تعقيدات الانسجه من أنظمه متعددة الخلايا العثور علي تحديد العلاقة السببية بين العظة خارج الخلية والسلوكيات الخلوية الفردية. هنا ، نقدم طريقه لدراسة الصلة المباشرة بين الإشارات التي تعتمد علي الاتصال ومحاور القسمة باستخدام الكريات البدائية الجنينية c. والخرز البوليسترين لاصقه.
في النظم متعددة الخلايا ، وتحيط الخلية الفردية من العظة الفيزيائية والكيميائية المختلفة القادمة من الخلايا المجاورة والبيئة. وهذا التعقيد النسيجي يخلط بين تحديد العلاقة السببية بين العظة الخارجة والديناميكيات الخلوية. ويتغلب النظام المتعدد الخلايا المعاد تشكيله بشكل صناعي علي هذه المشكلة من خلال تمكين الباحثين من اختبار جديلة معينه مع القضاء علي الآخرين. هنا ، نقدم طريقه لأعاده تشكيل أنماط الاتصال الخلية مع معزولة Caenorhabditis البدائية والخرز البوليسترين لاصقه. وتشمل الإجراءات أزاله قشر البيض ، وعزل الخلايا البدائية عن طريق تعطيل التصاق خليه الخلية ، واعداد الخرز البوليسترين لاصقه ، وأعاده تشكيل خليه خليه أو خليه حبه الاتصال. وأخيرا ، نقدم تطبيق هذه الطريقة للتحقيق في اتجاه محاور الانقسام الخلوية التي تساهم في تنظيم الزخرفة الخلوية المكانية ومواصفات مصير الخلية في تطوير الاجنه. تمكن هذه الطريقة القوية والقابلة للتكرار ومتعددة الاستعمالات في المختبر من دراسة العلاقات المباشرة بين أنماط الاتصال بالخلايا المكانية والاستجابات الخلوية.
خلال التنمية متعددة الخلايا ، يتم تحديد السلوكيات الخلوية (علي سبيل المثال ، محور القسمة) للخلايا الفردية بواسطة الإشارات الكيميائية والفيزيائية المختلفة. لفهم كيفيه الخلية الفردية يفسر هذه المعلومات ، وكيف انها تنظم التجمع متعدد الخلايا كخاصيه الناشئة هي واحده من الأهداف النهائية للدراسات التكوين. وقد ساهم الكائن النموذجي c. اليجانسيس بشكل كبير في فهم التنظيم علي مستوي الخلوية من تخلق مثل قطبيه الخلية1، الخلية تقسيم زخرفه1، الخلية مصير القرار2، واللوائح علي نطاق الانسجه مثل الأسلاك العصبية3 والعضوي4،5. علي الرغم من وجود العديد من الاداات الجينية المتاحة ، فان أساليب هندسه الانسجه محدوده.
طريقه هندسه الانسجه الأكثر نجاحا في الدراسة c. اليجايليس هو العزلة الكلاسيكية البدائية6; كما ج. وتحيط الاجنه الجنينية بقشره البيض وحاجز نفاذيه7، وأزالها هي واحده من الإجراءات الرئيسية لهذا الأسلوب. في حين ان هذه الطريقة العزلة الاريميه تمكن من أعاده الاتصال خليه خليه بطريقه مبسطه ، فانه لا يسمح للقضاء علي العظة غير المرغوب فيها ؛ الاتصال الخلية لا تزال تشكل كلا الميكانيكية (علي سبيل المثال ، التصاق) والعظة الكيميائية ، مما يحد من قدرتنا علي تحليل كامل للعلاقة السببية بين السلوك جديلة والخلوية.
تستخدم الطريقة المعروضة في هذه الورقة حبات البوليسترين المعدلة الكربوكسيل التي يمكن ان ترتبط بشكل خاص بأي جزيئات الأمين-التفاعلية بما في ذلك البروتينات كما ligands. علي وجه الخصوص ، استخدمنا شكل أمين التفاعلية من رومامين الأحمر-X باعتبارها يجند لجعل الخرز علي حد سواء بصريا تتبعها ولاصق إلى الخلية. وتقترن مجموعات الكربوكسيل من السطح حبه ومجموعات أمين الاوليه من الجزيئات القابلة للذوبان في الماء كربوديوميد 1-ايثيل-3-(ديميثيلامينوبروبيل) كربوديوميد (edac)8،9. الحصول علي حبات لاصقه تسمح للآثار من جديلة الميكانيكية علي ديناميات الخلوية10. لقد استخدمنا هذه التقنية لتحديد الإشارات الميكانيكية المطلوبة لتوجيه انقسام الخلية10.
