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Developmental Biology

In Vitro Reconstitution of Spatial Cell Contact Patterns with Isolated Caenorhabditis elegans Embryo Blastomeres and Adhesive Polystyrene Beads

doi: 10.3791/60422 Published: November 26, 2019

Summary

Les complexités tissulaires des systèmes multicellulaires confondent l'identification de la relation causale entre les indices extracellulaires et les comportements cellulaires individuels. Ici, nous présentons une méthode pour étudier le lien direct entre les indices contact-dépendants et les axes de division utilisant des blastomeres d'embryon de C. elegans et des perles adhésives de polystyrène.

Abstract

Dans les systèmes multicellulaires, les cellules individuelles sont entourées par les différents indices physiques et chimiques provenant des cellules voisines et de l'environnement. Cette complexité tissulaire confond l'identification du lien de causalité entre les indices extrinsèques et la dynamique cellulaire. Un système multicellulaire reconstitué synthétiquement surmonte ce problème en permettant aux chercheurs de tester un signal spécifique tout en éliminant les autres. Ici, nous présentons une méthode pour reconstituer des modèles de contact de cellules avec le blastomere isolé de Caenorhabditis elegans et les perles adhésives de polystyrène. Les procédures impliquent l'enlèvement de coquille d'œuf, l'isolement blastomere en perturbant l'adhérence de cellule-cellule, la préparation des perles adhésives de polystyrène, et la reconstitution du contact de cellule-cellule ou de cellule-perle. Enfin, nous présentons l'application de cette méthode pour étudier l'orientation des axes de division cellulaire qui contribue à la régulation du modelage cellulaire spatial et de la spécification du destin cellulaire dans le développement des embryons. Cette méthode in vitro robuste, reproductible et polyvalente permet d'étudier les relations directes entre les modèles de contact cellulaire spatial et les réponses cellulaires.

Introduction

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Pendant le développement multicellulaire, les comportements cellulaires (par exemple, l'axe de division) des cellules individuelles sont spécifiés par divers indices chimiques et physiques. Comprendre comment chaque cellule interprète cette information, et comment ils régulent l'assemblage multicellulaire comme une propriété émergente est l'un des objectifs ultimes des études de morphogénèse. L'organisme modèle C. elegans a contribué de manière significative à la compréhension de la régulation au niveau cellulaire de la morphogénèse comme la polarité cellulaire1, la division cellulaire modelant1, la décision du destin cellulaire2, et les règlements à l'échelle des tissus tels que le câblage neuronal3 et l'organogenèse4,5. Bien qu'il existe divers outils génétiques disponibles, les méthodes d'ingénierie tissulaire sont limitées.

La méthode d'ingénierie tissulaire la plus réussie dans l'étude de C. elegans est l'isolement classique de blastomere6; comme l'embryon de C. elegans est entouré d'une coquille d'œuf et d'une barrière de perméabilité7, leur élimination est l'une des principales procédures de cette méthode. Bien que cette méthode d'isolement blastomere permet la reconstitution du contact cellule-cellule d'une manière simplifiée, elle ne permet pas l'élimination des indices indésirables; le contact cellulaire pose toujours à la fois des indices mécaniques (p. ex. adhérence) et chimiques, limitant ainsi notre capacité d'analyser pleinement la relation causale entre le signal et le comportement cellulaire.

La méthode présentée dans cet article utilise des perles de polystyrène modifiés au carboxylate qui peuvent se lier de façon covalente à toutes les molécules réactives à l'amine, y compris les protéines comme ligands. En particulier, nous avons utilisé une forme amine-réactive de Rhodamine Red-X comme un ligand pour faire des perles à la fois visuellement trackable et adhésif à la cellule. Les groupes de carboxyl de surface de perle et les groupes primaires d'amine de molécule de ligand sont couplés par le carbodiimide soluble dans l'eau 1-éthylique-3-(dimethylaminopropyl) carbodiimide (EDAC)8,9. Les perles adhésives obtenues permettent les effets de la queue mécanique sur la dynamique cellulaire10. Nous avons utilisé cette technique pour identifier les indices mécaniques nécessaires à l'orientation de la division cellulaire10.

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Protocol

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1. Préparation de perles de polystyrène adhésif

REMARQUE : Ce protocole ne nécessite pas de technique aseptique.

