Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove

Developmental Biology

In vitro-rekonstituering av romlig celle kontakt mønstre med isolert Caenorhabditis elegans embryo Blastomeres og selvklebende polystyren perler

doi: 10.3791/60422 Published: November 26, 2019

Summary

Tissue kompleksiteten i flercellede systemer forvirre identifisering av årsakssammenheng mellom ekstracellulære signaler og individuell mobilnettet atferd. Her presenterer vi en metode for å studere direkte kobling mellom kontakt-avhengige signaler og divisjon akser ved hjelp av C. elegans embryo blastomeres og selvklebende polystyren perler.

Abstract

I flercellede systemer, individuelle celler er omgitt av ulike fysiske og kjemiske signaler som kommer fra naboceller og miljø. Dette vevet kompleksitet forundrer identifisering av årsakssammenheng mellom ytre signaler og cellulær dynamikk. En syntetisk rekonstituert flercellede system overvinner dette problemet ved å la forskere til å teste for en bestemt stikkordet mens eliminere andre. Her presenterer vi en metode for å Rekonstituer celle kontakt mønstre med isolerte Caenorhabditis elegans blastomere og selvklebende polystyren perler. Prosedyrene innebærer eggeskall fjerning, blastomere isolasjon ved å forstyrre celle-celle vedheft, utarbeidelse av selvklebende polystyren perler, og rekonstituering av celle-celle eller celle-perle kontakt. Til slutt presenterer vi anvendelsen av denne metoden for å undersøke orienteringen av mobilnettet divisjon akser som bidrar til regulering av romlige cellulære mønstre og celle skjebne spesifikasjon i å utvikle embryo. Denne robuste, reproduserbar og allsidig in vitro-metoden gjør det mulig å studere direkte relasjoner mellom kontakt mønstre for romlige celler og cellulære svar.

Introduction

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

Under flercellede utvikling, mobilnettet atferd (f. eks divisjon akse) av individuelle celler er spesifisert av ulike kjemiske og fysiske signaler. For å forstå hvordan enkelte celle tolker denne informasjonen, og hvordan de regulerer flercellede forsamlingen som en emergent eiendom er et av de ultimate målene for morphogenesis studier. Modellen organisme C. elegans har bidratt betydelig til forståelsen av celle-nivåregulering av morphogenesis som celle polaritet1, celle divisjon mønster1, celle skjebne beslutning2, og vevs-skala forskrifter som neuronal kabling3 og organogenesen4,5. Selv om det finnes ulike genetiske verktøy tilgjengelig, vev engineering metoder er begrenset.

Den mest vellykkede vev engineering metode i C. elegans studien er den klassiske blastomere isolasjon6; som C. elegans embryo er omgitt av en eggeskall og en permeabilitet barriere7, er deres fjerning en av de viktigste prosedyrene for denne metoden. Selv om denne blastomere isolasjons metoden muliggjør rekonstituering av celle celle kontakt på en forenklet måte, tillater den ikke eliminering av uønskede stikkord. celle kontakt fortsatt utgjør både mekanisk (for eksempel vedheft) og kjemiske signaler, og dermed begrense vår evne til å fullt ut analysere årsakssammenheng forholdet mellom stikkordet og cellulære atferd.

Metoden som presenteres i denne utredningen bruker carboxylat modifiserte polystyren perler som kan covalently binde til noen Amin-reaktive molekyler inkludert proteiner som ligander. Spesielt brukte vi en Amin-reaktiv form av Rhodamine Red-X som en ligand å lage perler både visuelt sporbar og lim til cellen. Den kar bok syl grupper av perle overflaten og primære Amin grupper av ligand molekyl er ledsaget av vannløselige carbodiimide 1-etanol-3-(dimethylaminopropyl) carbodiimide (EDAC)8,9. Innhentet selvklebende perler tillate virkningene av den mekaniske stikkordet på mobilnettet dynamikk10. Vi har brukt denne teknikken for å identifisere mekaniske signaler som kreves for celledeling orientering10.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

1. utarbeidelse av selvklebende polystyren perle

Merk: denne protokollen krever ikke aseptisk teknikk.

