigatus est un micro-organisme de biosécurité de niveau 2 et doit être manipulé dans une installation appropriée à l'aide d'une armoire de biosécurité et portant une blouse de laboratoire, des gants et un masque de filtre.
REMARQUE: La plaque doit être recouverte complètement d'une couche de conidie vert-gris. Les cultures blanches ne sporculagent pas. Composition de l'agar de malt : 4% (w/v) extrait de malt, extrait de levure 0.4% (w/v), agar 1.5% (w/v), Dest d'Aqua. - Récolte de conidies
- Placez un essuie-tout humide avec du désinfectant dans l'armoire de biosécurité et placez la plaque sur le dessus pour éviter la surdistribution de conidies volatiles.
- Ajouter 10 ml de phosphate tamponné salin (PBS) - 0,01% détergent sur le dessus du champignon, utiliser une spatule Drigalski pour répandre le liquide sur la plaque et frotter les conidies de couleur foncée. Veillez à ne pas enlever le mycélium blanc.
- Placez la suspension conidia sur un tube de 50 ml à l'aide d'une passoire cellulaire de 30 m pour enlever tout mycélium résiduel.
- Répétez les étapes 1.2.2 et 1.2.3 et collectez dans le même tube de 50 ml.
- Faire tourner pendant 5 min à 2 600 x g à température ambiante.
- Retirer le supernatant et le suspendre dans 20 ml de dest Aqua stérile.
- Déterminer la concentration de conidies avec une chambre de comptage Thoma.
REMARQUE: Le protocole peut être mis en pause ici et la suspension de conidia stockée pendant jusqu'à 1 mois à 4 oC avec le couvercle vissé étroitement.
- Étiquetage FITC
- Préparer une solution de 0,1 mM de poudre FITC en sterile 0.1 M Na2CO3 (dissous en PBS).
CAUTION: La poudre FITC est dangereuse et doit être manipulée avec des gants, des lunettes et un masque filtre. Recueillir les déchets conformément à la réglementation locale.
REMARQUE: Omettre la lumière artificielle pendant cette étape et les étapes suivantes impliquant des conidies. - Resuspendre 1 x 108 conidies (ou moins) dans 5 ml de solution FITC dans un tube de 15 ml. Incuber pendant 20 min à 37 oC dans un rotateur.
- Pour le contrôle négatif, resuspendre les conidies en 0,1 M Na2CO3 (sans FITC) dans un tube de 15 ml. Incuber pendant 20 min à 37 oC dans un rotateur.
REMARQUE: Lors du calcul de la quantité de conidies à tacher, prenez en compte une perte allant jusqu'à 70 % lors de la coloration, de l'enflure et de toutes les étapes de lavage nécessaires. Si aucun rotateur n'est disponible, la suspension doit être secouée trois fois pendant l'incubation. - Pour le lavage, ajouter 10 ml de PBS à 0,01 % de détergent à la suspension et tourner pendant 5 min à 2 600 x g à température ambiante.
- Enlever le supernatant et répéter le lavage deux fois avec 10 ml de PBS et 0,01 % de détergent.
- Préparer une solution de 0,1 mM de poudre FITC en sterile 0.1 M Na2CO3 (dissous en PBS).
- Enflure de conidies (peut être omise si elle n'est pas désirée)
- Resuspendre les conidies étiquetées FITC dans 5 mL de Roswell Park Memorial Institute (RPMI) moyen de 10 % sérum de veau fœtal (FCS) et incuber dans un rotateur à 37 oC pour le temps désiré (p. ex., 2 h, 4 h).
REMARQUE: Si aucun rotateur n'est disponible, la suspension doit être secouée au moins toutes les 20 min pendant l'incubation. - Ajouter 10 ml de PBS à 0,01 % de détergent à la suspension et tourner pendant 5 min à 2 600 x g à température ambiante.
- Retirer le supernatant et laver deux fois avec 10 ml de PBS et 0,01 % de détergent.
- Filtrer à travers une passoire cellulaire de 30 m pour enlever de gros bouquets de conidies.