  1. Peser 10 mg de perles de polystyrène modifiés de carboxylate dans un tube microcentrifuge de 1,5 ml.
  2. Pour laver les perles, ajouter 1 ml de tampon d'acide ethanesulfonic (MES) de 2 ml (N-(N-morpholino) dans le tube. Étant donné que le tampon MES ne contient pas de phosphate et d'acétate, ce qui peut réduire la réactivité du carbodiimide, il convient de l'utiliser dans la réaction de couplage de protéines. Vortex le tube pour mélanger les perles.
  3. Faites tourner le tube pour 60 s à 2 000 x g via une centrifugeuse sur le banc.
  4. Jeter le supernatant en pipetting soigneusement le tampon.
  5. Laver les perles à nouveau avec 1 ml de tampon MES en suivant les étapes 1.2-1.4.
  6. Ajouter 1 mL de tampon MES contenant 10 mg d'EDAC dans le tube pour activer les groupes de carboxyl de surface. Vortex le tube pour mélanger les perles.
  7. Faire pivoter et incuber le tube pendant 15 min à température ambiante.
  8. Faites tourner les perles pour 60 s à 2 000 x g.
  9. Jeter le supernatant en pipetting soigneusement le tampon.
  10. Pour laver les perles, ajouter 1 ml de phosphate salin tamponné (PBS) dans le tube. Vortex le tube pour mélanger les perles.
  11. Faites tourner le tube pendant 60 s à 2 000 x g.
  12. Jeter le supernatant en pipetting soigneusement le tampon.
  13. Laver les perles à nouveau avec 1 ml de PBS en suivant les étapes 1.10-1.12.
  14. La concentration finale de Rhodamine utilisée dépendra de l'image de la souche. Préparer 1 mL de 1, 10, 100 et 1000 fois la série de dilution de Rhodamine Red-X à partir de la solution de stock Rhodamine Red-X de 0,65 mM.
  15. Pipette 20 l de perles dans chaque tube de dilution série.
  16. Faire pivoter et incuber le tube pendant 5 minutes à température ambiante.
  17. Laver les perles deux fois avec 1 ml de PBS en répétant les étapes 1.10-1.12.
  18. Ajouter 1 ml de PBS dans le tube et le conserver à 4 oC pendant 6 semaines. Vérifiez l'intensité de fluorescence des perles sous un microscope utilisé pour l'imagerie vivante. La concentration appropriée de l'ester de succinimidyl rouge-X de Rhodamine dépend des conditions d'imagerie (figure 1).
    REMARQUE : Les perles sans traitement Rhodamine Red-X n'adhèrent pas à la cellule. Rhodamine Red-X sert de marqueur de fluorescence ainsi que de molécule adhésive. L'interaction électro statique entre rhodamine Red-X chargée positivement et membrane plasmatique chargée négativement est une cause putative d'adhérence.

2. Assemblage de la pipette buccale

  1. Couper les tubes Tygon larges (6,35 mm de diamètre intérieur) et étroits (3,175 mm) tygons à environ 25 cm et 40 cm de longueur, respectivement (figure 2).
  2. Connectez les tubes Tygon avec un filtre en polytétrafluoroéthylène (PTFE) (taille de 0,2 m pore) (Figure 2).
  3. Démonter un tube d'aspirateur disponible dans le commerce et attacher son support capillaire et son embout buccal à l'extrémité des tubes Tygon étroits et larges, respectivement (figure 2).
    REMARQUE : Le filtre PTFE a été utilisé pour empêcher l'inhalation de fumées de solution d'hypochlorite par la pipette buccale.

3. Isolement de l'embryon blastomere

REMARQUE : Portez des gants et une blouse de laboratoire pour éviter de couper et de communiquer avec la solution de blanchiment.