  1. Veie 10 mg carboxylat modifiserte polystyren perler i en 1,5 mL mikrosentrifugen tube.
  2. For å vaske perlene, tilsett 1 mL 2-(N-morpholino) ethanesulfonic syre (MES) buffer inn i røret. Siden MES buffer ikke inneholder fosfat og acetate, som kan redusere reaktivitet av carbodiimide, er det egnet til bruk i protein kopling reaksjon. Vortex røret for å blande perlene.
  3. Snurr røret for 60 s ved 2 000 x g via en stasjonære sentrifuge.
  4. Kast supernatanten ved å pipettering forsiktig ut bufferen.
  5. Vask perlene igjen med 1 mL MES-buffer ved å følge trinn 1,2 til 1.4.
  6. Tilsett 1 mL MES-buffer som inneholder 10 mg EDAC i røret for å aktivere overflaten kar bok syl grupper. Vortex røret for å blande perlene.
  7. Roter og ruge røret i 15 minutter ved romtemperatur.
  8. Snurr ned perlene for 60 s ved 2 000 x g.
  9. Kast supernatanten ved å pipettering forsiktig ut bufferen.
  10. For å vaske perlene, tilsett 1 mL fosfat bufret saltvann (PBS) inn i røret. Vortex røret for å blande perlene.
  11. Snurr ned røret for 60 s ved 2 000 x g.
  12. Kast supernatanten ved å pipettering forsiktig ut bufferen.
  13. Vask perlene igjen med 1 mL PBS ved å følge trinn 1.10-1.12.
  14. Den endelige konsentrasjonen av Rhodamine brukes vil avhenge av belastningen blir avbildet. Forbered 1 mL 1-, 10-, 100-, og 1000-fold fortynning serie av Rhodamine Red-X fra 0,65 mM Rhodamine Red-X lagerløsning.
  15. Pipetter 20 μL av perler i hver serie fortynning tube.
  16. Roter og ruge røret i 5 minutter ved romtemperatur.
  17. Vask perlene to ganger med 1 mL PBS ved å gjenta trinnene 1.10-1.12.
  18. Tilsett 1 mL PBS i røret og oppbevar den ved 4 ° c i opptil 6 uker. Kontroller den fluorescens intensiteten i perlene under et mikroskop som brukes til levende bilder. Den aktuelle konsentrasjonen av Rhodamine Red-X succinimidyl Ester er avhengig av bilde forholdene (figur 1).
    Merk: perler uten Rhodamine rød-X behandling ikke holder seg til cellen. Rhodamine Red-X fungerer som fluorescens markør, samt selvklebende molekyl. Den elektro statisk interaksjon mellom positivt ladet Rhodamine rød-X og negativt ladet plasma membran er en antatte årsak til vedheft.

2. montering av munn pipette

  1. Skjær bred (6,35 mm indre diameter) og smal (3,175 mm indre diameter) Tygon rør til ca 25 cm og 40 cm i lengde, henholdsvis (figur 2).
  2. Koble Tygon tuber med et polytetrafluoretylen (PTFE) filter (0,2 μm pore størrelse) (figur 2).
  3. Demonter et kommersielt tilgjengelig aspirator rør og fest kapillær holderen og munnstykket til enden av de smale og brede Tygon-rørene (figur 2).
    Merk: PTFE-filter ble brukt for å hindre inhalering av røyk av natriumhypokloritt oppløsning via munn pipette.

3. isolering av embryo blastomere

Merk: Bruk hansker og Laboratoriefrakk for å unngå kutt og kontakt med bleke løsningen.

  1. Hold hver ende av en microcapillary (kapasitet; 10 μL) med høyre og venstre hånd.
  2. Trekk microcapillary mot begge ender for å påføre spenning og ta sentrum av kapillær over en brenner for å lage to hånd-trukket blodkar (Figur 3a).
  3. Trim tips av hånd-trakk blodkar med pinsett under dissekere mikroskop og fest dratt kapillær i en munn pipettering apparater (figur 2). Klargjør to typer pipetter. Spissen for åpnings størrelsene for Pipetter bør være omtrent 2x og 1x kort akse lengde på C. elegans embryo (30 μm) for overføring av embryo og eggeskall fjerning, henholdsvis Figur 3B-D).
  4. Pipetter 45 μL av egg saltløsning på en brønn av et multiwell lysbilde (Figur 4a; bunn).
  5. Plasser 5-10 voksen C. elegans på en brønn som inneholder egg saltløsning.
  6. For å få tidlig C. elegans embryo, kuttet voksne i biter ved å plassere to nåler til høyre og venstre for c. elegans kropp og skyve nålene forbi hverandre (Figur 4A; øvre skjematisk).
  7. Pipetter 45 μL av natriumhypokloritt løsning på en brønn ved siden av brønnen som inneholder egg saltoppløsning (fig. 4B).
  8. Pipetter 45 μL av Shelton vekstmedium på de påfølgende tre brønner ved siden av brønnen inneholder natriumhypokloritt løsning (Figur 4B).
  9. Overfør 1-celle-scenen og tidlig 2-cellers etappe embryo inn i den natriumhypokloritt løsningen ved å pipettering med hånd-tegnet kapillær for embryo overføring (Figur 4B).
  10. Vent i 40 – 55 s.
  11. Vask embryo ved å overføre embryo fra natriumhypokloritt løsning i Shelton vekstmedium ved munnen pipettering med hånd-tegnet kapillær for embryo overføring (Figur 4B).
  12. Vask embryo igjen ved å overføre embryo inn i en ny brønn av Shelton vekstmedium ved munnen pipettering med hånd-tegnet kapillær for embryo overføring (Figur 4B).
  13. Overfør den vasket embryo inn i en ny brønn av Shelton vekstmedium ved munnen pipettering med hånd-tegnet kapillær for embryo overføring. Bruk håndtegnet kapillær for fjerning av eggeskall, gjenta pipettering nøye (Figur 4C; midtre skjematisk). Hvis eggeskall er vellykket fjernet, vil de embryonale cellene bli mer sfærisk (Figur 4C; høyre).
  14. Skill 2-cellers stadium embryonale blastomeres ved forsiktig og kontinuerlig pipettering med hånd-tegnet kapillær for eggeskall fjerning (Figur 4D).