أعاده تشكيل أنماط الاتصال الخلية المبسطة سوف تسمح للباحثين لاختبار ادوار أنماط الاتصال خليه محدده في جوانب مختلفه من التكوين. لقد استخدمنا هذه التقنية لإظهار ان محور تقسيم الخلية يتم التحكم من قبل الاتصال المادي مع الخرز لاصقه10. كما مواصفات محور الشعبة أمر حاسم للتنمية متعد?…
The authors have nothing to disclose.
نشكر جيمس بيس وبروس بورمان علي المشورة وتوفير سلالات c. اليجنز ، دون مورمان ، كوتا ميزوموتو ، ومعهد علوم الحياة مرفق التصوير الاساسيه لتقاسم المعدات والكاشفات ، أوى Hiroyasu ، ليزا فرناندو ، مين جي كيم للحفاظ علي c. اليجنز والقراءة النقدية لمخطوطنا. ويدعم عملنا مجلس العلوم الطبيعية والبحوث الهندسية في كندا (NSERC) ، (RGPIN-2019-04442).
1-(3-Dimethylaminopropyl)-3-ethylcarbodiimide hydrochloride | Alfa Aesar | AAA1080703 | For the bead preparation |
Aspirator Tube Assembly | Drummond | 21-180-13 | For the blastomere isolation. |
Caenorhabditis elegans strain: N2, wild-type | Caenorhabditis Genetics Center | N2 | Strain used in this study |
Caenorhabditis elegans strain: KSG5, genotype: zuIs45; itIs37 | in house | KSG5 | Strain used in this study |
Calibrated Mircopipets, 10 µL | Drummond | 21-180-13 | For the blastomere isolation |
Carboxylate-modified polystyrene beads (30 µm diameter) | KISKER Biotech | PPS-30.0COOHP | For the bead preparation |
CD Lipid Concentrate | Life Technologies | 11905031 | For the blastomere isolation. Work in the tissue culture hood. |
Clorox | Clorox | N. A. | For the blastomere isolation. Open a new bottle when the hypochlorite treatment does not work well. |
Coverslip holder | In house | N.A. | For the blastomere isolation. |
Dissecting microscope: Zeiss Stemi 508 with M stand. Source of light is built-in LED. Magnification of eye piece is 10X. | Carl Zeiss | Stemi 508 | For the blastomere isolation. |
Fetal Bovine Serum, Qualified One Shot, Canada origin | Gibco | A3160701 | For the blastomere isolation. Work in the tissue culture hood. |
General Use and Precision Glide Hypodermic Needles, 25 gauge | BD | 14-826AA | For the blastomere isolation |
Inulin | Alfa Aesar | AAA1842509 | For the blastomere isolation |
MEM Vitamin Solution (100x) | Gibco | 11120052 | For the blastomere isolation. |
MES (Fine White Crystals) | Fisher BioReagents | BP300-100 | For the bead preparation |
Multitest Slide 10 Well | MP Biomedicals | ICN6041805 | For the blastomere isolation |
PBS, Phosphate Buffered Saline, 10 x Powder | Fisher BioReagents | BP665-1 | For the bead preparation |
Penicillin-Streptomycin (10,000 U/mL) | Gibco | 15140148 | For the blastomere isolation. |
Polyvinylpyrrolidone | Fisher BioReagents | BP431-100 | For the blastomere isolation |
Potassium Chloride | Bioshop | POC888 | For the blastomere isolation |
Rhodamine Red-X, Succinimidyl Ester, 5-isomer | Molecular Probes | R6160 | For the bead preparation |
Schneider’s Drosophila Sterile Medium | Gibco | 21720024 | For the blastomere isolation. Work in the tissue culture hood. |
Sodium Chloride | Bioshop | SOD001 | For the blastomere isolation |
Sodium Hydroxide Solution, 10 N | Fisher Chemical | SS255-1 | For the blastomere isolation |
Spinning disk confocal microscope: Yokogawa CSU-X1, Zeiss Axiovert inverted scope, Quant EM 512 camera, 63X NA 1.4 Plan apochromat objective lens. System was controlled by Slidebook 6.0. | Intelligent Imaging Innovation | N.A. | For live-imaging |
Syringe Filters, PTFE, Non-Sterile | Basix | 13100115 | For the blastomere isolation. |
Tygon S3 Laboratory Tubing,, Formulation E-3603, Inner diameter 3.175 mm | Saint Gobain Performance Plastics | 89403-862 | For the blastomere isolation. |
Tygon S3 Laboratory Tubing,, Formulation E-3603, Inner diameter 6.35 mm | Saint Gobain Performance Plastics | 89403-854 | For the blastomere isolation. |