  1. Tenir chaque extrémité d'un microcapillaire (capacité; 10 l) avec la main droite et gauche.
  2. Tirez le microcapillary vers les deux extrémités pour appliquer la tension et amener le centre du capillaire au-dessus d'un brûleur pour faire deux capillaires tirés à la main (figure 3A).
  3. Couper les extrémités des capillaires tirés à la main avec des forceps sous le microscope disséquant et attacher le capillaire tiré dans un appareil de tuyauterie de bouche (Figure 2). Préparer deux types de pipettes. Les tailles d'ouverture de pointe pour les pipettes doivent être approximativement 2x et 1x la longueur courte d'axe des embryons de C. elegans (30 m) pour le transfert d'embryon et l'enlèvement de coquille d'oeuf, respectivement Figure 3B-D).
  4. Pipette 45 'L de solution de sel d'oeuf sur un puits d'une glissière multiwell (Figure 4A; bas).
  5. Placer 5-10 élegans C. adultes sur un puits contenant une solution de sel d'œuf.
  6. Pour obtenir les premiers embryons de C. elegans, couper les adultes en morceaux en plaçant deux aiguilles à droite et à gauche du corps de C. elegans et en glissant les aiguilles les unes devant les autres(figure 4A; schémas supérieurs).
  7. Pipette 45 l de solution d'hypochlorite sur un puits à côté du puits contenant une solution de sel d'œuf (figure 4B).
  8. Pipette 45 l du milieu de croissance de Shelton sur les trois puits suivants à côté du puits contenant de l'hypochlorite (figure 4B).
  9. Transférer les embryons à stade 1 cellulaire et à 2 cellules précoces dans la solution d'hypochlorite par tuyauterie buccale avec le capillaire dessiné à la main pour le transfert d'embryons (figure 4B).
  10. Attendez 40 à 55 s.
  11. Laver les embryons en transférant les embryons de la solution d'hypochlorite dans le milieu de croissance de Shelton par tuyauterie buccale avec le capillaire dessiné à la main pour le transfert d'embryons (figure 4B).
  12. Laver les embryons à nouveau en transférant les embryons dans un nouveau puits du milieu de croissance de Shelton par tuyauterie buccale avec le capillaire dessiné à la main pour le transfert d'embryons (Figure 4B).
  13. Transférer les embryons lavés dans un nouveau puits du milieu de croissance de Shelton par tuyauterie buccale avec le capillaire dessiné à la main pour le transfert d'embryons. À l'aide du capillaire dessiné à la main pour l'enlèvement des coquilles d'œufs, répétez soigneusement le tuyauterie(figure 4C; schémas intermédiaires). Si la coquille d'œuf est enlevée avec succès, les cellules embryonnaires deviendront plus sphériques(figure 4C; droite).
  14. Séparez les blastomères embryonnaires à deux cellules en faisant une pipetting en douceur et en continu avec le capillaire dessiné à la main pour l'enlèvement de la coquille d'œuf (Figure 4D).

4. Reconstitution des modèles de contact avec le blastomere et la perle

REMARQUE : Travaillez sous le microscope d'imagerie pour éviter la dissociation d'une cellule d'une perle et pour faciliter l'acquisition d'image en temps opportun.

  1. Pour observer à l'aide d'un microscope inversé, préparez une chambre d'imagerie comme dans la figure 5.
    1. Placez une glissière de couverture sur un support de couverture (Figure 5A).
    2. Tapez les bords de la glissière de couverture pour le stabiliser. Le côté avec du ruban adhésif est le côté «arrière» (Figure 5A,B).
    3. Retournez le support de la couverture sur le côté ' avant' et dessinez un cercle sur le bordereau avec un stylo hydrophobe (Figure 5C).
      REMARQUE : Tout plat à fond de verre fonctionne également, à condition que les embryons soient manipulés par la pipette de bouche.
  2. Ajouter le milieu de croissance de Shelton dans le cercle dessiné par le marqueur hydrophobe (figure 5D).
  3. Transférer le blastomere isolé dans la chambre d'imagerie.
  4. Distribuez un petit volume des perles chimiquement fonctionnalisées à l'aide du capillaire dessiné à la main pour le transfert d'embryons.
  5. Contrôlez la position des perles de polystyrène en soufflant dans le capillaire dessiné à la main jusqu'à ce que la perle se fixe au blastomere isolé.
  6. Monter un bordereau pour éviter l'évaporation du milieu (Figure 5E). Effectuez l'imagerie en direct.