4. rekonstituering av kontakt mønstre med blastomere og perle

Merk: arbeid under bilde mikroskop for å unngå dissosiasjon av en celle fra en perle, og for å lette bilde oppkjøpet i tide.

  1. For å observere ved hjelp av et omvendt mikroskop, forberede et bilde kammer som i figur 5.
    1. Sett en dekkglass på en dekkglass holder (figur 5a).
    2. Tape kantene på dekkglass å stabilisere den. Siden med tape er "tilbake"-siden (figur 5A, B).
    3. Vend dekkglass holde ren over til ' front '-siden og tegn en sirkel på dekkglass med en hydrofobe penn (figur 5C).
      Merk: enhver glass-bunn parabolen fungerer også, forutsatt at embryo er manipulatable av munnen pipette.
  2. Legg Shelton vekstmedium i sirkelen tegnet av hydrofobe markør (figur 5D).
  3. Overfør de isolerte blastomere til bilde kammeret.
  4. Dispensere et lite volum av de kjemisk funksjonalisert perlene ved hjelp av hånd-tegnet kapillær for embryo overføring.
  5. Kontrollere plasseringen av polystyren perler ved å blåse inn i hånd-tegnet kapillær til perlen festes til den isolerte blastomere.
  6. Monter en dekkglass for å unngå fordampning av medium (figur 5E). Utfør Live bildebehandling.

5. utarbeidelse av viktige reagenser

  1. Egg salt løsning (10 mL): Kombiner 235 μL av 5 M NaCl og 240 μL av 2 M KCl med 9525 μL av dH2O.
  2. Natriumhypokloritt løsning (10 mL): Kombiner 7,5 mL Clorox (inneholdende ca. 7,5% natrium natriumhypokloritt) med 2,5 mL 10 N NaOH (endelig konsentrasjon av natrium natriumhypokloritt er ca. 5,625%).
    Merk: selv om mange publiserte metoder har brukt chitinase til å fordøye chitinous eggeskall, har vi vedtatt en metode som bruker natriumhypokloritt løsning11. Ved å unngå de batch-til-batch-variantene av chitinase aktiviteter, mener vi at denne metoden er mer reproduserbar og kostnadseffektiv tilnærming.
  3. 0,81 mM inulin oppløsning (40 mL)
    1. Legg 0,2 g inulin til 40 mL av dH2O.
    2. Autoklav å oppløse.
      Merk: holder for 1 måned ved 4 ° c.
  4. 0,5 M-buffer for MES (500 mL)
    1. Løs opp 48,81 g av MES i 400 mL destillert vann (dH2O).
    2. Juster pH til 6,0.
    3. Bring det totale volumet til 500 mL med dH2O.
  5. PBS-løsning (1 L)
    1. For å gjøre 10-fold PBS løsning, oppløse 1 pakke av PBS Premix pulver i 1 L av dH2O.
    2. Kombiner 100 mL med en 10-fold PBS-løsning med 900 mL dH2O.
  6. 5% polyvinylpyrrolidon (PVP) løsning (4 mL)
    1. Under sterile forhold, oppløse 0,2 g av PVP i 4 mL Drosophila Schneider ' s medium.
      Merk: alltid åpne Schneider ' s medium lager i vev kultur (TC) hette. Oppbevares i 1 måned ved 4 ° c.
  7. 0,65 mM Rhodamine lagerløsning (2 mL)
    1. Veie 1 mg Rhodamine rød-X.
    2. Tilsett 2 mL dimethyl sulfoxide (DMSO) for å oppløse.
    3. Alikvot og oppbevares ved-20 ° c.
  8. Shelton vekst medium (SGM) (10,25 mL)
    1. Under sterile forhold, kombinere 8 mL Drosophila Schneider ' s medium, 1 mL PVP løsning, 1 mL inulin løsning, 1 mL basal medium Eagle (BME) vitaminer, 50 μL av penicillin-Streptomycin, og 100 μL av lipid konsentrat sammen.
    2. Alikvot 325 μL av SGM i 1,5 mL mikrorør.
      NB: oppbevares i ca. 1 måned ved 4 ° c.
    3. På dagen for blastomere isolasjon, tilsett 175 μL av fosterets storfe serum (FBS) til SGM (for totalt volum på 500 μL).
      Merk: Oppbevar FBS ved-20 ° c og Tin den før bruk. FBS trenger ikke å bli varme drept.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

