רקמות המורכבות של מערכות רב-תאיים לבלבל את הזיהוי של הקשר הסיבתי בין רמזים החילוץ והתנהגויות הסלולר הפרט. כאן, אנו מציגים שיטה לבחון את הקשר הישיר בין הרמזים תלויי הקשר וצירי החלוקה באמצעות שימוש בשיטת C. אלגיה העובר בלסטומרים וחרוזי פוליסטירן מוקצף.
במערכות רב-תאיים, תאים בודדים מוקפים ברמזים פיזיים וכימיים שונים המגיעים מתאים שכנים ומהסביבה. מורכבות רקמות זה מבלבלת את הזיהוי של הקשר הסיבתי בין רמזים חיצוניים ודינמיקה סלולרית. מערכת מלאכותית מחדש מתגבר על בעיה זו בכך שהיא מאפשרת לחוקרים לבדוק אות מסוים תוך חיסול אחרים. כאן, אנו מציגים שיטה ליצור מחדש דפוסי קשר של התאים עם האלגיה הבודד Caenorditis בלייסטורה ומחרוזות פוליסטירן מוקצף. ההליכים כוללים הסרת קליפת ביצה, בידוד בלסטורה על ידי שיבוש תא תא הדבקה, הכנת חרוזים פוליסטירן מוקצף, והחוקה של תא תא או קשר עם חרוז תא. בסופו של דבר, אנו מציגים את היישום של שיטה זו כדי לחקור את הכיוון של צירי החטיבה התאית התורמת לוויסות הריבוב הסלולר המרחבי ואת מפרט הגורל התא בפיתוח עוברים. שיטת החשיבה האיתנה והמגוונת מאפשרת ללמוד יחסים ישירים בין דפוסי קשר של תאים מרחביים ותגובות סלולריות.
במהלך פיתוח רב-תאיים, התנהגויות הסלולר (למשל, ציר החלוקה) של תאים בודדים מצוינים באמצעות רמזים כימיים ופיזיים שונים. כדי להבין כיצד תא בודד מפרש מידע זה, וכיצד הם מסדירים הרכבה רב-תאיים כמאפיין מתהווה מהווה אחת המטרות הסופיות של לימודי הורפוגנזה. האורגניזם מודל C. אלגיה תרם באופן משמעותי להבנת הרגולציה ברמה התאית של מורפוגנזה כגון קוטביות תא1, תא הניתוח1, החלטה של תא הגורל2, ותקנות בקנה מידה של רקמות כגון החיווט העצבי3 ו אורגנוגנזה4,5. למרות שיש כלים גנטיים שונים זמינים, שיטות הנדסת רקמות מוגבלות.
שיטת הנדסת הרקמה המוצלחת ביותר בחקר ה -C. אלגיה היא הבידוד הקלאסי של6; כמו העובר C. אלגיה מוקפת קליפת ביצה וחדירות מחסום7, הוצאתם היא אחת הפרוצדורות העיקריות של שיטה זו. בעוד שיטת הבידוד הבלסטורה מאפשרת ליצור מחדש את הקשר של תא התא באופן פשוט, הוא אינו מאפשר חיסול של רמזים לא רצויים; קשר התא עדיין מהווה הן מכני (למשל, הדבקה) ורמזים כימיים, ובכך להגביל את היכולת שלנו לנתח באופן מלא את הקשר הסיבתי בין האות והתנהגות תאית.
השיטה המוצגת במאמר זה משתמשת carboxylate אוחר שונה פוליסטירן מחרוזות שיכול לאגד באופן מיטבי לכל מולקולות של האמין-תגובתי כולל חלבונים כמו ליגנדס. במיוחד, השתמשנו בצורה של מין מגיב-מאמין של rhodamine אדום-X כמו ליגנד כדי לעשות חרוזים הן העקיבה החזותית ודבק לתא. קבוצות קרבוקסילי של משטח חרוז וקבוצות אמין הראשי של ליגנד מולקולה הם ביחד על ידי מסיס מים קרבודיאימיד 1-אתיל-3-(dimethylaminopropyl) קרבודיאימיד (edac)8,9. חרוזים מקבל דבק לאפשר את ההשפעות של הרמז המכני על דינמיקה סלולרית10. השתמשנו בטכניקה זו כדי לזהות רמזים מכניים הנדרשים לכיוון חלוקת תאים10.