5. Préparation de réactifs importants

  1. Solution de sel d'œuf (10 ml) : Combiner 235 oL de 5 M NaCl et 240 oL de 2 M KCl avec 9525 oL de dH2O.
  2. Solution d'hypochlorite (10 ml) : Combiner 7,5 ml de Clorox (contenant environ 7,5 % d'hypochlorite de sodium) avec 2,5 ml de 10 NaOH (la concentration finale d'hypochlorite de sodium est d'environ 5,625 %).
    REMARQUE: Bien que de nombreuses méthodes publiées ont utilisé la chitinase pour digérer les coquilles d'œufs chitinous, nous avons adopté une méthode utilisant la solution d'hypochlorite11. En évitant les variations de lots à lots des activités chitinase, nous croyons que cette méthode est une approche plus reproductible et rentable.
  3. 0,81 mM Solution d'inuline (40 ml)
    1. Ajouter 0,2 g d'inuline à 40 ml de dH2O.
    2. Autoclave à dissoudre.
      REMARQUE : Se conserve pendant 1 mois à 4 oC.
  4. 0,5 M DEM tampon (500 ml)
    1. Dissoudre 48,81 g de MES dans 400 ml d'eau distillée (dH2O).
    2. Ajuster le pH à 6,0.
    3. Porter le volume total à 500 ml avec dH2O.
  5. PBS Solution (1 L)
    1. Pour faire 10 fois la solution PBS, dissoudre 1 paquet de poudre de prémélange PBS en 1 L de dH2O.
    2. Combinez 100 mL de solution PBS 10 fois plus grande que 900 mL de dH2O.
  6. 5% Polyvinylpyrrolidone (PVP) Solution (4 mL)
    1. Dans des conditions stériles, dissoudre 0,2 g de PVP dans 4 ml de Drosophila Schneider's Medium.
      REMARQUE : Ouvrez toujours le stock moyen de Schneider dans la culture tissulaire (TC) hotte. Conserver pendant 1 mois à 4 oC.
  7. 0,65 mM Rhodamine Red-X stock solution (2 mL)
    1. Peser 1 mg de Rhodamine Red-X.
    2. Ajouter 2 ml de sulfoxide de diméthyle (DMSO) pour dissoudre.
    3. Aliquot et magasin à -20 oC.
  8. Shelton's Growth Medium (SGM) (10,25 ml)
    1. Dans des conditions stériles, combiner 8 mL de Drosophila Schneider's Medium, 1 mL de solution PVP, 1 mL de solution inuline, 1 mL de vitamines Basal Medium Eagle (BME), 50 oL de pénicilline-streptomycine et 100 ll de concentré lipidique ensemble.
    2. Aliquot 325 l de SGM en microtubes de 1,5 mL.
      REMARQUE : Conserver environ 1 mois à 4 oC.
    3. Le jour de l'isolement blastomere, ajouter 175 L de sérum bovin fœtal (FBS) à la SGM (pour un volume total de 500 l).
      REMARQUE : Conservez le FBS à -20 oC et dégelez-le avant utilisation. FBS n'a pas besoin d'être tué par la chaleur.

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Representative Results

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Pour la préparation des perles, nous avons déterminé la quantité optimale de Rhodamine Red-X succinimidyl ester pour la souche transgénique exprimant GFP-myosin II et mCherry-histone (Figure 1A-D). Nous avons utilisé mCherry marqué histone comme un marqueur de la progression du cycle cellulaire. Parce que Rhodamine Red-X et mCherry seront illuminés par un laser de 561 nm, l'intensité optimale du signal Rhodamine Red-X est comparable à celle de l'histone pour permettre l'imagerie simultanée des cellules et des perles. Par exemple, le signal de fluorescence de la perle traitée avec 0,005 g/mL Rhodamine Red-X succinimidyl ester était trop faible pour visualiser la perle (Figure 1A). D'autre part, le signal de fluorescence des perles traitées avec 5 g/mL Rhodamine Red-X succinimidyl ester était trop fort pour l'image mCherry-histone (Figure 1D). Nous avons déterminé que l'ester succinimidyl rouge-x de Rhodamine Red-X de 0,5 g/mL est optimal pour cette souche transgénique particulière (Figure 1C).

L'isolement de Blastomere a été effectué selon les procédures montrées dans la figure 4. Les points suivants doivent être abordés pour les expériences réussies. 1) Les médias dans le puits s'évapore au fil du temps et devient visqueux; cela provoque les embryons à coller au capillaire en verre et d'autres embryons, de sorte qu'un nouveau puits avec des médias frais doit être utilisé. 2) Dans la solution d'hypochlorite, les embryons flottent à la surface. Par conséquent, abaisser le grossissement du microscope et se concentrer sur la surface de la gouttelette pour faciliter le transfert des embryons. 3) L'efficacité de la solution d'hypochlorite peut différer. Par conséquent, la durée des embryons dépensés dans la solution d'hypochlorite devrait être testée pour chaque nouveau lot de solution d'hypochlorite faite. 4) Placez la pipette buccale aussi près que possible de l'embryon pour minimiser la force utilisée pour souffler dans la pipette, mais aussi pas trop près de sorte que l'embryon est aspiré ainsi (ce qui est également vrai lors de l'attachement des perles). 5) Après l'enlèvement de coquille d'œuf, les embryons deviennent très délicats. Par conséquent, les forces exercées sur la pipette buccale doivent être légèrement abaissées pour empêcher les embryons d'éclater. 6) L'utilisation prolongée de la pipette buccale peut amortir le filtre PTFE, et 7) les embryons à stade 2 cellules ne devraient être séparés que lorsque le noyau a été clairement formé (Figure 4C, schémas gauches). Comparativement aux cellules d'embryons intacts(figure 4A; droite), les cellules des embryons sans coquille d'œuf semblent plus rondes(figure 4C; droite). De plus, après l'isolement du blastome, la forme des blastomères devient sphérique(figure 4D; droite).