For fremstilling av perler, bestemte vi den optimale mengden av Rhodamine Red-X succinimidyl Ester for transgene-belastningen som uttrykker GFP-myosin II og mCherry-histone (figur 1A-D). Vi brukte mCherry tagget histone som en markør for celle syklus progresjon. Fordi både Rhodamine Red-X og mCherry vil bli opplyst av en 561 NM laser, den optimale intensiteten av Rhodamine Red-X signal er sammenlignbare med histone å tillate samtidig Imaging av celle og perle. For eksempel var fluorescens signalet fra perlen behandlet med 0,005 μg/mL Rhodamine Red-X succinimidyl Ester var for svakt til å visualisere perlen (figur 1A). På den annen side, fluorescens signalet fra perlene behandlet med 5 μg/mL Rhodamine Red-X succinimidyl Ester var for sterk til bildet mCherry-histone (figur 1D). Vi har fastslått at 0,5 μg/mL Rhodamine rød-X succinimidyl Ester er optimal for denne bestemte transgene-belastningen (figur 1C).

Blastomere isolasjon ble utført i henhold til prosedyrene vist i Figur 4. Følgende punkter bør rettes for vellykkede eksperimenter. 1) mediene i brønnen fordamper over tid og blir tyktflytende; Dette fører til at embryo å holde seg til glasset kapillær og andre embryo, så en ny brønn med ferske medier må brukes. 2) i den natriumhypokloritt løsningen, embryo flyte til overflaten. Derfor senke forstørrelsen av mikroskopet og fokusere på overflaten av dråpe for å lette med overføring av embryo. 3) effektiviteten av natriumhypokloritt løsning kan variere. Herav, varigheten av Foster bruke inne natriumhypokloritt løsning burde være testet for hver ny bakst av natriumhypokloritt løsning fremstilt. 4) plasser munn pipette så nær fosteret som mulig for å minimere styrken som brukes til å blåse inn i pipette, men også ikke for nær slik at fosteret blir sugd opp også (dette er også sant når du fester perler). 5) etter eggeskall fjerning, embryo blitt svært delikat. Derfor må krefter som utøves på munnen pipette være litt senket for å hindre embryo fra sprengning. 6) langvarig bruk av dråpetelleren kan dempe PTFE-filteret, og 7) 2-cellers embryo bør bare skilles når kjernen er klart formet (Figur 4C, venstre skjematisk). Sammenlignet med cellene i intakt embryo (Figur 4A; høyre), celler i embryo uten eggeskall ser avrundet (Figur 4C; høyre). I tillegg, etter blastomere isolasjon, blir formen av blastomeres sfærisk (Figur 4D; høyre).

For å teste effekten av fysisk kontakt avhengig Cue på celledeling orientering, vi festet Rhodamine Red-X belagt perler til AB blastomeres isolert fra 2-cellers scene og utført Live-Imaging (figur 6, figur 7). Perlen uten Rhodamine Red-X behandling ikke overholder blastomeres, noe som tyder på at Rhodamine Red-X fungerer som en både fluorescens markør og lim molekyl. For analyse av celledeling orientering, har vi 3D rekonstruert tidsforløp bildet ved hjelp av "3D-prosjekt"-funksjonen til ImageJ12 (figur 6A; vippe rundt Y-aksen). For å bestemme flyet som inneholder mitotisk spindel (spindel fly), vi først identifisert et fly der to centrosomes var vertikalt justert (figur 6b; 110 °): flyet med ± 90 ° vinkel på dette flyet er spindel fly (figur 6b;-20 °). Deretter har vi målt vinkelen på spindelen (spindel orientering) i forhold til celle-perle kontakt grensesnittet (kontakt orientering) etter cytokinesi (figur 6C). Når begge datter cellene var knyttet til perlen, ble en linje som sender begge kontaktområdene, brukt som en kontakt orientering.