- Resuspendre les conidies étiquetées FITC dans 5 mL de Roswell Park Memorial Institute (RPMI) moyen de 10 % sérum de veau fœtal (FCS) et incuber dans un rotateur à 37 oC pour le temps désiré (p. ex., 2 h, 4 h).
- Fixation des conidies (peut être omise si elle n'est pas désirée)
- Resuspendre les conidies étiquetées et gonflées de FITC dans 1 ml de formaldéhyde et couver pendant 1 h à température ambiante.
- Ajouter 10 ml de PBS à 0,01 % de détergent à la suspension et tourner pendant 5 min à 2 600 x g à température ambiante.
- Retirer le supernatant et laver deux fois avec 10 ml de PBS et 0,01 % de détergent.
REMARQUE: Le protocole peut être mis en pause ici et les conidies stockées dans PBS dans l'obscurité (tube enveloppé dans du papier d'aluminium) pour un jusqu'à 1 semaine à 4 oC.
2. Préparation des leucocytes primaires humains
- Mettre 5 ml de pelage bouffi dans un tube de 50 ml. Alternativement, utilisez du sang veineux périphérique humain frais puisé dans des monovettes d'acide éthylènediaminetetraacetic (EDTA) (10 ml par tube de 50 ml).
CAUTION: Le sang humain peut transmettre des virus tels que le virus de l'immunodéficience humaine et le virus de l'hépatite B. Ne manipulez qu'après avoir été vacciné contre l'hépatite B. Poignée dans une armoire de biosécurité portant manteau de laboratoire et gants. - Remplissez le tube avec erythrocyte Lysis (EL) Buffer, inversez trois fois et incubez pendant 5-8 min horizontalement jusqu'à ce que l'aspect laiteux du mélange devienne clair.
REMARQUE: De temps en temps, le sang peut prendre plus de temps à lyse. Allez par l'apparence. Il n'est pas rare que deux tubes d'un même sang prennent des moments différents pour lyse. Composition de la mémoire tampon EL : 0,15 M NH4Cl, 10 mM KHCO3, 0,1 mM EDTA - Faire tourner pendant 10 min à 300 x g à température ambiante. Jetez le supernatant.
- Resuspendre la pastille dans 1 ml d'EL Buffer par pipetting. Ajouter ensuite 24 ml de tampon EL et inverser plusieurs fois.
- Faire tourner pendant 5 min à 300 x g à température ambiante.
- Jeter le supernatant et resuspendre les cellules dans 1 ml de RPMI - 10% FCS.
- Déterminer la concentration cellulaire avec une chambre de comptage Neubauer.
3. Assay phagocytose
- Incuber 2 x 106 leucocytes et 4 x 106 conidies étiquetées FITC (multiplicité d'infection 2) dans 1,5 mL de RPMI et 10 % de FCS dans une plaque de culture cellulaire de 12 puits. En tant que témoins, inclure les cellules seulement (pas de conidies) et les cellules - conidies non étiquetées.
- Placer dans un incubateur de CO2 humidifié à 37 oC et couver pendant la période désirée (p. ex., 0,5 h, 2 h ou 4 h).
- Après l'incubation, récolter les cellules à l'abri d'un grattoir cellulaire et les mettre dans un tube de 15 ml.
- Faire tourner pendant 5 min à 300 x g à température ambiante.
- Recueillir supernatant pour l'analyse de cytokine ou jeter si elle n'est pas voulue. Resuspendre chaque échantillon dans 100 OL de PBS et 2 mM EDTA.
4. Staining d'anticorps
- Pour chaque échantillon, préparer 100 ll de mélange d'anticorps, y compris l'anticorps anti-FITC APC, selon le tableau 1.
- Mettre un échantillon de 100 l dans un puits d'une plaque de 96 puits à fond V. Ajouter 150 l de PBS à 2 mm d'EDTA pour le lavage.
- Pour la compensation de couleur, placez 1 x 106 cellules pour chaque couleur dans d'autres puits de la plaque inférieure de 96 puits V. Inclure un puits de cellules qui n'est pas taché. Ajouter 150 l de PBS à 2 mm d'EDTA pour le lavage.
- Couvrir la plaque d'une feuille adhésive.
- Faire tourner pendant 5 min à 300 x g à température ambiante. Retirer le papier d'aluminium.