Pour tester les effets de la queue de contact physique-dépendante sur l'orientation de division cellulaire, nous avons attaché des perles enduites de Rhodamine Red-X aux blastomeres AB isolés du stade de 2 cellules et exécutés en direct -- (Figure 6, Figure 7). La perle sans traitement Rhodamine Red-X n'a pas adhéré aux blastomères, suggérant que la Rhodamine Red-X sert à la fois de marqueur de fluorescence et de molécule adhésive. Pour l'analyse de l'orientation de la division cellulaire, nous avons reconstruit en 3D l'image time-lapse en utilisant la fonction « projet 3D » d'ImageJ12 (figure 6A; inclinaison autour de l'axe Y). Pour déterminer l'avion contenant un fuseau mitotique (plan de fuseau), nous avons d'abord identifié un plan où deux centrosomes étaient alignés verticalement(figure 6B; 110 degrés) : l'avion avec un angle de 90 degrés de cet avion est un plan fuseau(figure 6B;-20 degrés). Ensuite, nous avons mesuré l'angle de fuseau (orientation du fuseau) par rapport à l'interface de contact de perle cellulaire (orientation de contact) après cytokinesis (figure 6C). Lorsque les deux cellules filles étaient attachées à la perle, une ligne qui passe les deux sites de contact a été utilisée comme orientation de contact.

Dans notre étude précédente, nous avons identifié un flux de myosine de surface de cellules anisotropes pendant l'orientation de division de cellules d'AB perlée-induite10. Cependant, il est difficile de mesurer le flux intracellulaire de myosine pendant que la cellule se déplace pendant la division orientée. Pour ce faire, nous avons d'abord sélectionné les échantillons avec fuseau aligné sur le plan d'imagerie (avion xy) (Figure 7). Deuxièmement, les piles Z ont été projetées à l'aide d'une méthode de projection maximale(figure 7). Troisièmement, les mouvements cellulaires ont été corrigés à l'aide de l'algorithme d'enregistrement sous-pixel Stack reg plug-in13 de ImageJ avec option corps rigide (Figure 7B). Par l'enregistrement des images, la position de la cellule était stable (figure 7B). Enfin, en utilisant le suivi manuel plug-in d'ImageJ, les foyers de myosine ont été suivis (Figure 7C). Selon les informations de coordonnées, les vitesses de la myosine le long de l'axe de division, et l'axe perpendiculaire à celui-ci ont été calculés dans les 50 s après le début de la cytokinesis.

Figure 1
Figure 1 : Détermination de la concentration de Rhodamine Red-X. (A-D) Des embryons exprimant gFP-myosin (vert) et mCherry-histone (magenta) ont été placés à proximité de perles liées à différentes concentrations de Rhodamine Red-X (magenta). Les intensités de signal de mCherry et Rhodamine Red-X sont tracées le long des lignes pointillées blanches (graphiques de fond). Les perles et les signaux histones ont été clairement détectés pour les perles traitées avec 0,5 g/mL Rhodamine Red-X. Les barres d'échelle s'affichent à 10 m. Veuillez cliquer ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.

Figure 2
Figure 2 : Assemblage de la pipette buccale. La pipette de bouche est assemblée en connectant les tubes étroits (1) et larges (2) de Tygon avec un filtre de PTFE (3). À l'extrémité du tube étroit et large de Tygon, le support capillaire (4) et le morceau de bouche (5) ont été attachés, respectivement. Un capillaire en verre dessiné à la main (6) peut être inséré dans le support capillaire. La barre d'échelle est de 50 mm. Veuillez cliquer ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.