I vår forrige studie, har vi identifisert en Anisotrop celle overflate myosin Flow under perle-indusert AB celledeling orientering10. Det er imidlertid vanskelig å måle intracellulære myosin flyt som cellen beveger seg under orientert divisjon. For å utføre dette, først har vi valgt prøvene med spindel justert til Imaging Plane (XY fly) (figur 7). For det andre ble Z-stabler projisert med maksimal projeksjons metode (figur 7). Tredje, celle bevegelser ble korrigert ved hjelp av underpiksel registrering algoritmen stack reg plug-in13 av ImageJ med rigid Body alternativet (figur 7B). Ved registrering av bilder, var plasseringen av cellen stabile (figur 7B). Til slutt, ved hjelp av manuell sporing plug-in av ImageJ, myosin prioriteringer ble sporet (figur 7C). I henhold til koordinat informasjon, hastigheter av myosin langs divisjon akse, og aksen vinkelrett på den ble beregnet innen 50 s etter cytokinesi utbruddet.

Figure 1
Figur 1: bestemmelse av Rhodamine rød-X-konsentrasjon. (A-D) Embryo uttrykker GFP-myosin (grønn) og mCherry-histone (magenta) ble plassert i nærheten av perler bundet med ulike konsentrasjoner av Rhodamine rød-X (magenta). Signalet intensitet av mCherry og Rhodamine rød-X er plottet langs den hvite stiplede linjer (nederst grafer). Perlene og histone signalene ble klart oppdaget for perler behandlet med 0,5 μg/mL Rhodamine rød-X. Skala barer viser 10 μm. Vennligst klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Figure 2
Figur 2: montering av munn pipette. Munn pipette monteres ved å koble smale (1) og brede (2) Tygon rør med et PTFE-filter (3). På slutten av den smale og brede Tygon tube, kapillær holderen (4) og munn stykke (5) var festet, henholdsvis. En håndtegnet glass kapillær (6) kan settes inn i kapillær holderen. Scale bar er 50 mm. Vennligst klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Figure 3
Figur 3: Blastomere isolering. (A) hånd trekking av glass kapillær. (B) håndtegnet glass kapillær for embryo overføring. (C) håndtegnet glass kapillær for eggeskall fjerning. (D) skjematisk viser riktig størrelse av kapillær åpning for eggeskall fjerning. Piler indikerer embryo. Skala barer viser 100 μm. Vennligst klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Figure 4
Figur 4: Blastomere isolasjons arbeidsflyt. (A) Disseksjon av voksen C. elegans i egg salt buffer for å få embryo. Fotografier viser embryo med to og fire celler før eggeskall fjernes. (B) natriumhypokloritt behandling og vasking. (C) skjematisk avbilde det passende beregner for eggeskall flytting. Fotografiet viser en 4-cellers stadium embryo etter eggeskall fjerning. (D) Blastomere separasjon. Fotografiet viser et atskilt 2-cellers stadium embryo. Størrelsene på pilene i C og D indikerer de relative kreftene som kreves under pipettering. Skala barer viser 50 μm. Vennligst klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Figure 5
Figur 5: montering av bilde kammer. (A) feste dekkglass til dekkglass holderen. (B) bilder av en dekkglass holder. Dekkglass holder før og etter montering er indikert på henholdsvis venstre og høyre. (C) en sirkel trukket via en hydrofobe penn. (D) tillegg av Shelton vekstmedium og prøve i sirkelen. (E) montering av dekkglass for å unngå fordamping. Skala barer viser 50 mm. Vennligst klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Figure 6
Figur 6: analyse av celledeling orientering. (A) et diagram av celledeling orientering analyse. (B) bestemmelse av spindel fly. Venstre bilder viser et eksempel på en prøve. 3D rekonstruert 4-D filmer ble rotert rundt Y-aksen for å bestemme flyet der to centrosomes justere vertikalt (høyre bilde; høyre øvre skjematisk). I dette eksempelet er spindel planet ± 90 ° av 110 ° (midtre bilde; høyre skjema). (C) måling av spindel orientering i forhold til celle-perle kontakt. Bruk av bilder av spindel planet, spindel retning etter cytokinesi ble fastslått basert på vinkelen mellom linjene som forbinder to centrosomes (oransje stiplede linjer i høyre skjematisk) og celle kontakt (blå stiplede linjer). Når begge datter celler var festet til perlene, celle-perle kontakt orientering var den linjen som passerer både kontaktnett steder. Grønn er myosin og centrosome, magenta er histone og perler. Skala barer er 10 μm. tidene er minutter og sekunder. Vennligst klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Figure 7
Figur 7: analyse av myosin flyt. (A) et diagram over myosin flyt analyse. (B) korrigering av celledeling orientering. For å kvantifisere intracellulære myosin Flow dynamikk, ble rotasjonen av dele celle korrigert ved hjelp av ImageJ plugin stack reg (rigid Body alternativet). Øvre og nedre bilder er før og etter stack reg-behandlingen. Høyre de fleste bildene viser Temporal fargekode av tidsserier. (C) sporing av myosin prioriteringer. Bruke bildene behandles av stack reg, individuelle myosin fokus bevegelser ble sporet av ImageJ manuell sporing plugin. Divisjon akse og aksen vinkelrett på den ble definert som x og y, henholdsvis (høyre skjematisk). Myosin strømningshastigheter i x og y-aksen (VX og Vy) ble målt i henhold til koordinat informasjonen. Skala barer er 10 μm. tidene er minutter og sekunder. Vennligst klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