החוקה החוזרת של דפוסי קשר של תא מפושט יאפשר לחוקרים לבדוק את התפקידים של דפוסי קשר תאים ספציפיים בהיבטים שונים של הורפוגנזה. השתמשנו בטכניקה זו כדי להראות כי ציר החלוקה של התאים נשלט על ידי מגע פיזי עם חרוזים הדבק10. כמו מפרט ציר החלוקה הוא חיוני עבור פיתוח רב-תאיים על ידי תורם ?…
The authors have nothing to disclose.
אנו מודים לג פרינס ולברוס בוקרמן לקבלת ייעוץ ולמתן זנים של C. אלגיה , דון מירמן, קוטה מיזומוטו, ומכון למדעי החיים במכון לעיבוד ציוד וריאגנטים, אחאי הירוסו, ליסה פרננדו, מין ג’י קים למען תחזוקת הג והקריאה הקריטית של כתב היד שלנו. העבודה שלנו נתמכת על ידי מדעי הטבע והמועצה לחקר ההנדסה של קנדה (NSERC), (RGPIN-2019-04442).
1-(3-Dimethylaminopropyl)-3-ethylcarbodiimide hydrochloride | Alfa Aesar | AAA1080703 | For the bead preparation |
Aspirator Tube Assembly | Drummond | 21-180-13 | For the blastomere isolation. |
Caenorhabditis elegans strain: N2, wild-type | Caenorhabditis Genetics Center | N2 | Strain used in this study |
Caenorhabditis elegans strain: KSG5, genotype: zuIs45; itIs37 | in house | KSG5 | Strain used in this study |
Calibrated Mircopipets, 10 µL | Drummond | 21-180-13 | For the blastomere isolation |
Carboxylate-modified polystyrene beads (30 µm diameter) | KISKER Biotech | PPS-30.0COOHP | For the bead preparation |
CD Lipid Concentrate | Life Technologies | 11905031 | For the blastomere isolation. Work in the tissue culture hood. |
Clorox | Clorox | N. A. | For the blastomere isolation. Open a new bottle when the hypochlorite treatment does not work well. |
Coverslip holder | In house | N.A. | For the blastomere isolation. |
Dissecting microscope: Zeiss Stemi 508 with M stand. Source of light is built-in LED. Magnification of eye piece is 10X. | Carl Zeiss | Stemi 508 | For the blastomere isolation. |
Fetal Bovine Serum, Qualified One Shot, Canada origin | Gibco | A3160701 | For the blastomere isolation. Work in the tissue culture hood. |
General Use and Precision Glide Hypodermic Needles, 25 gauge | BD | 14-826AA | For the blastomere isolation |
Inulin | Alfa Aesar | AAA1842509 | For the blastomere isolation |
MEM Vitamin Solution (100x) | Gibco | 11120052 | For the blastomere isolation. |
MES (Fine White Crystals) | Fisher BioReagents | BP300-100 | For the bead preparation |
Multitest Slide 10 Well | MP Biomedicals | ICN6041805 | For the blastomere isolation |
PBS, Phosphate Buffered Saline, 10 x Powder | Fisher BioReagents | BP665-1 | For the bead preparation |
Penicillin-Streptomycin (10,000 U/mL) | Gibco | 15140148 | For the blastomere isolation. |
Polyvinylpyrrolidone | Fisher BioReagents | BP431-100 | For the blastomere isolation |
Potassium Chloride | Bioshop | POC888 | For the blastomere isolation |
Rhodamine Red-X, Succinimidyl Ester, 5-isomer | Molecular Probes | R6160 | For the bead preparation |
Schneider’s Drosophila Sterile Medium | Gibco | 21720024 | For the blastomere isolation. Work in the tissue culture hood. |
Sodium Chloride | Bioshop | SOD001 | For the blastomere isolation |
Sodium Hydroxide Solution, 10 N | Fisher Chemical | SS255-1 | For the blastomere isolation |
Spinning disk confocal microscope: Yokogawa CSU-X1, Zeiss Axiovert inverted scope, Quant EM 512 camera, 63X NA 1.4 Plan apochromat objective lens. System was controlled by Slidebook 6.0. | Intelligent Imaging Innovation | N.A. | For live-imaging |
Syringe Filters, PTFE, Non-Sterile | Basix | 13100115 | For the blastomere isolation. |
Tygon S3 Laboratory Tubing,, Formulation E-3603, Inner diameter 3.175 mm | Saint Gobain Performance Plastics | 89403-862 | For the blastomere isolation. |
Tygon S3 Laboratory Tubing,, Formulation E-3603, Inner diameter 6.35 mm | Saint Gobain Performance Plastics | 89403-854 | For the blastomere isolation. |