Figure 3
Figure 3 : Isolement de Blastomere. (A) Tirage manuel du capillaire en verre. (B) Capillaire en verre dessiné à la main pour le transfert d'embryons. (C) Capillaire en verre dessiné à la main pour l'enlèvement des coquilles d'œufs. (D) Schémas indiquant la taille appropriée de l'ouverture capillaire pour l'enlèvement de la coquille d'œuf. Les flèches indiquent les embryons. Les barres d'échelle s'affichent à 100 m. Veuillez cliquer ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.

Figure 4
Figure 4 : Flux de travail d'isolement Blastomere. (A) Dissection de C. elegans adulte dans un tampon de sel d'œuf pour obtenir des embryons. Les photographies montrent des embryons à stade de 2 cellules et de 4 cellules avant l'ablation de la coquille d'œuf. (B) Traitement et lavage à l'hypochlorite. (C) Les schémas décrivent le moment approprié pour l'enlèvement des coquilles d'œufs. La photographie montre un embryon de stade à 4 cellules après l'enlèvement de coquille d'œuf. (D) Séparation blastomere. La photographie montre un embryon séparé de phase à deux cellules. Les tailles des flèches en C et D indiquent les forces relatives requises lors du tuyauterie. Les barres d'échelle s'affichent à 50 m. Veuillez cliquer ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.

Figure 5
Figure 5 : Assemblée de la chambre d'imagerie. (A) Fixation de la couverture sur le support de la couverture. (B) Images d'un support de couverture. Le support de la feuille de couverture avant et après l'assemblage est indiqué à gauche et à droite, respectivement. (C) Un cercle dessiné par un stylo hydrophobe. (D) Ajout du milieu de croissance de Shelton et de l'échantillon dans le cercle. (E) Montage d'une glissière de couverture pour éviter l'évaporation. Les barres d'échelle affichent 50 mm. Veuillez cliquer ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.

Figure 6
Figure 6 : Analyse de l'orientation de la division cellulaire. (A) Un diagramme de l'analyse d'orientation de division cellulaire. (B) Détermination du plan fuseau. Les images de gauche montrent un exemple d'échantillon. Des films 4D reconstruits en 3D ont été tournés autour de l'axe Y pour déterminer le plan dans lequel deux centrosomes s'alignent verticalement (image de droite ; schémas supérieurs droits). Dans cet exemple, le plan de fuseau est de 90 degrés de 110 degrés (image du milieu; schémas du bas droit). (C) Mesure de l'orientation du fuseau par rapport au contact de perle de cellule. À l'aide d'images du plan fuseau, l'orientation du fuseau après la cytokinésie a été déterminée en fonction de l'angle entre les lignes reliant deux centrosomes (lignes pointillées oranges dans les schémas droits) et le contact cellulaire (lignes pointillées bleues). Lorsque les deux cellules filles étaient attachées aux perles, l'orientation de contact de perle de cellule était la ligne qui passe les deux emplacements de contact. Le vert est myosin et centrosome, magenta est histone et perles. Les barres d'échelle sont de 10 m. Les temps sont minutes et secondes. Veuillez cliquer ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.

Figure 7
Figure 7 : Analyse du flux de myosine. (A) Un diagramme de l'analyse du débit de myosine. (B) Correction de l'orientation de la division cellulaire. Pour quantifier la dynamique intracellulaire du flux de myosine, la rotation de la cellule de division a été corrigée à l'aide de l'imageJ plugin Stack reg (Option de corps rigide). Les images supérieures et inférieures sont avant et après le traitement de la reg Stack. Droite la plupart des images montrent le code de couleur temporelle des séries chronologiques. (C) Suivi des foyers de myosine. À l'aide des images traitées par Stack reg, les mouvements individuels de myosin eontci ont été suivis par le plugin de suivi manuel ImageJ. L'axe de division et l'axe perpendiculaire à celui-ci ont été définis comme x et y, respectivement (schémas droits). Les vitesses d'écoulement de la myosine dans l'axe x et y (Vx et Vy) ont été mesurées en fonction des informations de coordonnées. Les barres d'échelle sont de 10 m. Les temps sont minutes et secondes. Veuillez cliquer ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.

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Discussion

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La reconstitution des modèles simplifiés de contact cellulaire permettra aux chercheurs de tester les rôles de modèles de contact cellulaire spécifiques dans différents aspects de la morphogénèse. Nous avons utilisé cette technique pour montrer que l'axe de division cellulaire est contrôlé par le contact physique avec des perles adhésives10. Comme la spécification de l'axe de division est cruciale pour le développement multicellulaire en contribuant à la morphogénèse14, division de cellules souches15,16, et l'homéostasie tissulaire15,16, cette méthode devrait être en mesure d'éclairer un nouveau mécanisme de formation de tissu animal.