Rekonstituering av forenklet celle kontakt mønstre vil la forskere til å teste rollene til spesifikke celle kontakt mønstre i ulike aspekter av morphogenesis. Vi har brukt denne teknikken til å vise at celledeling aksen styres av den fysiske kontakten med selvklebende perler10. Som Division Axis spesifikasjonen er avgjørende for flercellede utvikling ved å bidra tilmorphogenesis 14, stilk cellendivisjon 15,16, og vev homeostase15,16, bør denne metoden være i stand til å belyse en ny mekanisme av animalsk vev formasjon.

I tillegg til celledeling orientering, har denne metoden et potensial til å være en plattform for å teste forholdet mellom mekaniske signaler og celle skjebne. Tidligere studier rapporterte at mekaniske stikkordet styrer celle skjebne spesifikasjon. Human Mesenchymal stamceller differensiere til Nevron, adipocyte, skjelettmuskulatur celle, og osteoblast når kultivert i substrat med ulik stivhet17. Som svar på substrat stivhet, transcriptional regulatorer Ja-assosiert protein (YAP) og TAZ (transcriptional co-aktivator med PDZ-bindende motiv) vil translocate til kjernen, for å regulere celle skjebne spesifikasjon18. Metoden som presenteres i denne utredningen bør også være nyttig å teste rollen til mekaniske signaler på celle skjebne spesifikasjon, ved dyrking celle lang sikt i kontakt med selvklebende perler.

Denne metoden har begrensninger i recapitulating visse mekaniske signaler observert in vivo. I C. elegans, chitinous eggeskall og permeabilitet barriere tjene som en fysisk begrense. Selv om fjerning av eggeskall ikke påvirker normal utvikling, fjerning av både eggeskall og permeabilitet barriere resulterer i unormal mønster dannelse19. I fravær av eggeskall og permeabilitet barriere, celle form blir mer sfærisk, noe som tyder på at trykket mellom celler og celle-eggeskall spiller en avgjørende rolle i celle deformasjon og mønstre. Faktisk har celle-celle klemme krefter er foreslått å regulere celledeling orientering20. Uten å ha fysisk begrense og antatte trykk blant vev, forventer vi at denne metoden også ikke kan recapitulate in vivo celle kontaktområde. Som celle kontaktområdet er kjent for å påvirke notch signalering21, denne begrensningen må ytterligere vurderes når visse mekaniske eller kjemiske stikkordet ikke fungerer ved hjelp av denne in vitro-metoden.

Vi har så langt testet celledeling orientering av isolerte AB, P1, EMS, P2, ABa, ABp-celler (celler opp til 6 celle etapper) i våre hender10, men metoden kan brukes til senere utvikling så langt som enkelt celle kan isoleres. Nylig enkelt celle sekvensering studien har brukt pronase fordøyelse av ormen kroppen å isolere larvestadiet celle22. Derfor potensielt en kan bruke pronase behandling for å isolere senere stadium embryonale celler og larvestadiet celler.

I denne studien, viste vi eksempel på samspillet mellom mekanisk stikkordet og celledeling orientering, men celle-celle kommunikasjon er også mediert av kjemiske signaler som wnt23, hakk24, vedheft koblet reseptorer25 og så videre. Viktigere, perler forberedelse metoden som presenteres her kan par perlene med noen proteiner, og dermed tillater rekonstituering av kjemiske signaler. Tidligere studier har også brukt Sepharose perle26 og protein-en magnetisk perle27 belagt med wnt protein for å demonstrere wnt-avhengige utviklingsmessige prosesser. Men disse perlene er ikke kommersielt tilgjengelig i ulike størrelser sammenlignet med carboxylat modifiserte polystyren perler. Derfor, fremtid forskning kanne bruk det forevist metoden som plattform å test rollen av begge to kjemikalie og fysisk stikkordene inne flere tunable oppdragelse. Til sammen er denne metoden egnet for forskere, som studerer cellulære atferd og svar som følge av romlig celle kontakt mønstre og ønsker å eliminere andre cellulære signaler.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Forfatterne erklærer ingen interessekonflikt.