- Jeter le supernatant en inversant rapidement et avec force la plaque une seule fois au-dessus de l'évier ou d'une serviette en papier jetable.
REMARQUE: Ne répétez pas ou ne frappez pas la plaque sur un papier jusqu'à ce qu'il soit sec, car cela entraînera une perte massive de cellules de la plaque. - Resuspendre les cellules dans le mélange d'anticorps de 100 l, et bien mélanger par pipetting.
- Pour la compensation des couleurs, resuspendre les cellules respectives dans 100 L de PBS 2 mM EDTA et ajouter un seul anticorps à chaque puits à la même quantité utilisée dans le mélange d'anticorps.
- Couvrir d'une feuille adhésive et couver pendant 20 min à température ambiante dans l'obscurité.
- Retirer le papier d'aluminium. Ajouter 150 L de PBS à 2 mm d'EDTA à chaque puits pour le lavage. Couvrir d'une feuille adhésive.
- Faire tourner pendant 5 min à 300 x g à température ambiante. Retirer le papier d'aluminium. Jeter le supernatant en inversant rapidement et avec force la plaque sur l'évier ou une serviette en papier jetable.
- Resuspendre dans 200 L de PBS 2 mM EDTA et transférer les cellules de chaque puits vers un tube de fond rond séparé. Assurez-vous qu'il n'y a pas de grappes cellulaires dans la suspension. Supprimer les clusters autrement.
REMARQUE: Chaque amas qui est assez grand pour que l'œil peut voir est assez grand pour obstruer potentiellement le cytomètre.
5. Cytométrie de flux
- Démarrez le cytomètre de débit et laissez-le se réchauffer. Démarrer le logiciel d'acquisition.
- Créez une nouvelle expérience et configurez et étiquetez les échantillons.
- Configurez les paramètres (FSC 250, SSC 250) et les détecteurs pour les fluorophores FITC, APC, BUV395, V500, PerCP-Cy5.5.
- Configuration de la rémunération
- Configuration de compensation ouverte.
- Indiquez les couleurs individuelles.
- À l'aide des cellules témoins non tachées ou avec des taches individuelles, régler les tensions du détecteur PMT pour inclure tous les événements dans l'échelle.
- Enregistrez au moins 10 000 événements de chaque commande.
- Utilisez la configuration de compensation pour calculer le débordement des fluorophores et appliquez-les aux paramètres cytomètres de l'expérience.
- Enregistrement des données de l'échantillon
- Afficher FSC et SSC dans le logiciel d'acquisition et mettre la porte autour des leucocytes.
- Basé sur la porte des leucocytes, afficher la parcelle de point SSC/CD45 et la porte pour les cellules CD45MD à séparer des conidies.
- Afficher séparément les cellules CD45MD dans une parcelle à points CD14/CD66b et les monocytes de porte (CD14MD) et les neutrophiles (CD66bMD).
- Afficher les neutrophiles dans une parcelle de point anti-FITC/FITC.
- À l'aide de l'échantillon avec des conidies non étiquetées, définir des quadrants pour les signaux anti-FITC et FITC, permettant un maximum de 1 % des cellules dans les quadrants respectifs.
- Répétez les étapes 5.5.4 et 5.5.5 pour la porte de monocyte.