En plus de l'orientation de division cellulaire, cette méthode a le potentiel d'être une plate-forme pour tester la relation entre les indices mécaniques et le destin cellulaire. Des études antérieures ont rapporté que le signal mécanique contrôle la spécification de destin de cellule. Les cellules souches mésenchymales humaines se différencient en neurones, adipocytes, cellules musculaires squelettiques et ostéoblastelorsqus lorsqu'elles sont cultivées dans un substrat avec une rigidité différente17. En réponse à la rigidité du substrat, les régulateurs transcriptionnels Yes-associated protein (YAP) et TAZ (co-activateur transcriptionnel avec motif liant PDZ) se translocaliseront au noyau, pour réguler la spécification du destin cellulaire18. La méthode présentée dans cet article devrait également être utile pour tester le rôle des indices mécaniques sur la spécification de destin de cellule, en creintant la cellule à long terme en contact avec des perles adhésives.

Cette méthode a des limites dans la récapitulation de certains indices mécaniques observés in vivo. Dans C. elegans, la coquille d'œuf chitineuse et la barrière de perméabilité servent de contrainte physique. Bien que l'enlèvement de la coquille d'œuf n'affecte pas le développement normal, l'élimination de la coquille d'œuf et de la barrière de perméabilité entraîne une formation de modèle anormale19. En l'absence de la coquille d'oeuf et de la barrière de perméabilité, la forme de cellules devient plus sphérique, suggérant que la pression entre les cellules et la coquille d'oeufs de cellules joue un rôle critique dans la déformation et le modelage de cellules. En effet, des forces de compression cellulaire ont été proposées pour réguler l'orientation de la division cellulaire20. Sans avoir une contrainte physique et une pression putative entre les tissus, nous nous attendons à ce que cette méthode ne puisse pas non plus récapituler la zone de contact cellulaire in vivo. Comme la zone de contact cellulaire est connue pour affecter la signalisation Notch21, cette limitation doit être examinée plus en détail lorsque certains indices mécaniques ou chimiques ne fonctionne pas en utilisant cette méthode in vitro.

Nous avons jusqu'ici testé l'orientation de division cellulaire de l'AB, P1, EMS, P2, ABa, cellules ABp (cellules jusqu'à 6 stades cellulaires) dans nos mains10, mais la méthode peut être appliquée au développement ultérieur dans la mesure où la cellule individuelle peut être isolée. Une étude récente sur le séquençage d'une seule cellule a utilisé la digestion pronase du corps des vers pour isoler la cellule larvaire22. Par conséquent, potentiellement on peut employer le traitement de pronase pour isoler les cellules embryonnaires et les cellules larvaires de stade postérieur.

Dans cette étude, nous avons montré l'exemple de l'interaction entre le signal mécanique et l'orientation de division cellulaire, mais la communication de cellule-cellule est également négociée par des indices chimiques tels que Wnt23, Notch24, récepteurs couplés d'adhérence25 et ainsi de suite. Fait important, la méthode de préparation des perles présentée ici peut coupler les perles avec des protéines, permettant ainsi la reconstitution des indices chimiques. Des études antérieures ont également utilisé la perle de Sepharose26 et la protéine A perle magnétique27 enduit e de protéines Wnt pour démontrer les processus de développement dépendants de Wnt. Cependant, ces perles ne sont pas disponibles dans le commerce dans différentes tailles comparées aux perles modifiées de polystyrène de carboxylate. Par conséquent, la recherche future peut utiliser la méthode présentée comme une plate-forme pour tester le rôle des indices chimiques et physiques de manière plus réglable. Pris ensemble, cette méthode est adaptée pour les chercheurs, qui étudient les comportements cellulaires et les réponses qui résultent de modèles de contact cellulaire spatial et souhaitent éliminer d'autres indices cellulaires.

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Disclosures

Les auteurs ne déclarent aucun conflit d'intérêts.