Acknowledgments

Vi takker James Priess og Bruce Bowerman for råd og gi C. elegans stammer, Don Moerman, Kota Mizumoto, og Life Sciences Institute Imaging Core Facility for deling av utstyr og reagenser, Aoi Hiroyasu, Lisa Fernando, min JEE Kim for vedlikehold av C. elegans og kritisk lesning av manuskriptet vårt. Vårt arbeid er støttet av naturvitenskap og engineering Research Council of Canada (NSERC), (RGPIN-2019-04442).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
1-(3-Dimethylaminopropyl)-3-ethylcarbodiimide hydrochloride Alfa Aesar AAA1080703 For the bead preparation
Aspirator Tube Assembly Drummond 21-180-13 For the blastomere isolation.
Caenorhabditis elegans strain: N2, wild-type Caenorhabditis Genetics Center N2 Strain used in this study
Caenorhabditis elegans strain: KSG5, genotype: zuIs45; itIs37 in house KSG5 Strain used in this study
Calibrated Mircopipets, 10 µL Drummond 21-180-13 For the blastomere isolation
Carboxylate-modified polystyrene beads (30 µm diameter) KISKER Biotech PPS-30.0COOHP For the bead preparation
CD Lipid Concentrate Life Technologies 11905031 For the blastomere isolation. Work in the tissue culture hood.
Clorox Clorox N. A. For the blastomere isolation. Open a new bottle when the hypochlorite treatment does not work well.
Coverslip holder In house N.A. For the blastomere isolation.
Dissecting microscope: Zeiss Stemi 508 with M stand. Source of light is built-in LED. Magnification of eye piece is 10X. Carl Zeiss Stemi 508 For the blastomere isolation.
Fetal Bovine Serum, Qualified One Shot, Canada origin Gibco A3160701 For the blastomere isolation. Work in the tissue culture hood.
General Use and Precision Glide Hypodermic Needles, 25 gauge BD 14-826AA For the blastomere isolation
Inulin Alfa Aesar AAA1842509 For the blastomere isolation
MEM Vitamin Solution (100x) Gibco 11120052 For the blastomere isolation.
MES (Fine White Crystals) Fisher BioReagents BP300-100 For the bead preparation
Multitest Slide 10 Well MP Biomedicals ICN6041805 For the blastomere isolation
PBS, Phosphate Buffered Saline, 10 x Powder Fisher BioReagents BP665-1 For the bead preparation
Penicillin-Streptomycin (10,000 U/mL) Gibco 15140148 For the blastomere isolation.
Polyvinylpyrrolidone Fisher BioReagents BP431-100 For the blastomere isolation
Potassium Chloride Bioshop POC888 For the blastomere isolation
Rhodamine Red-X, Succinimidyl Ester, 5-isomer Molecular Probes R6160 For the bead preparation
Schneider’s Drosophila Sterile Medium Gibco 21720024 For the blastomere isolation. Work in the tissue culture hood.
Sodium Chloride Bioshop SOD001 For the blastomere isolation
Sodium Hydroxide Solution, 10 N Fisher Chemical SS255-1 For the blastomere isolation
Spinning disk confocal microscope: Yokogawa CSU-X1, Zeiss Axiovert inverted scope, Quant EM 512 camera, 63X NA 1.4 Plan apochromat objective lens. System was controlled by Slidebook 6.0. Intelligent Imaging Innovation N.A. For live-imaging
Syringe Filters, PTFE, Non-Sterile Basix 13100115 For the blastomere isolation.
Tygon S3 Laboratory Tubing,, Formulation E-3603, Inner diameter 3.175 mm Saint Gobain Performance Plastics 89403-862 For the blastomere isolation.
Tygon S3 Laboratory Tubing,, Formulation E-3603, Inner diameter 6.35 mm Saint Gobain Performance Plastics 89403-854 For the blastomere isolation.