- Enregistrez tous les échantillons avec au moins 20 000 événements dans la porte des leucocytes.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
En mesurant la phagocytose de A. fumigatus conidia par les cellules phagocytiques humaines, la discrimination entre l'intériorisation véritable et le simple attachement des conidies aux cellules est un obstacle, surtout quand il s'agit de méthodes à haut débit telles que la cytométrie du débit. Afin de surmonter cet obstacle, nous présentons un protocole rapide et fiable basé sur la coloration des conidies avec le colorant fluorescent FITC avant la co-incubation des cellules et des conidies, suivi d'une contre-coloration avec un anticorps anti-FITC étiqueté APC après l'incubation (Figure 1A). Comme le montre la figure 1B, les conidies étiquetées FITC sont phagocytosed par des monocytes humains et des neutrophiles qui fournissent un signal vert aux cellules. Ces conidies sont inaccessibles pour l'anticorps anti-FITC et, par conséquent, ne peuvent pas lier l'anticorps et les cellules apparaissent aPC négatif (FITCMD, APC-). Les cellules non interagissantes n'acquièrent pas de signal vert provenant de conidies étiquetées FITC et demeurent FITC-, APC-. Quelques cellules apparaissent FITC-, APC. Étant donné que l'anticorps Anti-FITC APC ne devrait pas être en mesure de lier les cellules sans conidies étiquetées FITC, ces événements sont considérés comme des artefacts de coloration. Les conidies étiquetées FITC, qui sont attachées aux cellules mais non intériorisées, rendent les cellules également positives pour le FITC, mais fournissent également une cible pour l'anticorps anti-FITC qui rend ces cellules double positive pour fitC et APC (FITCMD, APCMD). Lorsqu'elle est analysée au microscope, cette population contenait jusqu'à 20 % des cellules avec des conidies attachées seulement dans nos expériences.
L'utilisation des anticorps décrits dans ce protocole et suivant la stratégie de gating dans la figure 1D, un gating général des leucocytes humains par des caractéristiques de FSC et de SSC est suivi d'une séparation des leucocytes et des conidies libres par le marqueur de pan-leucocyte CD45. Particulièrement en utilisant des conidies gonflées et/ou de longs temps d'incubation, les conidies peuvent atteindre la taille presque de cellules au moment de la cytométrie d'écoulement et donc l'analyse de biais. Puisque les monocytes primaires humains et les neutrophiles prennent des conidies différemment, ce protocole permet d'analyser séparément ces populations cellulaires basées sur la coloration avec les marqueurs bien établis de lignée cellulaire CD14 pour des monocytes et des CD66b pour des neutrophiles. Le gating pour les populations de cellules phagocytosing et adhérentes est fait basé sur des échantillons témoins avec des conidies non étiquetées qui portent ni un FITC ni un signal anti-FITC APC. Lorsque l'APC et le FITC sont tracés les uns contre les autres, les quadrants sont fixés de telle manière qu'un maximum de 1 % de cellules sont autorisés dans les portes d'intérêt.
Le pourcentage de phagocytes primaires humains intériorisant les conidies peut être très variable chez les donneurs de sang, mais dépend également de facteurs expérimentaux tels que le temps d'incubation et l'état de gonflement des conidies. L'internalisation des spores peut être détectée après 0,5 h de co-incubation déjà et augmente avec le temps (Figure 2A). Les conidies pré-gonflées sont prises plus facilement que les spores de repos (non gonflées) même à de courts temps d'incubation (figure 2B). Si les conidies sont fixées avec du formaldéhyde, la phagocytose est diminuée par rapport aux conidies indigènes (figure 2C).
| Réactif | par échantillon |
| CD45 BUV395 | 1 |
| CD14 V500 | 0.5 |
| CD66b PerCP-Cy5.5 | 1.5 |
| aPC anti-FITC | 0.5 |
| PBS + 2 mM EDTA | 97 |
| Total | 100 |
Tableau 1 : Mélange d'anticorps pour la cytométrie du débit. Les quantités de chaque réactif sont administrées sous forme de microlitres par échantillon (1 x 106 cellules) à analyser.
Figure 1 : Configuration et analyse de l'analyse cytométrique de la phagocytose du débit. (A) Schéma du protocole comprenant des conidies et la préparation cellulaire et la contre-staining. (B) La phagocytose est analysée en traçant des données cytométriques de flux de conidies étiquetées FITC contre la contre-coloration de l'APC anti-FITC. Les populations qui en résultent indiquent des pourcentages de leucocytes non interagissants (FITC-, APC-), de leucocytes avec des conidies adhérentes (FITCMD, APCMD) et de phagocytosing leucocytes (FITCMD, APC-) ainsi que des artefacts de coloration (FITC-, APCMD). (C) Les populations de cellules positives doubles de 3 expériences différentes avec 3 donneurs différents (deux d'entre eux ont effectué en doublons, un simple effectué) ont été microscopiquement comptés pour les conidies intériorisées et attachées seulement. (D) Stratégie de gating représentative des données cytométriques de flux pour détecter les leucocytes (CD45), identifier les monocytes (CD14) et les neutrophiles (CD66b) et déterminer les populations en interaction (FITC, anti-FITC). Ce chiffre a été modifié à partir de Hartung et coll., Cytometry A, 95: 3, p. 332-338 (2019)14. Veuillez cliquer ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.
