Summary

في المختبر أعاده تشكيل الخلية المكانية أنماط الاتصال مع المعزولة Caenorhabditis الاجنه البدائية والخرز البوليسترين لاصقه

Published: November 26, 2019
doi:

Summary

تعقيدات الانسجه من أنظمه متعددة الخلايا العثور علي تحديد العلاقة السببية بين العظة خارج الخلية والسلوكيات الخلوية الفردية. هنا ، نقدم طريقه لدراسة الصلة المباشرة بين الإشارات التي تعتمد علي الاتصال ومحاور القسمة باستخدام الكريات البدائية الجنينية c. والخرز البوليسترين لاصقه.

Abstract

في النظم متعددة الخلايا ، وتحيط الخلية الفردية من العظة الفيزيائية والكيميائية المختلفة القادمة من الخلايا المجاورة والبيئة. وهذا التعقيد النسيجي يخلط بين تحديد العلاقة السببية بين العظة الخارجة والديناميكيات الخلوية. ويتغلب النظام المتعدد الخلايا المعاد تشكيله بشكل صناعي علي هذه المشكلة من خلال تمكين الباحثين من اختبار جديلة معينه مع القضاء علي الآخرين. هنا ، نقدم طريقه لأعاده تشكيل أنماط الاتصال الخلية مع معزولة Caenorhabditis البدائية والخرز البوليسترين لاصقه. وتشمل الإجراءات أزاله قشر البيض ، وعزل الخلايا البدائية عن طريق تعطيل التصاق خليه الخلية ، واعداد الخرز البوليسترين لاصقه ، وأعاده تشكيل خليه خليه أو خليه حبه الاتصال. وأخيرا ، نقدم تطبيق هذه الطريقة للتحقيق في اتجاه محاور الانقسام الخلوية التي تساهم في تنظيم الزخرفة الخلوية المكانية ومواصفات مصير الخلية في تطوير الاجنه. تمكن هذه الطريقة القوية والقابلة للتكرار ومتعددة الاستعمالات في المختبر من دراسة العلاقات المباشرة بين أنماط الاتصال بالخلايا المكانية والاستجابات الخلوية.

Introduction

خلال التنمية متعددة الخلايا ، يتم تحديد السلوكيات الخلوية (علي سبيل المثال ، محور القسمة) للخلايا الفردية بواسطة الإشارات الكيميائية والفيزيائية المختلفة. لفهم كيفيه الخلية الفردية يفسر هذه المعلومات ، وكيف انها تنظم التجمع متعدد الخلايا كخاصيه الناشئة هي واحده من الأهداف النهائية للدراسات التكوين. وقد ساهم الكائن النموذجي c. اليجانسيس بشكل كبير في فهم التنظيم علي مستوي الخلوية من تخلق مثل قطبيه الخلية1، الخلية تقسيم زخرفه1، الخلية مصير القرار2، واللوائح علي نطاق الانسجه مثل الأسلاك العصبية3 والعضوي4،5. علي الرغم من وجود العديد من الاداات الجينية المتاحة ، فان أساليب هندسه الانسجه محدوده.

طريقه هندسه الانسجه الأكثر نجاحا في الدراسة c. اليجايليس هو العزلة الكلاسيكية البدائية6; كما ج. وتحيط الاجنه الجنينية بقشره البيض وحاجز نفاذيه7، وأزالها هي واحده من الإجراءات الرئيسية لهذا الأسلوب. في حين ان هذه الطريقة العزلة الاريميه تمكن من أعاده الاتصال خليه خليه بطريقه مبسطه ، فانه لا يسمح للقضاء علي العظة غير المرغوب فيها ؛ الاتصال الخلية لا تزال تشكل كلا الميكانيكية (علي سبيل المثال ، التصاق) والعظة الكيميائية ، مما يحد من قدرتنا علي تحليل كامل للعلاقة السببية بين السلوك جديلة والخلوية.

تستخدم الطريقة المعروضة في هذه الورقة حبات البوليسترين المعدلة الكربوكسيل التي يمكن ان ترتبط بشكل خاص بأي جزيئات الأمين-التفاعلية بما في ذلك البروتينات كما ligands. علي وجه الخصوص ، استخدمنا شكل أمين التفاعلية من رومامين الأحمر-X باعتبارها يجند لجعل الخرز علي حد سواء بصريا تتبعها ولاصق إلى الخلية. وتقترن مجموعات الكربوكسيل من السطح حبه ومجموعات أمين الاوليه من الجزيئات القابلة للذوبان في الماء كربوديوميد 1-ايثيل-3-(ديميثيلامينوبروبيل) كربوديوميد (edac)8،9. الحصول علي حبات لاصقه تسمح للآثار من جديلة الميكانيكية علي ديناميات الخلوية10. لقد استخدمنا هذه التقنية لتحديد الإشارات الميكانيكية المطلوبة لتوجيه انقسام الخلية10.