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Herman, M. Hermaphrodite cell-fate specification. WormBook. (2006).
  2. Rose, L., Gonczy, P. Polarity establishment, asymmetric division and segregation of fate determinants in early C. elegans embryos. WormBook. (2014).
  3. White, J. G., Southgate, E., Thomson, J. N., Brenner, S. The structure of the nervous system of the nematode Caenorhabditis elegans. Philosophical Transactions of the Royal Society of London. B, Biological Sciences. 314, (1165), 1 (1986).
  4. Mango, S. The C. elegans pharynx: a model for organogenesis. WormBook. (2007).
  5. McGhee, J. The C. elegans intestine. WormBook. (2007).
  6. Edgar, L. G., Goldstein, B. Culture and Manipulation of Embryonic Cells. Methods in Cell Biology. 107, 151-175 (2012).
  7. Stein, K. K. The C. elegans eggshell. WormBook. (2018).
  8. Quash, G., et al. The preparation of latex particles with covalently bound polyamines, IgG and measles agglutinins and their use in visual agglutination tests. Journal of Immunological Methods. 22, (1), 165-174 (1978).
  9. Miller, J. V., Cuatrecasas, P., Brad, T. E. Purification of tyrosine aminotransferase by affinity chromatography. Biochimica et Biophysica Acta (BBA) - Enzymology. 276, (2), 407-415 (1972).
  10. Sugioka, K., Bowerman, B. Combinatorial contact cues specify cell division orientation by directing cortical myosin flows. Developmental Cell. 46, (3), 257-270 (2018).
  11. Park, F. D., Priess, J. R. Establishment of POP-1 asymmetry in early C. elegans embryos. Development. 130, (15), 3547-3556 (2003).
  12. Schneider, C. A., Rasband, W. S., Eliceiri, K. W. NIH Image to ImageJ: 25 years of image analysis. Nature Methods. 9, (7), 671-675 (2012).
  13. Thevenaz, P., Ruttimann, U. E., Unser, M. A pyramid approach to subpixel registration based on intensity. IEEE Transactions on Image Processing. 7, (1), 27-41 (1998).
  14. Gillies, T. E., Cabernard, C. Cell Division Orientation in Animals. Current Biology. 21, (15), 599-609 (2011).
  15. Poulson, N. D., Lechler, T. Asymmetric cell divisions in the epidermis. International Review of Cell and Molecular Biology. 295, 199-232 (2012).
  16. Knoblich, J. A. Asymmetric cell division: recent developments and their implications for tumour biology. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 11, (12), 849-860 (2010).
  17. Engler, A. J., Sen, S., Sweeney, H. L., Discher, D. E. Matrix elasticity directs stem cell lineage specification. Cell. 126, (4), 677-689 (2006).
  18. Dupont, S., et al. Role of YAP/TAZ in mechanotransduction. Nature. 474, (7350), 179-183 (2011).
  19. Schierenberg, E., Junkersdorf, B. The role of eggshell and underlying vitelline membrane for normal pattern formation in the early C. elegans embryo. Roux's Archives of Developmental Biology. 202, (1), 10-16 (1992).
  20. Wang, Z., Wang, D., Li, H., Bao, Z. Cell neighbor determination in the metazoan embryo system. Proceedings of the 8th ACM International Conference on Bioinformatics, Computational Biology, and Health Informatics. 305-312 (2017).
  21. Shaya, O., et al. Cell-cell contact area affects notch signaling and notch-dependent patterning. Developmental Cell. 40, (5), 505-511 (2017).
  22. Cao, J., et al. Comprehensive single cell transcriptional profiling of a multicellular organism. Science. 357, (6352), 661-667 (2017).
  23. Goldstein, B., Takeshita, H., Mizumoto, K., Sawa, H. Wnt signals can function as positional cues in establishing cell polarity. Developmental Cell. 10, (3), 391-396 (2006).
  24. Priess, J. R. Notch signaling in the C. elegans embryo. WormBook. (2005).
  25. Müller, A., et al. Oriented cell division in the C. elegans embryo is coordinated by G-protein signaling dependent on the adhesion GPCR LAT-1. PLOS Genetics. 11, (10), 1005624 (2015).
  26. Marston, D. J., Roh, M., Mikels, A. J., Nusse, R., Goldstein, B. Wnt signaling during Caenorhabditis elegans embryonic development. Methods in Molecular Biology. 469, 103-111 (2008).
  27. Habib, S. J., et al. A localized Wnt signal orients asymmetric stem cell division in vitro. Science. 339, (6126), 1445-1448 (2013).
In vitro-rekonstituering av romlig celle kontakt mønstre med isolert <em>Caenorhabditis elegans</em> embryo Blastomeres og selvklebende polystyren perler
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Hsu, C. R., Xiong, R., Sugioka, K. In Vitro Reconstitution of Spatial Cell Contact Patterns with Isolated Caenorhabditis elegans Embryo Blastomeres and Adhesive Polystyrene Beads. J. Vis. Exp. (153), e60422, doi:10.3791/60422 (2019).More

Hsu, C. R., Xiong, R., Sugioka, K. In Vitro Reconstitution of Spatial Cell Contact Patterns with Isolated Caenorhabditis elegans Embryo Blastomeres and Adhesive Polystyrene Beads. J. Vis. Exp. (153), e60422, doi:10.3791/60422 (2019).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
simple hit counter