Figure 2 : La phagocytose des conidies par les phagocytes primaires humains dépend de plusieurs conditions. (A) Pourcentage de cellules intériorisant les conidies de repos a augmenté avec le temps de co-incubation. (B) La phagocytose a augmenté avec le temps de gonflement conidial quand co-incubé pendant 0.5 h. (C) les conidies indigènes étaient mieux phagocytosed que les conidies fixes. Les données ont été obtenues auprès de 10 donneurs différents (A,B) ou de 5 donneurs différents (C) dans 10 (A,B) ou 5 (C) expériences indépendantes. Les barres d'erreur indiquent SD. Ce chiffre a été modifié à partir de Hartung et coll., Cytometry A, 95: 3, p. 332-338 (2019)14. Veuillez cliquer ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.
Figure 3 : L'analyse de la phagocytose est un moyen d'évaluer la fonctionnalité des phagocytes primaires humains et de caractériser les moisissures cliniquement pertinentes. (A) Comparaison exemplaire des monocytes d'un donneur sain et d'un patient immunodéprimé (après transplantation hématopoïétique de cellules souches) phagocytosing conidia de repos pour 0.5 h, 2 h et 4 h. (B) Phagocytosis des conidies fongiques au repos a été déterminé pour les espèces d'Aspergillus et de Mucorales cliniquement pertinentes après 2 h co-incubation. Les données ont été obtenues à partir de 5 (Aspergillus) ou 3 (Mucorales) différents donateurs dans 5 ou 3 expériences indépendantes chacun. Les barres d'erreur indiquent SD. Abbreviations: A. Aspergillus, L. Lichtheimia, M. Mucor, R. Rhizopus S'il vous plaît cliquez ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Ce protocole présente une méthode cytométrique à débit rapide pour mesurer l'interaction de A. fumigatus conidia avec un grand nombre de leucocytes humains primaires qui n'est pas possible dans les protocoles microscopiques communs. L'imagerie des cellules avec un microscope et le comptage manuel des conidies intériorisées est lourd et peut être fait de façon réaliste pour quelques centaines de cellules seulement. La cytométrie de flux surmonte ce problème en mesurant des milliers de cellules en quelques minutes. Un obstacle commun aux deux approches est la distinction des conidies phagocytosed et adhérentes dans ou sur des cellules, respectivement. Dans la microscopie, le colorant calcofluor blanc est souvent utilisé pour tacher les conidies adhérentes, mais son utilisation est limitée aux micro-organismes avec une paroi cellulaire contenant de la chitin.
Ce protocole en revanche utilisé fluorophores distincts pour la caractérisation des événements d'interaction qui permet l'ajout d'autres marqueurs cellulaires, tels que les marqueurs de lignée CD45, CD14 et CD66b. Ainsi, il est également possible de distinguer la phagocytose des agents pathogènes par les monocytes et les neutrophiles dans un seul échantillon. Bien que le choix des marqueurs et des fluorophores pour l'identification cellulaire puisse être adapté aux besoins de l'expérience et aux capacités du cytomètre disponible, l'utilisation de l'anticorps spécifique APC anti-FITC mentionné dans ce protocole est recommandée car elle était la anticorps les plus fiables dans nos mains.
Puisque les conidies fixées au formaldéhyde ne sont pas intériorisées aussi bien, les spores indigènes sont recommandées pour les essais de phagocytose. Cependant, les conidies indigènes commenceront ou continueront à gonfler pendant la co-incubation avec les leucocytes humains et finiront par germer. Typiquement, a. fumigatus conidia germer après environ 8-9 h dans le support contenant du glucose à 37 oC. La combinaison du temps de gonflement et du temps de co-incubation avec des phagocytes ne devrait pas dépasser ce laps de temps car la germination cause la perte de FITC sur la surface de conidia. Plus important encore, les germes ne peuvent plus être phagocytosed par des monocytes ou des neutrophiles. Au lieu de cela, ces phagocytes s'accumulent autour et collent aux germes qui produisent des amas cellulaires qui obstruent le cytomètre, s'ils ne sont pas enlevés. De même, les conidies gonflées de 4 h ont tendance à générer des amas entre elles et avec des cellules. Souvent, ces grappes ne peuvent plus être séparées mécaniquement et les cellules à l'intérieur sont perdues pour l'analyse cytométrique du débit.