Acknowledgments

Nous remercions James Priess et Bruce Bowerman pour leurs conseils et leur fourniture de souches c. elegans, Don Moerman, Kota Mizumoto et Life Sciences Institute Imaging Core Facility pour le partage d'équipement et de réactifs, Aoi Hiroyasu, Lisa Fernando, Min Jee Kim pour l'entretien de C. elegans et la lecture critique de notre manuscrit. Notre travail est appuyé par le Conseil de recherches en sciences naturelles et en génie du Canada (CRSNG) (RGPIN-2019-04442).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
1-(3-Dimethylaminopropyl)-3-ethylcarbodiimide hydrochloride Alfa Aesar AAA1080703 For the bead preparation
Aspirator Tube Assembly Drummond 21-180-13 For the blastomere isolation.
Caenorhabditis elegans strain: N2, wild-type Caenorhabditis Genetics Center N2 Strain used in this study
Caenorhabditis elegans strain: KSG5, genotype: zuIs45; itIs37 in house KSG5 Strain used in this study
Calibrated Mircopipets, 10 µL Drummond 21-180-13 For the blastomere isolation
Carboxylate-modified polystyrene beads (30 µm diameter) KISKER Biotech PPS-30.0COOHP For the bead preparation
CD Lipid Concentrate Life Technologies 11905031 For the blastomere isolation. Work in the tissue culture hood.
Clorox Clorox N. A. For the blastomere isolation. Open a new bottle when the hypochlorite treatment does not work well.
Coverslip holder In house N.A. For the blastomere isolation.
Dissecting microscope: Zeiss Stemi 508 with M stand. Source of light is built-in LED. Magnification of eye piece is 10X. Carl Zeiss Stemi 508 For the blastomere isolation.
Fetal Bovine Serum, Qualified One Shot, Canada origin Gibco A3160701 For the blastomere isolation. Work in the tissue culture hood.
General Use and Precision Glide Hypodermic Needles, 25 gauge BD 14-826AA For the blastomere isolation
Inulin Alfa Aesar AAA1842509 For the blastomere isolation
MEM Vitamin Solution (100x) Gibco 11120052 For the blastomere isolation.
MES (Fine White Crystals) Fisher BioReagents BP300-100 For the bead preparation
Multitest Slide 10 Well MP Biomedicals ICN6041805 For the blastomere isolation
PBS, Phosphate Buffered Saline, 10 x Powder Fisher BioReagents BP665-1 For the bead preparation
Penicillin-Streptomycin (10,000 U/mL) Gibco 15140148 For the blastomere isolation.
Polyvinylpyrrolidone Fisher BioReagents BP431-100 For the blastomere isolation
Potassium Chloride Bioshop POC888 For the blastomere isolation
Rhodamine Red-X, Succinimidyl Ester, 5-isomer Molecular Probes R6160 For the bead preparation
Schneider’s Drosophila Sterile Medium Gibco 21720024 For the blastomere isolation. Work in the tissue culture hood.
Sodium Chloride Bioshop SOD001 For the blastomere isolation
Sodium Hydroxide Solution, 10 N Fisher Chemical SS255-1 For the blastomere isolation
Spinning disk confocal microscope: Yokogawa CSU-X1, Zeiss Axiovert inverted scope, Quant EM 512 camera, 63X NA 1.4 Plan apochromat objective lens. System was controlled by Slidebook 6.0. Intelligent Imaging Innovation N.A. For live-imaging
Syringe Filters, PTFE, Non-Sterile Basix 13100115 For the blastomere isolation.
Tygon S3 Laboratory Tubing,, Formulation E-3603, Inner diameter 3.175 mm Saint Gobain Performance Plastics 89403-862 For the blastomere isolation.
Tygon S3 Laboratory Tubing,, Formulation E-3603, Inner diameter 6.35 mm Saint Gobain Performance Plastics 89403-854 For the blastomere isolation.

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References

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In Vitro Reconstitution of Spatial Cell Contact Patterns with Isolated <em>Caenorhabditis elegans</em> Embryo Blastomeres and Adhesive Polystyrene Beads
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Hsu, C. R., Xiong, R., Sugioka, K. In Vitro Reconstitution of Spatial Cell Contact Patterns with Isolated Caenorhabditis elegans Embryo Blastomeres and Adhesive Polystyrene Beads. J. Vis. Exp. (153), e60422, doi:10.3791/60422 (2019).More

Hsu, C. R., Xiong, R., Sugioka, K. In Vitro Reconstitution of Spatial Cell Contact Patterns with Isolated Caenorhabditis elegans Embryo Blastomeres and Adhesive Polystyrene Beads. J. Vis. Exp. (153), e60422, doi:10.3791/60422 (2019).

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