Protocol

1. اعداد حبه البوليسترين لاصقه ملاحظه: هذا البروتوكول لا يتطلب تقنيه العقيم. تزن 10 ملغ من الخرز البوليسترين المعدلة الكربوكسيل في أنبوب الطرد المركزي الصغير 1.5 mL. لغسل الخرز ، أضافه 1 مل من 2-(ن-مورفينو) حمض اثانيسولفونيك (MES) العازلة في الأنبوب. منذ MES العازلة لا تحتوي…

Representative Results

لاعداد الخرز ، ونحن تحديد المبلغ الأمثل من روامين الأحمر-X استر الناجحة لسلاله المحورة وراثيا التعبير عن GFP-ميوسين الثانية و mCherry-histone (الشكل 1ا-د). استخدمنا mcherry الموسومة هيستون كعلامة علي تطور دوره الخلية. لان كلا من رونامين الأحمر-x و mcherry ستكون مضيئه بواسطة ليزر 561 n…

Discussion

أعاده تشكيل أنماط الاتصال الخلية المبسطة سوف تسمح للباحثين لاختبار ادوار أنماط الاتصال خليه محدده في جوانب مختلفه من التكوين. لقد استخدمنا هذه التقنية لإظهار ان محور تقسيم الخلية يتم التحكم من قبل الاتصال المادي مع الخرز لاصقه10. كما مواصفات محور الشعبة أمر حاسم للتنمية متعد?…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

نشكر جيمس بيس وبروس بورمان علي المشورة وتوفير سلالات c. اليجنز ، دون مورمان ، كوتا ميزوموتو ، ومعهد علوم الحياة مرفق التصوير الاساسيه لتقاسم المعدات والكاشفات ، أوى Hiroyasu ، ليزا فرناندو ، مين جي كيم للحفاظ علي c. اليجنز والقراءة النقدية لمخطوطنا. ويدعم عملنا مجلس العلوم الطبيعية والبحوث الهندسية في كندا (NSERC) ، (RGPIN-2019-04442).

Materials

1-(3-Dimethylaminopropyl)-3-ethylcarbodiimide hydrochloride Alfa Aesar AAA1080703 For the bead preparation
Aspirator Tube Assembly Drummond 21-180-13 For the blastomere isolation.
Caenorhabditis elegans strain: N2, wild-type Caenorhabditis Genetics Center N2 Strain used in this study
Caenorhabditis elegans strain: KSG5, genotype: zuIs45; itIs37 in house KSG5 Strain used in this study
Calibrated Mircopipets, 10 µL Drummond 21-180-13 For the blastomere isolation
Carboxylate-modified polystyrene beads (30 µm diameter) KISKER Biotech PPS-30.0COOHP For the bead preparation
CD Lipid Concentrate Life Technologies 11905031 For the blastomere isolation. Work in the tissue culture hood.
Clorox Clorox N. A. For the blastomere isolation. Open a new bottle when the hypochlorite treatment does not work well.
Coverslip holder In house N.A. For the blastomere isolation.
Dissecting microscope: Zeiss Stemi 508 with M stand. Source of light is built-in LED. Magnification of eye piece is 10X. Carl Zeiss Stemi 508 For the blastomere isolation.
Fetal Bovine Serum, Qualified One Shot, Canada origin Gibco A3160701 For the blastomere isolation. Work in the tissue culture hood.
General Use and Precision Glide Hypodermic Needles, 25 gauge BD 14-826AA For the blastomere isolation
Inulin Alfa Aesar AAA1842509 For the blastomere isolation
MEM Vitamin Solution (100x) Gibco 11120052 For the blastomere isolation.
MES (Fine White Crystals) Fisher BioReagents BP300-100 For the bead preparation
Multitest Slide 10 Well MP Biomedicals ICN6041805 For the blastomere isolation
PBS, Phosphate Buffered Saline, 10 x Powder Fisher BioReagents BP665-1 For the bead preparation
Penicillin-Streptomycin (10,000 U/mL) Gibco 15140148 For the blastomere isolation.
Polyvinylpyrrolidone Fisher BioReagents BP431-100 For the blastomere isolation
Potassium Chloride Bioshop POC888 For the blastomere isolation
Rhodamine Red-X, Succinimidyl Ester, 5-isomer Molecular Probes R6160 For the bead preparation
Schneider’s Drosophila Sterile Medium Gibco 21720024 For the blastomere isolation. Work in the tissue culture hood.
Sodium Chloride Bioshop SOD001 For the blastomere isolation
Sodium Hydroxide Solution, 10 N Fisher Chemical SS255-1 For the blastomere isolation
Spinning disk confocal microscope: Yokogawa CSU-X1, Zeiss Axiovert inverted scope, Quant EM 512 camera, 63X NA 1.4 Plan apochromat objective lens. System was controlled by Slidebook 6.0. Intelligent Imaging Innovation N.A. For live-imaging
Syringe Filters, PTFE, Non-Sterile Basix 13100115 For the blastomere isolation.
Tygon S3 Laboratory Tubing,, Formulation E-3603, Inner diameter 3.175 mm Saint Gobain Performance Plastics 89403-862 For the blastomere isolation.
Tygon S3 Laboratory Tubing,, Formulation E-3603, Inner diameter 6.35 mm Saint Gobain Performance Plastics 89403-854 For the blastomere isolation.