Bien que le gating soit simple et facile au début, plus les conidies sont intériorisées par les cellules, le gating plus flou peut devenir. L'utilisation de MOIs 'gt; 2 augmente la phagocytose aux points de temps initiaux mais les issues de gating pourraient surgir plus tôt aussi bien. Par conséquent, les MOI doivent être soigneusement déterminés avec les cellules spécifiques et les agents pathogènes d'intérêt.
Une limitation de ce protocole est dans la dualité de la population cellulaire avec des conidies adhérentes (FITCMD APC) qui pourraient également abriter des cellules avec des conidies adhérentes ainsi que intériorisées. Une possibilité de discrimination supplémentaire est l'application de la cytométrie de flux d'imagerie15 qui permet l'imagerie visuelle de toutes les cellules mesurées dans le cytomètre de flux.
En raison de l'étiquetage non spécifique FITC de la paroi cellulaire conidial, cette méthode est facilement transférable à d'autres champignons d'intérêt tels que les moules cliniquement pertinents du genre Mucorales ou la levure Candida albicans. En outre, les bactéries portant des parois cellulaires peuvent également être étiquetées FITC. La contre-séchage universel avec l'anticorps anti-FITC permet de mesurer rapidement et facilement la phagocytose de tous ces agents pathogènes par un grand nombre de leucocytes humains.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Les auteurs n'ont rien à révéler.
Acknowledgments
Nous remercions Mme Pia Stier pour son excellente assistance technique. M. von Lilienfeld-Toal est soutenu par le Center for Sepsis Control and Care (Ministère fédéral allemand de l'éducation et de la santé, BMBF, FKZ 01E01002) et InfectoGnostics Research Campus (BMBF, FKZ 13GW0096D). Thi Ngoc Mai Hoang est soutenu par l'École de communication microbienne de Jena (Deutsche Forschungsgemeinschaft, FKZ 214/2)
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Adhesive foil | Brand | 701367 | |
| anti-CD14 V500 | BD Biosciences | 561391 | clone M5E2 |
| anti-CD45 BUV395 | BD Biosciences | 563792 | clone HI30 |
| anti-CD66b PerCP-Cy5.5 | BD Biosciences | 562254 | clone G10F5 |
| anti-FITC APC | ThermoFisher Scientific | 17-7691-82 | clone NAWESLEE |
| Cell culture plate, 12-well | Greiner Bio-one | 665180 | |
| Cell scraper | Bioswisstech | 800020 | |
| Cell strainer, 30 µm | Miltenyi Biotech | 130-098-458 | SmartStrainer |
| Cytometer | BD Biosciences | LSR Fortessa II, lasers: 488 nm (blue), 405 nm (violet), 355 nm (UV) and 640 nm (red) | |
| Detergent | Sigma Aldrich | P1379 | Tween 20, 0.01% in PBS |
| Drigalski spatula | Carl Roth | PC59.1 | |
| Ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA) | Sigma Aldrich | ED3SS-500g | 2 mM in PBS |
| Erythrocyte lysis buffer | 0.15 M NH4Cl, 10 mM KHCO3, 0.1 mM EDTA | ||
| Fetal Calf Serum (FCS) | Biochrom AG | S 0115 | 10% in RPMI 1640 |
| Fluorescein isothiocyanate (FITC) | Sigma Aldrich | F3651-100MG | 0.1 mM in Na2CO3 /PBS solution |
| Formaldehyd | Carl Roth | PO87.3 | Histofix |
| Malt agar (1.5%) | malt extract (40 g), yeast extract (4 g), agar (15 g), Aqua dest. (1 L), adjust pH to 5.7-6.0, sterilise at 121 °C for 35 minutes | ||
| Na2CO3 | Carl Roth | 8563.1 | 0.1 M in PBS |
| Petri dish | Greiner Bio-one | 633180 | |
| Phosphat Buffered Saline (PBS) | ThermoFisher Scientific | 189012-014 | without Calcium, without Magnesium |
| RPMI 1640 | ThermoFisher Scientific | 61870010 | RPMI 1640 Medium, GlutaMAX Supplement |
| Rotator | Miltenyi Biotech | 130-090-753 | MACSmix Tube Rotator |
| Round-bottom tube, 7.5 mL | Corning | REF 352008 | |
| Software for data acquisition and analysis | BD Biosciences | FACSDiva 8.0 | |
| V-bottom plate, 96 well | Brand | 781601 | untreated surface |
References
- Brown, G. D., et al. Hidden killers: human fungal infections. Science Translational Medicine. 4 (165), 113 (2012).
- Brakhage, A. A., Bruns, S., Thywissen, A., Zipfel, P. F., Behnsen, J. Interaction of phagocytes with filamentous fungi. Current Opinion in Microbiology. 13 (4), 409-415 (2010).
- Heinekamp, T., et al. Interference of Aspergillus fumigatus with the immune response. Seminars in Immunopathology. 37 (2), 141-152 (2015).
- Slesiona, S., et al. Persistence versus escape: Aspergillus terreus and Aspergillus fumigatus employ different strategies during interactions with macrophages. PLoS One. 7 (2), 31223 (2012).
- Busetto, S., Trevisan, E., Patriarca, P., Menegazzi, R. A single-step, sensitive flow cytofluorometric assay for the simultaneous assessment of membrane-bound and ingested Candida albicans in phagocytosing neutrophils. Cytometry A. 58 (2), 201-206 (2004).
- Lowe, D. M., et al. A novel assay of antimycobacterial activity and phagocytosis by human neutrophils. Tuberculosis (Edinb). 93 (2), 167-178 (2013).
- Nuutila, J., Lilius, E. M. Flow cytometric quantitative determination of ingestion by phagocytes needs the distinguishing of overlapping populations of binding and ingesting cells. Cytometry A. 65 (2), 93-102 (2005).
- Saresella, M., et al. A rapid evaluation of phagocytosis and killing of Candida albicans by CD13+ leukocytes. Journal of Immunological Methods. 210 (2), 227-234 (1997).
- Fattorossi, A., Nisini, R., Pizzolo, J. G., D'Amelio, R. New, simple flow cytometry technique to discriminate between internalized and membrane-bound particles in phagocytosis. Cytometry. 10 (3), 320-325 (1989).
- Heinzelmann, M., Gardner, S. A., Mercer-Jones, M., Roll, A. J., Polk, H. C. Quantification of phagocytosis in human neutrophils by flow cytometry. Microbiology and Immunology. 43 (6), 505-512 (1999).
- Perticarari, S., Presani, G., Mangiarotti, M. A., Banfi, E. Simultaneous flow cytometric method to measure phagocytosis and oxidative products by neutrophils. Cytometry. 12 (7), 687-693 (1991).
- Sveum, R. J., Chused, T. M., Frank, M. M., Brown, E. J. A quantitative fluorescent method for measurement of bacterial adherence and phagocytosis. Journal of Immunolological Methods. 90 (2), 257-264 (1986).
- de Boer, E. C., Bevers, R. F., Kurth, K. H., Schamhart, D. H. Double fluorescent flow cytometric assessment of bacterial internalization and binding by epithelial cells. Cytometry. 25 (4), 381-387 (1996).
- Hartung, S., et al. Fast and Quantitative Evaluation of Human Leukocyte Interaction with Aspergillus fumigatus Conidia by Flow Cytometry. Cytometry A. 95 (3), 332-338 (2019).
- Fei, C., Lillico, D. M. E., Hall, B., Rieger, A. M., Stafford, J. L. Connected component masking accurately identifies the ratio of phagocytosed and cell-bound particles in individual cells by imaging flow cytometry. Cytometry A. 91 (4), 372-381 (2017).