References

  1. Herman, M. Hermaphrodite cell-fate specification. WormBook. , (2006).
  2. Rose, L., Gonczy, P. Polarity establishment, asymmetric division and segregation of fate determinants in early C. elegans embryos. WormBook. , (2014).
  3. White, J. G., Southgate, E., Thomson, J. N., Brenner, S. The structure of the nervous system of the nematode Caenorhabditis elegans. Philosophical Transactions of the Royal Society of London. B, Biological Sciences. 314 (1165), 1 (1986).
  4. Mango, S. The C. elegans pharynx: a model for organogenesis. WormBook. , (2007).
  5. McGhee, J. The C. elegans intestine. WormBook. , (2007).
  6. Edgar, L. G., Goldstein, B. Culture and Manipulation of Embryonic Cells. Methods in Cell Biology. 107, 151-175 (2012).
  7. Stein, K. K. The C. elegans eggshell. WormBook. , (2018).
  8. Quash, G., et al. The preparation of latex particles with covalently bound polyamines, IgG and measles agglutinins and their use in visual agglutination tests. Journal of Immunological Methods. 22 (1), 165-174 (1978).
  9. Miller, J. V., Cuatrecasas, P., Brad, T. E. Purification of tyrosine aminotransferase by affinity chromatography. Biochimica et Biophysica Acta (BBA) – Enzymology. 276 (2), 407-415 (1972).
  10. Sugioka, K., Bowerman, B. Combinatorial contact cues specify cell division orientation by directing cortical myosin flows. Developmental Cell. 46 (3), 257-270 (2018).
  11. Park, F. D., Priess, J. R. Establishment of POP-1 asymmetry in early C. elegans embryos. Development. 130 (15), 3547-3556 (2003).
  12. Schneider, C. A., Rasband, W. S., Eliceiri, K. W. NIH Image to ImageJ: 25 years of image analysis. Nature Methods. 9 (7), 671-675 (2012).
  13. Thevenaz, P., Ruttimann, U. E., Unser, M. A pyramid approach to subpixel registration based on intensity. IEEE Transactions on Image Processing. 7 (1), 27-41 (1998).
  14. Gillies, T. E., Cabernard, C. Cell Division Orientation in Animals. Current Biology. 21 (15), 599-609 (2011).
  15. Poulson, N. D., Lechler, T. Asymmetric cell divisions in the epidermis. International Review of Cell and Molecular Biology. 295, 199-232 (2012).
  16. Knoblich, J. A. Asymmetric cell division: recent developments and their implications for tumour biology. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 11 (12), 849-860 (2010).
  17. Engler, A. J., Sen, S., Sweeney, H. L., Discher, D. E. Matrix elasticity directs stem cell lineage specification. Cell. 126 (4), 677-689 (2006).
  18. Dupont, S., et al. Role of YAP/TAZ in mechanotransduction. Nature. 474 (7350), 179-183 (2011).
  19. Schierenberg, E., Junkersdorf, B. The role of eggshell and underlying vitelline membrane for normal pattern formation in the early C. elegans embryo. Roux’s Archives of Developmental Biology. 202 (1), 10-16 (1992).
  20. Wang, Z., Wang, D., Li, H., Bao, Z. Cell neighbor determination in the metazoan embryo system. Proceedings of the 8th ACM International Conference on Bioinformatics, Computational Biology, and Health Informatics. , 305-312 (2017).
  21. Shaya, O., et al. Cell-cell contact area affects notch signaling and notch-dependent patterning. Developmental Cell. 40 (5), 505-511 (2017).
  22. Cao, J., et al. Comprehensive single cell transcriptional profiling of a multicellular organism. Science. 357 (6352), 661-667 (2017).
  23. Goldstein, B., Takeshita, H., Mizumoto, K., Sawa, H. Wnt signals can function as positional cues in establishing cell polarity. Developmental Cell. 10 (3), 391-396 (2006).
  24. Priess, J. R. Notch signaling in the C. elegans embryo. WormBook. , (2005).
  25. Müller, A., et al. Oriented cell division in the C. elegans embryo is coordinated by G-protein signaling dependent on the adhesion GPCR LAT-1. PLOS Genetics. 11 (10), 1005624 (2015).
  26. Marston, D. J., Roh, M., Mikels, A. J., Nusse, R., Goldstein, B. Wnt signaling during Caenorhabditis elegans embryonic development. Methods in Molecular Biology. 469, 103-111 (2008).
  27. Habib, S. J., et al. A localized Wnt signal orients asymmetric stem cell division in vitro. Science. 339 (6126), 1445-1448 (2013).

Play Video

Cite This Article
Hsu, C. R., Xiong, R., Sugioka, K. In Vitro Reconstitution of Spatial Cell Contact Patterns with Isolated Caenorhabditis elegans Embryo Blastomeres and Adhesive Polystyrene Beads. J. Vis. Exp. (153), e60422, doi:10.3791/60422 (2019).

View Video